来源：The combined effect of the gene copy number and chaperone overexpression on the recombinant bovine chymosin production in Pichia pastoris, with mutant ADH2 promoter（Protein Expression and Purification）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
凝乳酶是干酪工业中关键的牛奶凝固酶。本研究以毕赤酵母KM71为宿主，利用乙醇诱导型突变ADH2启动子表达牛凝乳酶基因，系统考察1–4拷贝基因剂量效应，并在此基础上共表达蛋白质二硫键异构酶（PDI）伴侣蛋白。结果显示，2拷贝凝乳酶与2拷贝PDI的组合（C2P2）在摇瓶水平达到8.2 IMCU/mL，5 L生物反应器放大后进一步提升至39 IMCU/mL，较单拷贝菌株提高约2倍。研究首次证明突变ADH2启动子与伴侣蛋白协同策略的有效性。
研究背景
凝乳酶（EC 3.4.23.4）是一种天冬氨酸蛋白酶，通过断裂κ-酪蛋白Phe105与Met106之间的肽键使牛奶凝固。该酶可从植物（菜蓟、无花果）、动物组织（小牛、山羊、羔羊）及微生物来源分离，但天然分离常伴随胃蛋白酶A、B及胃亚蛋白酶等杂蛋白酶。酸性蛋白酶虽广泛用于干酪生产，却存在蛋白水解活性高、稳定性差的问题，易导致过度产酸及非特异性酪蛋白水解产生不良风味。天然来源产量有限且质量不稳定。
重组DNA技术使凝乳酶可在酵母或细菌系统中生产，大幅降低对动物来源的依赖。重组凝乳酶的优势在于低蛋白水解活性带来的高效率，以及每批产品质量均一。此外，采用重组凝乳酶制作的干酪适合素食人群。本研究选用毕赤酵母KM71作为宿主，利用合成突变ADH2启动子驱动牛凝乳酶基因表达，并系统探究基因拷贝数与PDI伴侣蛋白过表达对重组凝乳酶分泌的协同效应。
研究方法
2.1 基因来源、菌株与质粒
密码子优化的牛（Bos taurus，NCBI Gen ID: 529,879）前凝乳酶基因以冻干形式由Genscript（美国新泽西州皮斯卡塔韦）提供，克隆于pUC57载体中。大肠杆菌DH5α菌株用于质粒制备。毕赤酵母KM71（his4 arg4 aox1::ARG4）菌株作为蛋白表达宿主。pAO815（Invitrogen™）、pADH2和pSNT5αA[26]质粒用于构建表达载体。PpPDI基因通过将pPIC3.5K-PDI载体[27]中的AOX1启动子替换为ADH2启动子，实现其在ADH2启动子控制下的表达。
【数据】宿主菌株：毕赤酵母KM71（his4 arg4 aox1::ARG4）；大肠杆菌菌株：DH5α；目的基因：牛前凝乳酶基因（NCBI Gen ID: 529,879）；载体：pAO815、pADH2、pSNT5αA、pPIC3.5K-PDI
2.2 培养基与试剂
大肠杆菌在含100 μg/mL氨苄青霉素或25 μg/mL zeocin的LB培养基中培养。毕赤酵母菌株分别在以下培养基中培养：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）、MD培养基（2%（v/v）葡萄糖、1.34% YNB（不含氨基酸）、4×10⁻⁵%生物素）、BMGY培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L YNB、4×10⁻⁵ g/L生物素、10%甘油、0.1 M磷酸盐缓冲液pH 6.0）和BMEY培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L YNB（1.34% YNB不含氨基酸）、4×10⁻⁵ g/L生物素、10%乙醇、0.1 M柠檬酸钠缓冲液pH 4）。生物反应器规模生产采用Basal Salt Medium（BSM）基础盐培养基（26.7 mL 85%磷酸、0.93 g硫酸钙、18.2 g硫酸钾、14.9 g七水硫酸镁、4.13 g氢氧化钾、40 g甘油）和PTM1痕量盐溶液（2 g/L CuSO₄·5H₂O、7 g/L ZnCl₂、0.08 g/L NaI、22.0 g/L FeSO₄·7H₂O、3.0 g/L MnSO₄·H₂O、0.2 g/L生物素、0.2 g/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.02 g/L硼酸、0.5 g/L CoCl₂、2 mL H₂SO₄），操作按Pichia表达试剂盒（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）方案执行。
【数据】氨苄青霉素浓度：100 μg/mL；zeocin浓度：25 μg/mL（大肠杆菌）；YPD组成：1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖；MD培养基：2%葡萄糖、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素；BMGY：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L YNB、4×10⁻⁵ g/L生物素、10%甘油、0.1 M磷酸盐缓冲液pH 6.0；BMEY：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L YNB、4×10⁻⁵ g/L生物素、10%乙醇、0.1 M柠檬酸钠缓冲液pH 4
2.3 质粒构建
为构建含1–4拷贝凝乳酶基因的质粒，采用pAO815表达载体进行体外克隆操作。AOX1启动子被替换为合成SNT5启动子——即ADH2启动子的突变版本[26]。pSNT5-CHY1通过将凝乳酶（BtCYM）基因克隆至多克隆位点的XhoI/NotI位点生成。凝乳酶基因的额外拷贝按照文献[28]所述策略生成（图1）。蛋白质二硫键异构酶（PDI）基因通过pADH2-PDI表达载体过表达（图2）。
图1 体外多聚化策略构建多拷贝凝乳酶载体示意图
图2 pADH2-PDI载体图谱
【数据】限制性酶切位点：XhoI/NotI（凝乳酶基因克隆）；启动子：合成SNT5突变ADH2启动子
2.4 毕赤酵母转化与克隆筛选
所有质粒用Kpn2I限制酶在HIS4片段内线性化，通过电穿孔法[29]转化至毕赤酵母KM71细胞。转化细胞在不含组氨酸的MD琼脂平板上生长以筛选阳性克隆。基因组DNA使用MasterPure酵母DNA纯化试剂盒从过夜培养物中提取，经BglII限制酶消化，在0.8%琼脂糖凝胶中分离。采用DIG-High Prime DNA标记与检测起始试剂盒II进行Southern Blot分析以确定基因拷贝数。HIS4基因作为探针并按试剂盒方案进行DIG标记。Southern Blot分析后筛选含1、2、3和4拷贝凝乳酶基因的克隆。C1、C2、C3、C4分别代表含1、2、3、4拷贝凝乳酶的克隆，P1、P2分别代表含1和2拷贝PDI的克隆。制备不同凝乳酶基因拷贝克隆的感受态细胞，作为PDI基因过表达的宿主。PDI基因在pADH2启动子控制下过表达。转化操作同上，克隆在含500 mg/mL zeocin的YPD培养基上筛选。通过Southern Blot实验确定所选含不同凝乳酶基因拷贝克隆的PDI拷贝数。
【数据】线性化酶：Kpn2I（HIS4片段内）；基因组消化酶：BglII；琼脂糖凝胶浓度：0.8%；Southern探针：DIG标记HIS4基因；zeocin筛选浓度：500 mg/mL
2.5 摇瓶实验与生化分析
所选克隆在3 mL YPD肉汤中培养，接种至BMGY培养基中于28°C、225 rpm振荡培养箱过夜培养。过夜生长后，离心收集细胞，转移至BMEY培养基中，以乙醇诱导蛋白表达。在96小时生产期间，每12小时向培养基中添加终浓度1%的乙醇。定期收集上清液样品。SDS-PAGE分析、牛奶凝固活性（IMCU/mL）测定和总蛋白分析按照前期研究[17]所述方法进行。
【数据】培养温度：28°C；转速：225 rpm；诱导时间：96 h；乙醇添加：每12 h添加终浓度1%
2.6 5 L生物反应器补料分批发酵
生物反应器规模蛋白生产采用5 L生物反应器（Sartorius Stedim BIOSTAT B）进行，操作参照Pichia发酵过程指南（Invitrogen™）。从各克隆的细胞库安瓿瓶中取一管，接种于100 mL BMGY（pH 6）培养基中，28°C振荡培养至OD₆₀₀nm值为10。随后将细胞接种至2 L BSM培养基中培养直至甘油消耗完毕，约需18–20小时。当DO（%）水平突然升高时，开始甘油补料分批阶段，通过甘油-乙醇混合补料使细胞适应乙醇。此步骤中，甘油在约3小时内从12.5 mL/L/h线性降至3 mL/L/h，同时向发酵培养基中两次加入纯乙醇（2 mL/L）使细胞适应乙醇。随后开始诱导阶段，以100%乙醇补料，搅拌速度900 rpm，空气供应1.5 vvm，DO饱和度20%，pH 4，温度24°C。乙醇补料速率在前48小时内从1.5 mL/L/h线性增加至9 mL/L/h，随后以9 mL/L/h恒定补料速率继续发酵至第90小时完成。必要时供应纯氧以维持DO水平在20%。发酵pH值通过26%（v/v）NH₄OH控制，同时NH₄OH也作为氮源。溶解氧浓度和pH值通过pH和DO探头（Hamilton，内华达州里诺）测量和控制。补料分批阶段收集上清液，进行SDS-PAGE分析，并测定生物量（WCW g/L）、总蛋白（g/L）和牛奶凝固活性（IMCU/mL）。
【数据】反应器体积：5 L；接种OD₆₀₀：10；BSM培养基体积：2 L；甘油消耗时间：18–20 h；甘油补料速率：12.5→3 mL/L/h（3 h线性降低）；乙醇适应添加：2 mL/L×2次；诱导条件：100%乙醇、900 rpm、1.5 vvm、20% DO、pH 4、24°C；乙醇补料速率：1.5→9 mL/L/h（前48 h线性增加），后恒定9 mL/L/h；总发酵时间：90 h；pH控制：26%（v/v）NH₄OH
2.7 统计分析
统计分析采用ANOVA进行，不同克隆酶产量的比较通过Duncan多重范围检验在95%置信区间（p < 0.05）下分析。
【数据】统计方法：ANOVA + Duncan多重范围检验；置信区间：95%（p < 0.05）
研究结果
本研究旨在探究凝乳酶基因拷贝数及PpPDI基因过表达对重组凝乳酶生产的影响。研究分两步设计：第一步是在合成ADH2启动子控制下克隆BtCYM基因，通过体外克隆技术构建含一、二、三、四拷贝凝乳酶的毕赤酵母KM71菌株；第二步是在上述多拷贝凝乳酶菌株中过表达PpPDI基因。
3.1 多拷贝凝乳酶克隆的构建与蛋白表达
毕赤酵母是非发酵型酵母，在高细胞密度发酵中通常不产生乙醇。然而前期研究发现，在有氧发酵条件下观察到少量乙醇产生[21,23]。这种有氧发酵中的意外乙醇产生促使研究者考察毕赤酵母中的乙醇代谢基因。研究确定ADH2基因负责乙醇利用，ADH900基因负责乙醇产生，并证明ADH2基因启动子是当前常用毕赤酵母启动子（如AOX1和GAP）的有前景的替代方案[25]。通过添加或删除调控位点进一步改造ADH2启动子，获得一系列合成ADH2启动子[26]。其中SNT5合成ADH2启动子在相同条件下、细胞生长速率和生物量水平相近时，木聚糖酶活性比天然启动子高2.2倍。因此，本研究使用新设计的合成突变ADH2启动子，在毕赤酵母KM71宿主菌株中进行凝乳酶的重组生产。
毕赤酵母KM71菌株来源于GS115，因AOX1基因缺失而被称为MutS（甲醇利用缓慢型）菌株。KM71菌株组氨酸缺陷，转化效率高，这一特性用于在极限培养基中筛选阳性克隆，有利于多拷贝克隆的筛选。在胞外蛋白生产中，KM71菌株因其天然蛋白分泌水平低于野生型毕赤酵母X33和甲醇利用型（Mut+）菌株而被优先选用[40,67]。此外，在本研究经验中，KM71菌株的转化效率普遍优于GS115菌株。因此，利用KM71菌株组氨酸缺陷的表型，在MD培养基中筛选含多拷贝凝乳酶的克隆。
含HIS4基因的pAO815载体作为构建1–4拷贝凝乳酶基因质粒的骨架。pAO815载体中的AOX1启动子区被替换为乙醇诱导型突变ADH2启动子，并在体外条件下进行连续克隆（图1）。将含1–4拷贝凝乳酶基因的各载体分别转化至毕赤酵母KM71感受态细胞，在MD琼脂平板上筛选。通过Southern Blot分析验证表达 cassette 在基因组中的整合，结果如图3所示。针对每个BtCYM基因拷贝数，分别选取C1、C2、C3和C4克隆。
图3 含1–4拷贝凝乳酶克隆的Southern Blot分析
对克隆进行摇瓶水平蛋白表达测试，1、2、3、4拷贝克隆的酶活性值分别为4、6.3、4.5和4 IMCU/mL（图4）。理论上，基因拷贝数增加，蛋白表达量应成比例增加。本研究中，C2克隆（2拷贝）的酶活性较1拷贝提高1.5倍。然而，C3和C4克隆拷贝数进一步增加反而降低了酶活性。这表明分泌可能存在瓶颈——表达的蛋白量超过分泌途径的处理能力，酶可能在胞内积累。但胞内未观察到酶活性（结果未显示）。由于缺乏抗凝乳酶抗体用于Western blot分析，无法检测胞内积累。胞内酶活性的缺失可能是前凝乳酶加工不完全所致，而完全加工是酶活性的必要条件[30]。
图4 所选克隆C1、C2、C3、C4的酶活性
类似结果在α-淀粉酶生产研究中也有报道：含1–4拷贝基因的克隆中，2拷贝α-淀粉酶克隆的胞外酶产量最高[31]。Zhou等[32]的研究中，含2拷贝脂肪酶基因的克隆检测到最大酶活性。其他研究也观察到额外1–2拷贝脂肪酶基因可提高酶产量[33–35]。与本研究相反，转谷氨酰胺酶胞外生产研究中，含1拷贝表达 cassette 的克隆活性比3拷贝高约2.5倍[36]。而近期一项研究中，L-天冬酰胺酶的最高产量由含3拷贝表达 cassette 的克隆获得[37]。结论是：增加基因拷贝数对每种蛋白的影响并不相同。每种蛋白都有其获得最大产量的最适基因拷贝数。因此，每种蛋白都应测试不同拷贝数以确定最大产量。基于上述原因，本研究下一阶段选择过表达PDI伴侣蛋白，以期克服低产量和分泌问题。
【数据】酶活性：1拷贝4 IMCU/mL、2拷贝6.3 IMCU/mL、3拷贝4.5 IMCU/mL、4拷贝4 IMCU/mL；2拷贝较1拷贝提高倍数：1.5倍；SNT5启动子相对天然启动子活性：2.2倍（木聚糖酶）
3.2 多拷贝凝乳酶克隆中PDI伴侣蛋白的过表达
真核细胞中蛋白质的合成与分泌是一个高度复杂的多阶段过程。在重组蛋白生产中，许多因素影响蛋白产量，包括启动子选择[38]、密码子使用[39]、宿主菌株选择[40]、基因拷贝数[41,42]、伴侣蛋白[43,44]和分泌信号[45–48]。蛋白合成始于转录，经过翻译，止于翻译后修饰（如糖基化和二硫键形成）。上述所有因素均影响重组蛋白生产，其中蛋白正确折叠和二硫键形成至关重要。伴侣蛋白负责二硫键的正确形成，与蛋白正确折叠密切相关，被称为辅助基因，如Kar2/Bip（结合免疫球蛋白蛋白）、ERO1（内质网氧化还原素1）和PDI（蛋白质二硫键异构酶）[49–52]。许多研究表明，过表达PDI、ERO1、HAC1伴侣蛋白可改善重组蛋白分泌，如脂肪酶[32]、腈水解酶[53]、人溶菌酶[54,55]和美洲钩虫分泌蛋白（Na-ASP1）[27]。
本研究旨在实现凝乳酶的高产量胞外分泌，因此构建多拷贝凝乳酶克隆以确定最适基因拷贝数。通过胞内过表达PDI伴侣蛋白来增加多拷贝克隆所产酶的分泌。pADH2-PDI表达载体（图2）通过将PDI基因克隆至天然ADH2启动子下游构建。随后将载体转化至电感受态多拷贝凝乳酶克隆，在含zeocin的YPD琼脂平板上筛选。通过Southern Blot分析检测PDI基因在多拷贝凝乳酶克隆中的整合（结果未显示）。基于Southern Blot分析选择阳性克隆，进行摇瓶水平蛋白表达实验。
凝乳酶产量随凝乳酶基因增加1拷贝从4 IMCU/mL提高至6.3 IMCU/mL。然而，进一步增加拷贝数至3拷贝（4.5 IMCU/mL）和4拷贝（3 IMCU/mL）时产量下降。PDI过表达后，各多拷贝凝乳酶克隆的酶活性均有所提高。PDI过表达使C1（1拷贝凝乳酶）的酶活性从4 IMCU/mL提高至5.5 IMCU/mL（C1P1），C2从6.3 IMCU/mL提高至7.1 IMCU/mL（C2P1），C3从4.5 IMCU/mL提高至5.2 IMCU/mL（C3P1），C4从3 IMCU/mL提高至4.1 IMCU/mL（C4P1）。当PDI拷贝数增加至2拷贝时，C2P2（2拷贝凝乳酶/2拷贝PDI）的酶活性进一步提高至8.2 IMCU/mL（图5）。
图5 PDI过表达的多拷贝凝乳酶克隆酶活性比较
在5 L生物反应器规模验证中，选取C2（2拷贝凝乳酶）和C2P2（2拷贝凝乳酶/2拷贝PDI）进行补料分批发酵。C2P2的最高酶活性达到39 IMCU/mL，而C2为18 IMCU/mL。C2P2的总蛋白和湿细胞重（WCW）也相应提高（图6）。SDS-PAGE时间过程分析显示，C2P2发酵上清液中凝乳酶条带随时间逐渐增强（图7）。通过添加2拷贝PDI基因，酶活性提高约2倍。
图6 C2与C2P2生物反应器规模生产的酶活性（a）、总蛋白（b）和湿细胞重（c）比较
图7 C2（a）和C2P2（b）发酵上清液的时间过程SDS-PAGE
图8 （原文未提供图注）
【数据】PDI过表达后酶活性：C1P1 5.5 IMCU/mL、C2P1 7.1 IMCU/mL、C3P1 5.2 IMCU/mL、C4P1 4.1 IMCU/mL；C2P2酶活性：8.2 IMCU/mL；生物反应器产量：C2P2 39 IMCU/mL、C2 18 IMCU/mL；PDI添加2拷贝提高倍数：约2倍
讨论与解读
本研究首次利用乙醇诱导型突变ADH2启动子，通过确定最适基因拷贝数并过表达PDI伴侣蛋白实现凝乳酶生产。最高产量出现在2拷贝凝乳酶基因的克隆中。然而，该产量尚不足以满足工业规模生产需求。未来需要通过测试不同伴侣蛋白（如BiP和ERO1）、更换宿主系统或采用不同分泌信号（如PIR、PHO和HSA）来设计新克隆，以进一步提高总产量。
【编译者解读】本研究展示了一个典型的"基因剂量-分泌瓶颈"问题解决路径：单纯增加拷贝数在2拷贝处即出现分泌饱和，而引入折叠相关伴侣蛋白PDI后，产量获得进一步提升。值得注意的是，C2P2在生物反应器中的产量（39 IMCU/mL）是摇瓶水平（8.2 IMCU/mL）的4.8倍，说明发酵工艺优化对释放菌株潜力至关重要。但研究中未检测胞内蛋白积累，缺乏Western blot验证，使得"分泌瓶颈"假说仍停留在推断层面。未来若能在蛋白层面直接追踪前体加工与折叠状态，将更精准指导工程改造方向。
参考来源
Ersöz F. The combined effect of the gene copy number and chaperone overexpression on the recombinant bovine chymosin production in Pichia pastoris, with mutant ADH2 promoter. Protein Expression and Purification, 2025. DOI: 10.1016/j.pep.2024.106636
DOI: 10.1016/j.pep.2024.106636