来源：A HiBiT/LgBiT-based single-cell platform enables high-throughput screening of extracellular rHuPH20 in Pichia pastoris（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
重组人透明质酸酶PH20（rHuPH20）在毕赤酵母中分泌水平偏低，传统筛选策略周期长、通量低。本研究构建了基于HiBiT/LgBiT互补系统的单细胞表面展示检测平台，以表面荧光作为分泌能力的替代指标，结合流式细胞术实现高通量筛选。通过对rHuPH20 N端构建随机突变文库，获得多个分泌显著增强的突变体，最高酶活约为野生型的2倍。进一步采用QTY理性设计优化C端膜结合区，最终整合N端突变与C端修饰的最佳变体（4−4）rHuPH20QTY酶活达0.098 U/mL，较野生型提高1.51倍。
研究背景
透明质酸酶（HAase）特异性催化透明质酸（HA）的水解，在食品、化妆品和制药工业中应用广泛。人源透明质酸酶可降解细胞外基质中的HA，增强组织通透性和药物扩散，是改善皮下药物吸收、辅助麻醉扩散、支持眼科手术及实现肿瘤药物递送的临床药物。与动物来源相比，重组人透明质酸酶（rHuPH20）来源安全可控，已被开发为注射制剂中的活性成分。rHuPH20已在植物、哺乳动物和酵母细胞中实现异源表达。毕赤酵母因其优异的真核翻译后修饰能力、高密度培养特性和成熟的分泌通路，被广泛用于工业规模重组蛋白生产。然而，rHuPH20在该系统中的分泌水平普遍较低。以往研究多依赖传统的"设计—构建—测试—学习"迭代策略，实验周期长、效率低，且缺乏能够在单细胞水平对高分泌突变体进行高通量定量筛选的检测平台。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
大肠杆菌JM109用于质粒构建，在LB培养基（5 g/L酵母提取物、10 g/L蛋白胨、5 g/L NaCl）中培养，根据需要添加硫酸卡那霉素或氨苄青霉素。大肠杆菌BL21(DE3)用于表达GFP-GS-LgBiT融合蛋白，重组菌在TB培养基（12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、4 mL/L甘油、2.3 g/L KH₂PO₄、12.5 g/L K₂HPO₄）中培养，用异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）（1 mM）于37°C诱导5小时。毕赤酵母GS115作为宿主细胞，在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中生长。酵母转化子在MD培养基（20 g/L葡萄糖、13.4 g/L YNB、0.4 mg/L生物素）上筛选。蛋白表达时，重组酵母接种于BMGY培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L胰蛋白胨、13.4 g/L YNB、20 g/L甘油、0.4 mg/L生物素、100 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0），于30°C、200 rpm条件下培养。
【数据】培养基：LB/TB/YPD/MD/BMGY；IPTG浓度：1 mM；诱导温度：37°C；诱导时间：5 h；培养温度：30°C；转速：200 rpm；磷酸钾缓冲液：100 mM，pH 6.0
2.2 质粒与菌株构建
菌株和质粒列于补充信息表S1和S2，克隆用引物列于补充信息表S3。密码子优化的LgBiT由上海迪奈诺合成（补充信息表S4）。GCW51（194 aa）和GCW61（47 aa）的DNA以毕赤酵母GS115基因组DNA为模板通过PCR获得。Sed1p（320 aa）和Pir1p（323 aa）的DNA以酿酒酵母BY4741基因组DNA为模板扩增。表达载体用质粒提取试剂盒提取。提取的质粒采用LiCl/ssDNA/PEG法（含1 μg质粒/DNA）转化入宿主细胞。所有转化子在筛选平板上于30°C培养3天。
【数据】GCW51：194 aa；GCW61：47 aa；Sed1p：320 aa；Pir1p：323 aa；质粒用量：1 μg；培养温度：30°C；培养时间：3天
2.3 突变文库的构建与筛选
为构建N端突变文库，以质粒phy47–7-rHuPH20-HiBiT-Sed1p-HIS4为模板，使用引物对FP-rHuPH20-F/R进行PCR反应，随后用Dpn I消化。之后使用TAKARA的Blunting Kinase Ligation（BKL）试剂盒进行连接。所得质粒文库转化入毕赤酵母GS115。酵母文库细胞培养过夜，然后以初始OD600为0.2转接至10 mL新鲜BMGY培养基。于30°C、200 rpm培养48小时后收集细胞，用无菌PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤两次。将重组酵母细胞浓度调整为OD600 = 1，加入粗制GFP-GS-LgBiT提取物至终浓度20 μg·mL⁻¹。混合物孵育15分钟，用PBS洗涤三次以去除未结合的探针。随后稀释至OD600为0.3，取2 mL细胞悬液进行流式分选。流式细胞术分析和细胞分选使用BD FACSAria III（BD Biosciences）进行。GFP荧光在488 nm激发，使用530 nm发射滤光片检测。数据使用FlowJo软件（v10.6，Tree Star Inc.）分析。采用顺序设门策略：在FSC-A对SSC-A散点图上设置形态门（P1）以排除细胞碎片和背景噪声，保留具有典型酵母散射特征的群体；使用FSC-A对FSC-H门（P2）选择单细胞以去除细胞聚集体；使用SSC-A对SSC-H（或SSC-W）施加第二个单细胞判别门（P3），进一步确保选择单个未聚集细胞。设门后，根据GFP荧光强度对细胞排序，收集荧光信号最高的前0.1%群体。分选细胞随后涂布于MD琼脂平板获得单克隆。将单克隆接种于48孔板（每孔1.5 mL BMGY液体培养基），在30°C、200 rpm条件下复筛72小时。使用酶标仪（BioTek）测量光密度（OD600）和吸光度（A540）。
【数据】初始OD600：0.2；培养体积：10 mL；培养温度：30°C；转速：200 rpm；培养时间：48 h；PBS缓冲液：pH 7.4；GFP-GS-LgBiT终浓度：20 μg·mL⁻¹；孵育时间：15 min；分选OD600：0.3；分选体积：2 mL；分选门：前0.1%；复筛时间：72 h；复筛转速：200 rpm
2.4 激光共聚焦显微镜
GFP-GS-LgBiT是一种融合探针，通过柔性连接肽GSlinker将GFP与NanoBiT系统的大片段LgBiT融合。该探针克隆至pET-20b载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。收集培养细胞，离心后重悬于PBS，超声裂解。离心（12,000 rpm，10 min，4°C）收集上清，获得粗制GFP-GS-LgBiT提取物。酵母细胞重悬于PBS缓冲液，与GFP-GS-LgBiT孵育。孵育后离心收集细胞，用PBS洗涤三次以去除未结合的GFP-GS-LgBiT。使用激光共聚焦扫描显微镜（Leica TCS SP5 II）在488 nm激发波长、63倍油浸物镜下观察酵母表面荧光。选择多个随机视野进行分析，获得的图像使用Fiji软件处理。
【数据】离心转速：12,000 rpm；离心时间：10 min；离心温度：4°C；激发波长：488 nm；物镜：63x油浸
2.5 rHuPH20酶活测定
采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定rHuPH20活性。测定步骤如下：200 μL反应体系（100 μL 1.25 mg/mL HA溶于100 mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0，加100 μL酶样品）于37°C孵育30分钟。随后加入200 μL DNS试剂，沸水浴煮沸6分钟。流水冷却至室温后，测定540 nm处吸光度。胞外酶活测定时，取离心后澄清培养上清100 μL作为酶样品。表面展示酶活测定时，酵母细胞离心收集，用PBS（pH 7.4）洗涤三次以去除残留胞外酶，重悬于PBS至OD600为1，取100 μL标准化细胞悬液作为反应体系中的酶样品。一个酶活单位（U）定义为在测定条件下每分钟释放相当于1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。
【数据】HA浓度：1.25 mg/mL；乙酸钠缓冲液：100 mM，pH 5.0；反应温度：37°C；反应时间：30 min；DNS试剂：200 μL；煮沸时间：6 min；检测波长：540 nm；细胞OD600：1
2.6 蛋白质序列分析与结构预测
信号肽和二级结构预测使用NovoPro（https://novopro.cn/tools/）；蛋白结构域通过SMART（https://smart.embl.de）注释；跨膜区由TMHMM 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）预测；理化性质由ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）计算；三级结构使用AlphaFold 3在线服务器（https://alphafoldserver.com/）建模。
【数据】预测工具：NovoPro、SMART、TMHMM 2.0、ProtParam、AlphaFold 3（原文未详述更多参数）
研究结果
3.1 单细胞水平检测蛋白分泌的高通量筛选系统
酵母表面展示是将外源蛋白锚定到细胞壁的有效策略。已有报道表明展示效率与蛋白分泌能力呈正相关。因此，建立一种通用且可定量的方法来评估细胞表面展示的靶蛋白量，将能够在单细胞水平快速、高通量地评估分泌相关潜力。NanoBiT系统由Promega公司开发，是NanoLuc荧光素酶的分裂版本，由11个氨基酸的小肽（HiBiT）和较大的亚基（LgBiT）组成。当HiBiT与LgBiT结合时，可重构出具有高发光效率和强结合亲和力的活性荧光素酶。凭借小标签尺寸、高灵敏度和可逆互补等优势，NanoBiT系统已被广泛用于监测活细胞中的蛋白—蛋白相互作用、受体—配体结合、膜蛋白表达及分泌蛋白定量。
我们利用高亲和力NanoBiT系统建立了一种通用且灵敏的筛选系统，可在单细胞水平对表面展示蛋白进行高通量定量（图1）。货物蛋白可与HiBiT标签及细胞壁锚定蛋白融合，展示在酵母表面，特异性结合外源GFP-GS-LgBiT探针。这种相互作用将GFP荧光定位到细胞表面，提供表面展示效率的定量读数。
GFP-GS-LgBiT融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，SDS-PAGE分析确认其可溶性表达（图2A）。将HiBiT标签与四种不同的细胞壁锚定蛋白——GCW51、GCW61、Sed1p和Pir1p——融合，评估表面展示效率。共聚焦显微镜显示，携带HiBiT-GS-GCW51、HiBiT-GS-GCW61或HiBiT-GS-Sed1p的大多数细胞表面出现强烈绿色荧光，而Pir1p-GS-HiBiT融合蛋白的信号则弱得多（图2B）。对照组未检测到荧光，证实了HiBiT-LgBiT互补的特异性。定量荧光分析表明，Sed1p、GCW51和GCW61的信号强度显著高于Pir1p，其中GCW51和Sed1p表现略优（图2C）。因此，GCW51、GCW61和Sed1p是酵母表面高效展示HiBiT的合适锚定蛋白。
为进一步验证该表面展示与检测系统的适用性，我们以rHuPH20作为模式分泌蛋白。在培养上清和细胞表面分别测定酶活，以评估不同锚定蛋白的融合性能。rHuPH20通过三种锚定蛋白均成功展示（图2D），在细胞相关组分和培养上清中均检测到酶活。这种分布可能反映了锚定蛋白之间锚定效率和蛋白加工过程的差异。在酵母表面展示系统中，GPI锚定蛋白（如Sed1p）经历翻译后加工并共价整合到细胞壁，锚定不完全或蛋白水解释放可导致上清中出现可溶性酶。此外，蛋白折叠和胞内运输的差异可能进一步影响表面保留与分泌之间的平衡。使用GFP-GS-LgBiT探针的荧光定量进一步发现，rHuPH20-GS-HiBiT-GS-Sed1p表现出最高的表面荧光（图2E）。酶活分析表明，rHuPH20-GS-HiBiT-GS-Sed1p分别比rHuPH20-GS-HiBiT-GS-GCW51和rHuPH20-GS-HiBiT-GS-GCW61高2.2%和8.5%。因此，Sed1p能够实现rHuPH20最高效的表面展示。
传统高通量筛选方法往往依赖蛋白质内在特性或split-GFP系统，受限于通用性差和折叠效率低。为克服这一问题，我们开发了利用NanoBiT系统高亲和力结合的筛选平台。超小HiBiT标签（11 aa）最大程度减少了对靶蛋白的结构干扰，其极强的结合力确保GFP-GS-LgBiT报告分子稳定招募到细胞表面。与需要缓慢且常不可逆重组的split-GFP不同，我们的设计通过活性GFP直接提供即时、稳健的荧光信号。
【数据】锚定蛋白：GCW51、GCW61、Sed1p、Pir1p；HiBiT标签：11 aa；rHuPH20-GS-HiBiT-GS-Sed1p表面荧光：最高；酶活提升：较GCW51高2.2%，较GCW61高8.5%
3.2 N端突变文库的构建
为提高rHuPH20的分泌效率，针对N端编码区构建了随机突变文库（图3）。该区域已知影响翻译效率和早期折叠，从而影响整体蛋白表达和分泌性能。预测的信号肽（aa 1–35）被去除（图4A），对下游N端编码区（10 aa）进行随机突变。突变文库通过反向PCR生成，使用含密码子中性碱基（N，A/T/G/C）的引物。所得质粒文库化学转化入毕赤酵母，获得约10⁵个克隆。由于酵母转化效率有限，该文库仅代表理论序列空间的一个子集。尽管如此，文库规模足以用于基于高通量筛选的功能富集。
在BMGY中诱导表达后，重组酵母文库与外源GFP-GS-LgBiT孵育，通过流式细胞术检测单细胞荧光强度（图4B）。FITC荧光跨越近三个数量级，大多数细胞位于低强度区域（Q3），少量高荧光亚群位于Q4，提示存在潜在分泌相关性能增强的变体。通过FACS从高荧光群体中分选300个单细胞，涂板获得单克隆，在48孔板中复筛。酶活测定显示部分突变体活性较高，最高活性（0.08 U/细胞密度OD600）约为野生型的2倍（图4C、D）。这些结果表明FACS–DNS工作流程能够有效富集功能性能改善的变体。
将14个富集突变体进行摇瓶发酵。如图4E所示，8个突变体表现出改善的酶活。其比活性较野生型（0.060 U/细胞密度OD600）至少提高14.7%。突变体N端突变区的平均CG含量从野生型的57%降至约39%。已有研究表明，较低的GC含量可削弱局部mRNA二级结构稳定性，有利于核糖体结合和翻译起始。进一步分析发现，突变体1–3、3–3、4–4和2–32在编码区内含有提前终止密码子（PTC），却仍保持高活性。在酵母中，翻译可在下游位点恢复或绕过终止，产生全长或截短蛋白，通常保留催化结构域并维持部分生物学活性。高活性突变体中芳香族、极性和带电荷氨基酸的比例显著增加，而非极性氨基酸比例明显下降。在突变体1–6和3–6中，N端区域观察到更多带正电荷的氨基酸（Arg、Asn），增加了局部亲水性，有利于折叠、内质网运输和SRP识别。在突变体4–7中，His和Trp的替换可能有助于质子转移和底物稳定。
【数据】突变文库规模：约10⁵克隆；信号肽：aa 1–35；突变区域：10 aa；最高酶活：0.08 U/细胞密度OD600（约为野生型2倍）；富集突变体：14个；改善突变体：8个；比活性提升：≥14.7%；野生型比活性：0.060 U/细胞密度OD600；GC含量：57%（野生型）→约39%（突变体）
讨论与解读
本研究建立了基于HiBiT/LgBiT互补系统的单细胞高通量筛选平台，以Sed1p为锚定蛋白，实现分泌相关性能的灵敏定量评估。从N端随机突变文库中筛选出8个胞外酶活显著增强的rHuPH20突变体，比活性较野生型至少提高14.7%。进一步应用QTY密码策略降低C端疏水性，酶活提升1.40倍，达到0.078 U/细胞密度OD600。整合N端突变与C端QTY修饰的rHuPH20变体表现出显著增强的表面相关信号和胞外酶活。最佳变体（4−4）rHuPH20QTY酶活较野生型提高1.51倍。该研究证明基于HiBiT/LgBiT的平台为在单细胞水平鉴定分泌增强修饰提供了实用有效的方法，表面荧光可作为分泌性能的替代指标，为酵母中困难重组蛋白的分泌优化提供了通用框架。
编译者解读：该研究的核心价值在于将NanoBiT分裂荧光素酶系统转化为表面展示的通用筛选工具——11个氨基酸的HiBiT标签几乎不干扰靶蛋白结构，而LgBiT-GFP探针提供即时光信号，巧妙绕过了split-GFP折叠慢、通用性差的瓶颈。N端随机突变与QTY疏水性优化的组合策略，分别从翻译起始动力学和膜区拓扑两个维度改善分泌，体现了"随机筛选+理性设计"的互补逻辑。值得注意的是，部分高活性突变体含提前终止密码子却仍保持功能，提示酵母翻译重编程可能成为分泌工程中一个未被充分挖掘的潜在方向。该方法有望推广至其他难分泌蛋白的菌株工程改造。
参考来源
Wu Y. A HiBiT/LgBiT-based single-cell platform enables high-throughput screening of extracellular rHuPH20 in Pichia pastoris. Biochemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.bej.2026.110229
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110229