来源：Molecular mechanism of GSH metabolism and autophagy in NAC-promoted recombinant human serum albumin and follicle stimulating hormone beta fusion protein secretion in Pichia pastoris（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
毕赤酵母表达系统是生产药用蛋白的优良平台。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）处理可提高重组蛋白产量，但其作用机制尚不明确。本研究揭示了NAC通过调节谷胱甘肽（GSH）代谢减少其消耗、提高总GSH水平及GSH-Px和GR酶活性来促进HSA-pFSHβ分泌，并发现自噬途径的抑制同样能提升重组蛋白产量。研究还阐明了Slt2磷酸化在NAC调控线粒体自噬与GSH代谢中的关键作用，为优化毕赤酵母蛋白表达系统提供了新视角。
研究背景
自噬是一种高度保守的细胞过程，通过膜运输将各种细胞内成分运送至溶酶体/液泡进行降解。在酵母中，自噬可分为巨自噬和微自噬，分别涉及膜延伸和膜内化。两种自噬形式均可通过靶向特定实体（如入侵病原体或受损细胞器）表现选择性，或通过非选择性地吞噬胞质成分表现非选择性。自噬在营养缺乏、生长因子缺失或活性氧（ROS）水平升高等多种应激条件下维持细胞稳态中发挥关键作用，可为分子合成提供材料，包括ATP生成。
含巯基化合物，包括谷胱甘肽（L-γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸，GSH）和非蛋白硫醇，是抵抗ROS的主要防御机制，通过保护功能蛋白的半胱氨酸残基免受氧化。当ROS产生超过巯基化合物的能力时，蛋白质和其他大分子会发生不可逆氧化。前期研究表明，NAC处理可增强重组蛋白产量，GSH和自噬参与NAC促进人血清白蛋白与猪促卵泡激素β（HSA-pFSHβ）融合蛋白产量的过程，但GSH与自噬之间的具体相互作用机制尚不清楚。
研究方法
2.1 菌株、质粒与试剂
毕赤酵母菌株GS115-pPIC9K-HSA-pFSHβ-pTom20-yEGFP3（在高效表达人血清白蛋白与促卵泡激素β融合蛋白（HSA-pFSHβ）的GS115菌株（命名为F株）基础上共表达Tom20-yEGFP3融合蛋白以检测线粒体自噬，命名为FTom20）由本实验室构建（Xu et al., 2023a; Luo et al., 2018）。大肠杆菌DH5α（擎科生物，中国北京）和来自Brigitte Gasser教授的质粒BB3cN-pGAP-23*-pPFK300-Cas9（Addgene #1000000136）（Gassler et al., 2019）用于克隆。FM™ 4-64（Cat#F34653）、限制性内切酶Bpi I和zeocin购自Thermo Fisher Scientific（中国上海）。总谷胱甘肽过氧化物酶检测试剂盒（NADPH法）和谷胱甘肽还原酶检测试剂盒（DTNB法）购自碧云天生物技术研究所（中国上海）。总谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（中国南京）。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC，Cat#A7250）由Sigma-Aldrich提供（St. Louis, MA, USA）。潮霉素B购自上海生工生物技术（中国上海）。本文所用所有化合物信息见表1。
【数据】菌株：GS115-pPIC9K-HSA-pFSHβ-pTom20-yEGFP3（FTom20）；试剂来源：Thermo Fisher Scientific、碧云天、南京建成、Sigma-Aldrich、上海生工；质粒：BB3cN-pGAP-23*-pPFK300-Cas9（Addgene #1000000136）
2.2 BB3cN-pGAP-23*-pPFK300-Cas9-∆Slt2表达质粒的构建
BB3cN-pGAP-23-pPFK300-Cas9-∆Slt2质粒（简称BB3cN-∆Slt2）采用Golden Gate组装法以Bpi I酶构建。SLT2基因编码序列中的前间隔序列邻近基序（PAM）序列从http://chopchop.cbu.uib.no/网站获取，选取PAM序列5′端20个核苷酸作为guide RNA。核酶-sgRNA-融合序列按Gassler所述方法组装（Gassler et al., 2019）。简言之，使用2×Super Pfx MasterMix（CWBIO，中国）进行重叠延伸PCR，使用结构引物（A-sgRNA-R、B-sgRNA-R、C-sgRNA-R、D-sgRNA-F）和sgRNA引物（1-SLT2-F和2-SLT2-F），见表2。PCR条件为98°C 30秒，随后40个循环的98°C 10秒、60°C 20秒、72°C 10秒，最后72°C延伸2分钟。250 bp PCR产物通过凝胶电泳确认。纯化产物和BB3cN-pGAP-23-pPFK300-Cas9均含有两个Bpi I位点。Golden Gate组装反应体系：2 nM PCR产物、9.1 ng BB3cN-pGAP-23*-pPFK300-Cas9质粒、0.5 U Bpi I、1 mM ATP、0.2 U T4连接酶（Takara，中国大连）和1×CutSmart Buffer（New England Biolabs，中国北京）。反应在PCR热循环仪中进行：40个循环的37°C 2分钟和16°C 2.5分钟，随后37°C 10分钟、55°C 30分钟和80°C 10分钟。重组质粒通过Sanger测序确认。
【数据】PCR条件：98°C 30s；40循环（98°C 10s、60°C 20s、72°C 10s）；72°C 2min；产物大小：250bp；Golden Gate体系：2nM PCR产物、9.1ng质粒、0.5U Bpi I、1mM ATP、0.2U T4连接酶；反应：40循环（37°C 2min、16°C 2.5min）、37°C 10min、55°C 30min、80°C 10min
2.3 FTom20-∆Slt2菌株的构建
将环状BB3cN-∆Slt2质粒通过电转化法转化至FTom20菌株，使用Bio-Rad Gene Pulser Xcell电转化仪，参照毕赤酵母表达系统手册（Thermo Fisher Scientific）并进行少量修改。简言之，将1-2 μg BB3cN-∆Slt2质粒与40 μl FTom20感受态细胞混合，冰浴20分钟，然后以2 kV、25 μF、200Ω参数电击，随后30°C孵育3小时。在YPD+50 μg/mL潮霉素B平板上的阳性转化子通过使用表2引物的直接PCR和测序确认。确认SLT2基因敲除后，FTom20-∆Slt2菌株在YPD上至少传代三次以丢失BB3cN-∆Slt2质粒。
【数据】电转化参数：2 kV、25 μF、200Ω；质粒用量：1-2 μg；感受态细胞：40 μl；冰浴：20min；孵育：30°C 3h；筛选：YPD+50 μg/mL潮霉素B；传代：YPD至少3次
2.4 重组蛋白生产
从YPD平板挑取FTom20和FTom20-∆Slt2菌株至3 mL BMGY培养基（1.34% YNB、1%酵母提取物、0.00004%生物素、2%蛋白胨、1%甘油、100 mM磷酸钾，pH 6.0）中，30°C、250 rpm振荡培养。培养48小时后，3000 ×g离心5分钟收集细胞，弃去BMGY培养基，然后重悬于1 mL BMMY培养基（将BMGY中的甘油替换为0.5%甲醇），添加或不添加5 mM NAC，在摇瓶中诱导HSA-pFSHβ生产72小时。HSA-pFSHβ蛋白的表达受醇氧化酶1（AOX1）启动子调控，该启动子为碳源依赖性启动子，可被甲醇强烈诱导，并被葡萄糖和甘油等替代碳源抑制（Liang et al., 2012）。因此，将培养基中的碳源从甘油切换为甲醇可激活AOX1启动子，从而诱导HSA-pFSHβ蛋白的表达。每24小时添加甲醇以维持培养物中0.5%的浓度。诱导72小时后，取5 μL培养上清和1×10⁹ cells/mL用于SDS-PAGE和Western blot分析HSA-pFSHβ产量。自噬检测时，每24小时收集细胞。每组设三个重复。
【数据】BMGY成分：1.34% YNB、1%酵母提取物、0.00004%生物素、2%蛋白胨、1%甘油、100mM磷酸钾、pH 6.0；培养：30°C、250rpm、48h；离心：3000×g、5min；BMMY诱导：0.5%甲醇、5mM NAC、72h；甲醇补充：每24h、0.5%；分析：5μL上清、1×10⁹ cells/mL
2.5 重组毕赤酵母胞内蛋白提取
胞内蛋白检测参照我们前期研究方法（Luo et al., 2022）。简言之，在诱导24、48和72小时时，通过12,000 ×g离心3分钟收集BMMY培养基中的细胞，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次。取1×10⁹个细胞，用500 μL裂解缓冲液（50 mM磷酸钠、1 mM EDTA、5%甘油（v/v）和1 mM苯甲基磺酰氟（PMSF，生工生物，中国上海））重悬，随后加入等体积酸洗玻璃珠。细胞总蛋白通过涡旋裂解10次，每次1分钟涡旋、1分钟冰上静置，然后16,000 ×g、4°C离心20分钟。上清中的总蛋白使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天，中国上海）测定，并通过SDS-PAGE和Western blot分析。
【数据】离心：12,000×g、3min；细胞量：1×10⁹；裂解缓冲液：50mM磷酸钠、1mM EDTA、5%甘油、1mM PMSF；裂解：涡旋10次（1min涡旋+1min冰浴）；离心：16,000×g、4°C、20min；检测：BCA试剂盒
2.6 分泌蛋白和酵母细胞裂解物的SDS-PAGE和免疫印迹分析
培养基或细胞中的总蛋白在4-12% SDS-PAGE梯度胶上进行电泳和Western blot分析。凝胶上的蛋白质用考马斯亮蓝R-250染色。Western blot中，FSHβ（C-12）单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology，Cat#sc-374452，1:500）或小鼠GFP单克隆抗体（ABclonal，Cat#AE012，1:5000）分别作为一抗检测HSA-pFSHβ和GFP融合蛋白。对于phospho-Slt2和Slt2，分别使用phospho-p44/42 MAPK（Erk1/2）（Thr202/Tyr204）抗体（cat#4370，Cell Signaling Technology，中国上海，1:2000）和Mpk1抗体（D-1）（cat#sc-374434，Santa Cruz Biotechnology, Inc）进行检测。二抗为辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG，购自中杉金桥生物技术（中国北京，稀释1:5000-1:10000）。凝胶和膜上的蛋白质在Clinx ChemiScope 6200仪器（勤翔，中国上海）上可视化并成像。Western blot分析数据代表三次重复。SDS-PAGE或Western blot蛋白条带的灰度分析使用ImageJ软件（http://imagej.nih.gov/ij/）进行。yEGFP3/Tom20-yEGFP3的比值以FTom20-24h进行归一化。
【数据】一抗：FSHβ（C-12）1:500、GFP 1:5000、phospho-p44/42 MAPK 1:2000；二抗稀释：1:5000-1:10000；凝胶：4-12% SDS-PAGE梯度胶；成像：Clinx ChemiScope 6200；归一化：FTom20-24h
2.7 谷胱甘肽及谷胱甘肽还原酶/过氧化物酶的测定
FTom20和FTom20-∆Slt2菌株在添加或不添加NAC处理24、48和72小时后的谷胱甘肽（GSH）含量（包括GSH和氧化型GSH（GSSG））按照制造商说明书（南京建成生物工程研究所，中国）进行检测。FTom20菌株在添加或不添加NAC处理后的谷胱甘肽还原酶（GR）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）酶活性按照碧云天生物技术（中国上海）提供的试剂盒（GR-DTNB法和GSH-Px-DTNB法）在微量滴定板中测定。数值以BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术，中国上海）检测的胞内总蛋白进行归一化。每组设三个重复。
【数据】检测时间点：24、48、72h；试剂盒：GR-DTNB法、GSH-Px-DTNB法；归一化：BCA总蛋白；重复：3次/组
2.8 荧光显微镜观察
FTom20和FTom20-ΔSlt2菌株的液泡膜按以下方法进行标记（原文节选至此，后续操作步骤原文未详述）。
【数据】菌株：FTom20、FTom20-ΔSlt2；染色方法：原文未详述
研究结果
3.1 抗氧化剂补充对HSA-pFSHβ产量的影响
前期研究表明，NAC处理而非维生素C处理可增强人血清白蛋白与白介素22融合蛋白的产量（Xu et al., 2023b）。为进一步确定其他抗氧化剂对重组蛋白生产的影响，用强抗氧化剂如褪黑素、α-生育酚和抗坏血酸处理高表达人血清白蛋白与促卵泡激素β融合蛋白（HSA-pFSHβ）的重组F菌株。与对照（Ctrl1）相比，用1-40 mM抗坏血酸、0.01-1 mM褪黑素和12-46 μM α-生育酚处理细胞时，培养基中HSA-pFSHβ的产量未增加（图1a和1b）。此外，80 mM抗坏血酸或70 μM α-生育酚对HSA-pFSHβ产量有害。基于SDS-PAGE蛋白条带的灰度分析，5、10和20 mM NAC补充分别使HSA-pFSHβ产量增加约5倍、4.5倍和3.5倍（图1c）。然而，当NAC浓度高于20 mM或低于5 mM时，HSA-pFSHβ的产量未增加（图S1）。高浓度NAC对HSA-pFSHβ的生产有害，因为在补充超过20 mM NAC的培养基中可检测到其他蛋白质（图1a，图S1a）。此外，研究结果表明，NAC增强重组蛋白表达的作用并非通过硫酸硫物种产生途径介导。证据是NAC未显著升高胱硫醚-β-合酶（CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）或3-巯基丙酮酸硫转移酶（MPST）的活性，这些是将半胱氨酸转化为硫化氢和硫酸硫物种的关键酶（图S2）。
为研究NAC对细胞的影响，我们检测了用5 mM NAC、20 mM抗坏血酸或23 μM α-生育酚处理细胞在72小时诱导期内的生物量变化趋势。出乎意料的是，与抗坏血酸或α-生育酚补充相比，NAC处理的生物量显著降低（图1d）。此外，摇瓶水平培养基中总蛋白产量达到45.73 ± 2.76 mg/g湿重。添加5 mM NAC后，该产量可翻倍至88.83 ± 4.67 mg/g湿重。简言之，5-20 mM NAC补充显著增加培养基中HSA-pFSHβ的产量。
【数据】NAC浓度：5、10、20mM；产量提升：约5倍、4.5倍、3.5倍；抗坏血酸：1-40mM无促进、80mM有害；褪黑素：0.01-1mM无促进；α-生育酚：12-46μM无促进、70μM有害；总蛋白产量：45.73±2.76 mg/g湿重；+5mM NAC：88.83±4.67 mg/g湿重；生物量：NAC处理显著低于抗坏血酸或α-生育酚处理
3.2 谷胱甘肽（GSH）代谢相关基因的转录水平
前期研究发现NAC及其异构体可增加胞内GSH水平并促进HSA-pFSHβ分泌，但其作用机制与GSH合成无关（Luo et al., 2021）。为进一步探讨GSH在NAC促进HSA-pFSHβ分泌中的作用，本实验评估了GSH代谢途径中相关基因的表达水平。如图2a和2b所示，NAC补充未改变参与GSH合成和降解的基因转录水平，这与我们前期的实验结果一致。此外，与GSH消耗相关的GTT1、GRX2、FLD和URE2-2基因经NAC处理后显著下调，表明NAC补充可减少GSH消耗（图2c、2d和2e）。
【数据】GSH合成/降解基因：转录水平未改变；GSH消耗基因（GTT1、GRX2、FLD、URE2-2）：显著下调
3.3 NAC对GSH-Px和GR活性及GSH/GSSG比值的影响
总GSH（tGSH）由GSH和氧化型GSH（GSSG）组成，二者通过GSH-Px和GR相互转化（图2e）。GSH-Px氧化GSH形成GSSG，而GR则催化相反反应。如图3a、3b和3c所示，NAC处理后24小时、48小时和72小时，胞内GSH-Px活性显著升高。此外，与24小时相比，诱导后48小时和72小时GSH-Px酶活性呈下降趋势（275和356对637，以蓝色虚线表示），而NAC处理显示出能在更长时间内维持GSH-Px酶活性的能力，这体现在底物处理10-15分钟后仍保持高活性（图3b和3c）。此外，NAC处理24小时和48小时导致胞内GSH-Px活性以及GR酶活性升高（图3d和3e）。然而，NAC处理72小时后，GR活性未表现出与GSH-Px活性相同的维持水平，反而显示低于对照组的活性（图3f）。对这一现象的一种可能解释是：NAC处理48小时后，观察到细胞内重组HSA-pFSHβ蛋白产量增加。这种蛋白产量的增加导致ROS显著积累，促使胞内GSH发挥其抗氧化特性。这种抗氧化效应通过GSH-Px酶活性升高和GR酶活性降低得以证明。此外，总GSH（T-GSH）水平随诱导时间延长呈下降趋势，这一发现与观察到的GSH-Px和GR活性随时间降低相关（图3g），而NAC处理可提高T-GSH含量。NAC对GSH与GSSG的比值影响可忽略不计，这一结果与谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和谷胱甘肽还原酶（GR）活性同步升高相一致（图3h）。
【数据】GSH-Px活性：24h、48h、72h均显著升高；48h/72h vs 24h：275/356 vs 637（蓝色虚线）；GR活性：24h、48h升高、72h低于对照；T-GSH：随诱导时间延长下降、NAC处理升高；GSH:GSSG比值：NAC影响可忽略
3.4 自噬在GSH代谢和HSA-pFSHβ生产中的作用
我们前期研究发现自噬在NAC促进HSA-pFSHβ分泌中发挥重要作用，但具体作用机制尚未探索。破坏自噬受体Atg30或Atg32直接影响重组HSA-pFSHβ的表达，使敲除菌株不适合研究自噬在NAC增强HSA-pFSHβ分泌中的作用。因此，本实验对自噬支架蛋白Atg1和Atg11进行了破坏。图4a所示结果表明，液泡周围的荧光信号来自Tom20-yEGFP3融合蛋白，在FTom20菌株的液泡内检测到yEGFP3蛋白信号。敲除ATG32基因导致yEGFP3信号在液泡外聚集，液泡内未观察到荧光信号。此外，敲除ATG1或ATG11基因导致大部分yEGFP3信号均匀分布在液泡外（图4a）。而且，与FTom20相比，在敲除ATG1或ATG11基因的FTom20-ΔAtg1和FTom20-ΔAtg11菌株细胞中观察到yEGFP3蛋白条带缺失（图4b）。这一发现表明Atg1或Atg11的破坏阻碍了线粒体自噬。与破坏线粒体自噬受体Atg32或过氧化物酶体自噬受体Atg30的影响不同，Atg1或Atg11的破坏不影响培养基中完整HSA-pFSHβ的生成（图4c和4d）。相反，FTom20-ΔAtg1和FTom20-ΔAtg11菌株中HSA截短片段和FSHβ显著增加（图4c和4d），而胞内HSA-pFSHβ产量显著降低（图4e和4f）。上述发现表明，Atg1或Atg11的破坏导致重组HSA-pFSHβ分泌增加，同时伴随培养基中HSA-pFSHβ的降解。然而，NAC对HSA-pFSHβ分泌的影响不受Atg1或Atg11破坏的影响（图4g），这与前期关于ATG30或ATG32基因敲除的研究一致（Xu et al., 2023a），表明自噬在毕赤酵母蛋白表达中发挥重要作用。此外，NAC在FTom20-ΔAtg1和FTom20-ΔAtg11菌株中未显著提高GSH含量，表明NAC对GSH含量的增加与自噬有关（图4h）。
【数据】荧光定位：FTom20液泡内检测到yEGFP3信号；ΔAtg32：信号在液泡外聚集；ΔAtg1/ΔAtg11：信号均匀分布在液泡外；yEGFP3条带：ΔAtg1/ΔAtg11菌株中缺失；HSA-pFSHβ：完整蛋白不受影响、截短片段和FSHβ显著增加；胞内HSA-pFSHβ：显著降低；NAC对GSH：ΔAtg1/ΔAtg11菌株中未显著升高
3.5 线粒体自噬（原文节选至此，后续结果内容未提供）
【数据】原文未详述
讨论与解读
谷胱甘肽是一种含巯基的三肽（γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸），在细胞内具有多种代谢功能，其关键功能之一是作为内源性抗氧化剂维持生物系统的氧化还原平衡。胞内总谷胱甘肽水平受细胞类型和外部因素（如活性氧和活性氮暴露）的影响。前期研究表明，补充NAC和其他巯基化合物可通过"补燃料"机制而非直接清除ROS来提升总GSH水平。本研究进一步证实NAC依赖巯基特性而非抗氧化机制来增加总GSH水平。此外，研究结果表明NAC显著减少GSH消耗而不影响GSH合成和降解，说明NAC作为巯基化合物直接替代GSH发挥作用，而非转化为半胱氨酸后作为前体增强GSH池。重组蛋白产量的增加导致ROS生成增多，进而影响二硫键形成。
编译者解读
本研究从机制层面厘清了NAC促进毕赤酵母重组蛋白分泌的双重路径：一方面通过巯基供体角色减少GSH消耗，另一方面通过抑制Slt2磷酸化调控线粒体自噬。方法上，利用Golden Gate组装快速构建基因敲除菌株、以yEGFP3荧光追踪线粒体自噬，手段简洁高效。值得关注的是，NAC处理后生物量下降但目标蛋白产量翻倍，提示碳流和能量被重新分配至产物合成——这对工业发酵工艺优化具有直接参考价值。局限性在于摇瓶水平数据与发酵罐放大之间仍有距离，且Atg1/Atg11敲除导致蛋白降解片段增多，其背后的蛋白酶机制尚待解析。
参考来源
Luo G. Molecular mechanism of GSH metabolism and autophagy in NAC-promoted recombinant human serum albumin and follicle stimulating hormone beta fusion protein secretion in Pichia pastoris. Journal of Biotechnology, 2025.
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.12.006
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2024.12.006