来源：Optimizing Pichia pastoris protein secretion: Role of N-linked glycosylation on the α-mating factor secretion signal leader（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
毕赤酵母（Pichia pastoris）是广泛应用的外源蛋白分泌表达宿主。本研究以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告蛋白，系统比较了来自Saccharomyces cerevisiae、Komagataella pastoris和Komagataella phaffii三种来源的α-交配因子（α-MF）分泌信号肽的分泌效率。结果显示，毕赤酵母自身来源的信号肽分泌效率远低于酿酒酵母来源。进一步研究发现，N-连接糖基化修饰是提升分泌效率的关键因素——引入糖基化位点可显著增强EGFP分泌，且该过程依赖分子伴侣钙联蛋白（calnexin）。该发现为优化毕赤酵母外源蛋白分泌提供了新策略。
研究背景
甲基营养型酵母毕赤酵母（P. pastoris）凭借高密度发酵能力、强且严格调控的启动子以及类哺乳动物分泌途径，已成为生产异源蛋白的常用宿主。1995年，P. pastoris被重新分类至新属Komagataella，随后该属进一步细分为多个种，原先的P. pastoris菌株被分别归类为K. pastoris和K. phaffii两个种。GS115和X-33菌株属于K. phaffii，而蛋白酶缺陷型SMD系列菌株（以SMD1168最为知名）则属于模式种K. pastoris。目前Komagataella属下共有六个种。本研究统一使用P. pastoris作为K. pastoris和K. phaffii菌株的同义指代。酿酒酵母来源的α-MF分泌信号肽是目前在毕赤酵母系统中应用最成功的分泌信号序列，但其分泌机制仍有诸多未解之处。
研究方法
2.1 菌株与培养基
重组质粒构建使用E. coli Top10′菌株进行遗传操作，异源蛋白表达在P. pastoris GS115菌株中进行。细菌培养使用Luria-Bertani（LB）液体培养基，含0.5%酵母提取物、1%蛋白胨、0.5% NaCl，并添加100 μg/ml氨苄青霉素。GS115菌株在YPD琼脂平板上培养，配方为1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1.5%琼脂。筛选以pPIC9K为骨架整合重组质粒的转化子时，使用MD琼脂平板（2%葡萄糖、1.34%酵母氮碱、4×10⁻⁵%生物素、1.5%琼脂）。报告蛋白表达阶段使用BMGY培养基（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、1.34% YNB、1%甘油、100 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0、4×10⁻⁵%生物素）和BMMY培养基（1%酵母提取物、2%胰蛋白胨、1.34% YNB、1%甲醇、100 mM磷酸钾缓冲液pH 6.0）。培养条件为：Top10′菌株37°C，GS115菌株或重组酵母菌株30°C，摇床搅拌速率220 rpm。
【数据】LB培养基：0.5%酵母提取物+1%蛋白胨+0.5%NaCl+100 μg/ml氨苄青霉素；YPD：1%酵母提取物+2%蛋白胨+2%葡萄糖+1.5%琼脂；MD：2%葡萄糖+1.34%YNB+4×10⁻⁵%生物素+1.5%琼脂；BMGY：1%酵母提取物+2%胰蛋白胨+1.34%YNB+1%甘油+100 mM磷酸钾pH 6.0+4×10⁻⁵%生物素；BMMY：1%酵母提取物+2%胰蛋白胨+1.34%YNB+1%甲醇+100 mM磷酸钾pH 6.0；培养温度：Top10′ 37°C，GS115 30°C；转速：220 rpm
2.2 携带不同α-MF分泌信号肽的报告载体构建
为评估来自S. cerevisiae、K. pastoris和K. phaffii的野生型及突变型α-MF分泌信号肽对EGFP分泌的影响，通过PCR从pEGFP-N1质粒扩增EGFP基因，克隆至pPIC9K表达载体的SnaB I和EcoR I位点之间，构建pPIC9K-EGFP质粒。野生型及突变型α-MF分泌信号肽的编码序列由基因合成公司（武汉金开瑞生物工程有限公司）合成，随后分别克隆至pPIC9K-EGFP的BamH I和SnaB I限制性酶切位点，分泌信号肽编码序列与EGFP基因保持同一阅读框。
【数据】载体：pPIC9K；酶切位点：SnaB I/EcoR I（EGFP插入）、BamH I/SnaB I（信号肽插入）；报告基因：EGFP（来源pEGFP-N1）
2.3 电穿孔转化
将质粒导入P. pastoris GS115采用此前描述的电穿孔方案。重组质粒经纯化后，用Pichia表达试剂盒手册推荐的限制性内切酶酶切线性化。取5–10 μg线性化质粒DNA进行电穿孔（1.5 kV，25 µF，200 Ω），使用Bio-Rad Pulser电穿孔仪。转化后细胞涂布于MD琼脂平板，29°C培养至菌落出现，约需2–3天。
【数据】线性化DNA用量：5–10 μg；电穿孔参数：1.5 kV、25 µF、200 Ω；培养温度：29°C；培养时间：2–3天
2.4 EGFP分泌实验
从MD平板挑取三个菌落，接种于BMGY培养基，29°C、220 rpm摇床培养至OD600达到2–4。随后室温、3000 × g离心5分钟收集细胞。细胞沉淀用含1%甲醇的BMMY培养基重悬，调整OD600至1.0。细胞在29°C培养72小时，每24小时补加1%甲醇维持诱导。由于蛋白分泌水平基于生物量确定，需重新测定各菌株OD600。为确保各菌株每毫升发酵液中细胞数一致，收集发酵上清液前根据OD600值用BMMY培养基调整发酵液。收集发酵上清液时，4°C、12,000 × g离心10分钟。发酵上清液和细胞沉淀随后保存于−80°C待进一步分析。
【数据】BMGY培养温度：29°C；转速：220 rpm；诱导前OD600：2–4；离心：3000 × g、室温、5分钟；BMMY重悬OD600：1.0；诱导时间：72小时；甲醇补加：每24小时1%；上清收集离心：4°C、12,000 × g、10分钟；保存温度：−80°C
2.5 胞内蛋白提取
取甲醇诱导72小时且条件一致的发酵液，计数后取含相同细胞数（1×10⁸个细胞）等体积发酵液，置于1.5 ml离心管中，3000 × g、4°C离心5分钟，弃上清。细胞沉淀用1 ml预冷无菌水重悬，10,000 × g、4°C离心5分钟，弃上清。向收集的细胞中加入250 μl裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.5% Triton X-100、5%甘油、1 mM PMSF），用移液器重悬细胞。随后加入0.2 g酸洗玻璃珠，冰上放置30秒。涡旋振荡30秒后置于冰上30秒，重复该过程10次。12,000 × g、4°C离心15分钟后，将裂解液转移至新的1.5 ml离心管。最后用BCA法对裂解液中总蛋白进行定量。
【数据】细胞数：1×10⁸个；裂解液成分：50 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.5% Triton X-100、5%甘油、1 mM PMSF；玻璃珠用量：0.2 g；涡旋/冰浴循环：30秒×10次；离心：12,000 × g、4°C、15分钟；定量方法：BCA法
2.6 Western blot分析
为评估EGFP分泌水平和胞内EGFP含量，进行Western blot分析。检测EGFP分泌时每孔上样10 μl上清液，检测胞内EGFP水平时每孔上样30 μg裂解液总蛋白，使用12% SDS-PAGE凝胶电泳分离。随后将凝胶中蛋白转移至Hybond-C硝酸纤维素膜（Amersham Bioscience），100 V转移2小时。检测EGFP时，使用抗EGFP抗体（Proteintech，中国，货号50430–2-AP）作为一抗，IRDye 800CW偶联的山羊抗兔二抗（LI-COR Biosciences，Lincoln, NE, USA；货号C60607–15）作为二抗。最后使用LICOR Odyssey系统（LI-COR，Nebraska，USA）检测并测量杂交信号。
【数据】上样量：上清10 μl/胞内总蛋白30 μg；凝胶：12% SDS-PAGE；转膜：100 V、2小时；一抗：抗EGFP抗体（Proteintech 50430–2-AP）；二抗：IRDye 800CW山羊抗兔（LI-COR C60607–15）
2.7 相对基因拷贝数分析
采用实时PCR分析整合株的相对基因拷贝数。使用真菌基因组DNA提取试剂盒（Bio Flux Corporation，Tokyo，Japan）从重组菌株中提取基因组DNA，提取的基因组DNA用于实时PCR检测。以ARG4作为内参。扩增EGFP的引物对为：正向5′ CACCATCTTCTTCAAGGACG 3′，反向5′ TGATATAGACGTTGTGGCTG 3′。扩增ARG4的引物对为：正向5′ TCCTCCGGTGGCAGTTCTT 3′，反向5′ TCCATTGACTCCCGTTTTGAG 3′。实时PCR扩增使用ABI 7300仪器（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）及SDS软件。反应体系含引物、基因组DNA和1× DyNAmo™ ColorFlash SYBR Green qPCR试剂盒（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）。PCR程序为：95°C初始变性10分钟；随后40个循环，95°C变性10秒、60°C退火30秒。最后进行熔解曲线分析以排除非特异性PCR产物。
【数据】内参基因：ARG4；EGFP引物：5′ CACCATCTTCTTCAAGGACG 3′/5′ TGATATAGACGTTGTGGCTG 3′；ARG4引物：5′ TCCTCCGGTGGCAGTTCTT 3′/5′ TCCATTGACTCCCGTTTTGAG 3′；PCR程序：95°C 10分钟；40×（95°C 10秒、60°C 30秒）；仪器：ABI 7300
2.8 实时qRT-PCR与RT-PCR
使用酵母总RNA提取试剂盒（Sangon Biotech，上海）从重组菌株中提取总RNA，总RNA用于实时qRT-PCR和RT-PCR检测。相对mRNA表达分析以Actin mRNA作为内参。扩增Actin mRNA的引物对为：正向5′-CTCCAATGAACCCAAAGTCCAAC-3′，反向5′-GACAAAACGGCCTGAATAGAAAC-3′；扩增EGFP mRNA的引物对为：正向5′ CACCATCTTCTTCAAGGACG 3′，反向5′ TGATATAGACGTTGTGGCTG 3′；定量HAC1 mRNA的引物对为：正向5′CTGAATATGACGACGAAGAA 3′，反向5′CTCCTGCTTGATAGATGTG 3′；定量KAR2 mRNA的引物对为：正向5′CCAGCCAACTGTGTTGATTCAA 3′，反向5′GGAGCTGGTGGAATACCAGTCA 3′；扩增HAC1u和HAC1i mRNA的引物对为：正向5′AGACAGCTAGCCCACTTCCACCTCG 3′，反向5′CATTAGCGGTAAATGGTGCTG 3′。实时PCR扩增使用ABI 7300仪器（Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA）。PCR程序为初始变性……（后续程序步骤原文未完整呈现）
【数据】内参基因：Actin mRNA；引物序列见上文；仪器：ABI 7300
研究结果
3.1 *K. pastoris*和*K. phaffii*来源的α-MF分泌信号肽介导的异源蛋白分泌效率低下
通过分析K. pastoris和K. phaffii基因组序列，发现两个基因组均含有α-MF基因。比较K. pastoris和K. phaffii的α-MF分泌信号肽序列，发现两者具有一定程度的相似性，约60%的氨基酸组成相同（图1A和图S1）。研究假设P. pastoris自身的α-MF分泌信号肽可能在该酵母中有效促进异源蛋白分泌。为验证该假设，以EGFP为报告蛋白，研究K. pastoris和K. phaffii来源α-MF分泌信号肽介导的EGFP分泌效率。出乎意料的是，K. pastoris和K. phaffii来源的α-MF分泌信号肽均无法在P. pastoris GS115菌株中有效介导EGFP分泌，其分泌效率显著低于S. cerevisiae来源的α-MF分泌信号肽（图1B和C）。
已知在异源基因转化过程中，多拷贝基因可能整合至酵母基因组。这些多拷贝基因可提高转录水平，进而影响胞内蛋白产量，最终影响胞外蛋白水平。为探究S. cerevisiae、K. pastoris和K. phaffii来源α-MF分泌信号肽分泌效率的差异是否归因于拷贝数变异和mRNA转录水平差异，检测了重组菌株中EGFP的拷贝数和mRNA转录水平。分析显示，S. cerevisiae、K. pastoris和K. phaffii在拷贝数和mRNA转录水平上均无显著差异（图1D和E）。上述结果表明，三种来源α-MF分泌信号肽介导EGFP蛋白分泌效率的差异主要归因于K. pastoris和K. phaffii来源α-MF分泌信号肽自身的低效性。
【数据】氨基酸序列同源性：约60%一致；EGFP分泌效率：K. pastoris和K. phaffii显著低于S. cerevisiae（原文未给出具体数值）；拷贝数差异：无显著差异；mRNA转录水平差异：无显著差异
3.2 α-MF分泌信号肽的N-连接糖基化增强EGFP分泌
通过比较K. pastoris、K. phaffii和S. cerevisiae的α-MF分泌信号序列，发现K. pastoris和K. phaffii的α-MF分泌信号肽上缺乏N-连接糖基化位点，而S. cerevisiae的α-MF分泌信号肽上含有三个N-连接糖基化位点（图1A）。已有研究表明，蛋白N-连接糖基化影响P. pastoris中的分泌效率。为研究N-连接糖基化是否影响α-MF分泌信号肽介导的异源蛋白分泌，将K. pastoris和K. phaffiiα-MF分泌信号肽第113位丝氨酸（S）突变为天冬酰胺（N）。第113位S残基突变为N后，与第114和115位氨基酸共同形成N-连接糖基化位点（NWT）。同时，为排除氨基酸突变本身对分泌的影响，还将第113位S残基突变为与N相似的氨基酸——谷氨酰胺（Q）（图2A）。
与野生型α-MF分泌信号肽相比，S113N突变体显著提高了报告蛋白EGFP的分泌效率，而S113Q突变体则未表现出该效果（图2B-I）。为证明S113N突变体确实发生了N-连接糖基化，删除了α-MF分泌信号肽与EGFP之间的Kex2和Ste13切割位点，使S113N突变α-MF分泌信号肽与EGFP融合表达（图S2A）。Western blot分析显示，融合蛋白在高分子量位置出现弥散条带。经内切糖苷酶H（Endo H）处理后，弥散条带消失，表明S113N突变体确实发生了糖基化（图S2B和C）。
S. cerevisiae的α-MF分泌信号肽含有三个N-连接糖基化位点，在通过分泌途径分泌过程中发生糖基化。利用定点突变将三个N-连接糖基化位点的N残基突变为谷氨酰胺（N23/57/67Q）（图3A）。与野生型相比，突变体在发酵液中的EGFP分泌量下降约50%（图3B和C）。随后，利用定点突变在S. cerevisiae的α-MF分泌信号肽中构建了缺失一个或两个N-连接糖基化位点的突变体（N23Q、N57Q、N67Q、N23/57Q、N23/67Q和N57/67Q）（图3A）。缺失一个或两个N-糖基化位点的突变体分泌EGFP的能力与野生型相比无显著差异（图3D）。
【数据】S113N突变：显著提高EGFP分泌效率；S113Q突变：无显著效果；N23/57/67Q三突变体：EGFP分泌下降约50%；单/双位点突变体（N23Q、N57Q、N67Q、N23/57Q、N23/67Q、N57/67Q）：与野生型无显著差异
3.3 N-连接糖基化促进货物蛋白从ER到高尔基体的转运并缓解未折叠蛋白反应
在α-MF分泌信号肽介导的分泌过程中，前肽与分泌蛋白通过位于高尔基体中的Kex2和Ste13蛋白酶切割分离。用抗EGFP抗体分析重组菌株胞内EGFP水平，结果显示，与携带野生型α-MF分泌信号肽的菌株相比，携带S113N分泌信号肽的菌株中EGFP蛋白的切割和分泌得到改善。上述结果表明，S113N分泌信号肽能更有效地将EGFP从ER引导至高尔基体。S113N突变菌株与野生型重组菌株之间，α-MF分泌信号前肽与EGFP的融合蛋白无差异（图4A和C）。
ER腔内未折叠蛋白的积累（即ER应激）会触发保守的UPR以缓解应激。UPR激活后，由UPR中央效应因子HAC1基因转录的HAC1u mRNA（“u”表示未诱导）中的内含子被ER膜上的跨膜激酶/核酸内切酶Ire1p剪接，产生HAC1i mRNA（“i”表示已诱导）。与空白对照菌株（GS115）和S113N分泌信号介导EGFP分泌的重组菌株相比，野生型α-MF分泌信号肽介导EGFP分泌的菌株中HAC1i mRNA水平显著升高（图4D和E），表明这些菌株的UPR水平更高。此外，HAC1及其下游调控基因KAR2的转录水平随发酵时间延长而升高（图4F和G）。
【数据】胞内EGFP检测上样量：40 μg蛋白/泳道；HAC1i mRNA水平：野生型信号肽菌株显著高于GS115空白对照和S113N菌株；HAC1和KAR2转录水平：随发酵时间延长而升高
3.4 钙联蛋白对N-连接糖基化分泌信号肽介导的EGFP分泌至关重要
哺乳动物ERGIC-53是一种L型凝集素，特异性识别高甘露糖型N-聚糖，在分泌途径中充当货物受体。作为一种I型跨膜蛋白，ERGIC-53在其腔面N端具有碳水化合物识别结构域（CRD）。该凝集素在内质网（ER）中结合糖蛋白，对介导糖蛋白从ER到高尔基体的转运至关重要。酵母Emp47p蛋白与哺乳动物ERGIC-53具有显著同源性，被认为参与某些糖蛋白的高效分泌。本研究构建了利用靶向缺失载体（图S3A）敲除EMP47的P. pastoris菌株，并在由S113N分泌信号肽驱动EGFP表达的重组菌株中成功实现了EMP47敲除（图S3B和C）。（后续结果内容原文节选未完整呈现）
【数据】EMP47敲除载体：靶向缺失载体（原文未详述具体序列）；敲除确认：基因组PCR（原文未详述具体条带大小）
讨论与解读
信号肽是将分泌蛋白从胞质分选至细胞外基质的关键组分。在发酵过程中高效生产重组蛋白，信号肽引导蛋白分泌的效率直接决定最终产量。S. cerevisiae来源的α-MF分泌信号在P. pastoris重组蛋白分泌中应用广泛且成效显著。值得注意的是，K. pastoris和K. phaffii基因组中虽均含有α-MF基因，但两者来源的α-MF分泌信号肽引导报告蛋白EGFP分泌的效率却显著低于S. cerevisiae来源的信号肽。这一发现凸显了分泌途径的复杂性和信号肽对P. pastoris分泌机制潜在的专一性。酵母α-MF分泌信号肽包含N端前肽和前导肽两部分，前者对新生蛋白转位入ER至关重要，后者被认为影响分泌效率。对S. cerevisiaeα-MF分泌信号前导肽的突变或切除可改变报告蛋白的分泌效率。
本研究证实N-连接糖基化是调控α-MF分泌信号肽效率的重要修饰——引入糖基化位点可显著增强EGFP分泌，且该过程依赖钙联蛋白的分子伴侣功能。N-连接糖基化通过加速糖蛋白的正确折叠、促进货物从ER到高尔基体的转运并缓解UPR，从而提升分泌效率。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，该研究的价值在于揭示了分泌信号肽上N-连接糖基化修饰对分泌效率的决定性作用——这为理性设计高效分泌信号肽提供了全新维度。传统信号肽优化多聚焦于氨基酸突变筛选，而本研究证明糖基化位点的引入即可显著改善分泌，策略简洁且效果明确。其局限在于EGFP作为模式蛋白分子量较小、结构简单，该策略对复杂治疗性蛋白（如抗体、凝血因子等）的适用性仍需验证。此外，钙联蛋白通路增强是否在所有培养条件下均有益，以及糖基化修饰对产物本身质量的影响，是后续产业化应用中需关注的问题。
参考来源
期刊：Journal of Biotechnology, 2024
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.04.008
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.04.008