分裂T7开关介导的无细胞蛋白合成系统用于靶核酸检测

来源：Split T7 switch-mediated cell-free protein synthesis system for detecting target nucleic acids（Biosensors and Bioelectronics）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

无细胞蛋白合成（CFPS）系统在核酸检测领域展现出巨大潜力，但传统toehold开关策略存在泄漏翻译、检测限高（约30 nM）及序列筛选繁琐等瓶颈。本研究开发了一种基于分裂T7启动子的新型CFPS检测系统，通过靶核酸诱导三向连接（TWJ）结构形成，仅在靶标存在时启动转录-翻译。该系统检测限低至10 pM，较传统方法提升千倍以上，并兼容荧光与比色两种输出模式，且通过分裂报告蛋白自互补简化了探针制备流程。

研究背景

无细胞蛋白合成系统包含蛋白质合成所需的全部底物、生物分子及分子机器，无需活细胞即可生产目标蛋白。CFPS最初用于解析氨基酸掺入蛋白质的机制及遗传密码破译，近年应用范围显著扩展：已证明在污水、人尿液和血液等真实样本中有效；系统可冻干运输，在37°C保持活性超过一年，支持分布式生物制造。基于这些特性，CFPS已被用于蛋白质表达、代谢工程和疗法开发，并应用于生物传感器构建。

在CFPS生物传感策略中，大多数系统依赖toehold开关，存在三个关键局限：（i）无靶核酸时泄漏翻译导致脱靶信号；（ii）无预扩增时检测限约30 nM，灵敏度不足；（iii）靶核酸序列约束导致筛选流程费力。为克服上述问题，本研究开发了新型分裂T7开关介导的CFPS系统。

研究方法

2.1 试剂与材料

本研究所用寡核苷酸（表S1–S4）由Integrated DNA Technologies（美国伊利诺伊州斯科基）和Bionics（韩国首尔）合成。所有寡核苷酸序列均使用NUPACK分析精心优化，以防止非预期相互作用并保持精确性。MgCl₂购自Daehyung Chemicals（韩国京畿道）；1 M Tris-HCl和PEG 4000购自Biosesang（韩国京畿道）；T4 DNA连接酶、T7 RNA聚合酶反应缓冲液（40 mM Tris-HCl（pH 7.9）、10 mM MgCl₂、10 mM DTT、2 mM亚精胺）、RNase抑制剂和PCR预混液购自Enzynomics（韩国大田）；i-Taq™ DNA聚合酶购自iNtRON Biotechnology（韩国京畿道）；NucleoSpin凝胶和PCR纯化试剂盒购自MACHEREY-NAGEL（德国迪伦）；HiScribe T7 High Yield RNA合成试剂盒、Monarch RNA纯化试剂盒、DNase 1和PURExpress体外蛋白合成试剂盒购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州）；PUREfrex 1.0试剂盒购自GeneFrontier Corporation（日本千叶）。所有实验使用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水或UltraPure DNase-/RNase-free蒸馏水，购自Bioneer（韩国大田）。所有化学品均为分析纯级，未经进一步纯化直接使用。

【数据】MgCl₂来源：Daehyung Chemicals；Tris-HCl浓度：1 M；T7 RNA聚合酶反应缓冲液组分：40 mM Tris-HCl（pH 7.9）、10 mM MgCl₂、10 mM DTT、2 mM亚精胺；水：DEPC处理水或UltraPure DNase-/RNase-free蒸馏水

2.2 分裂T7开关无细胞表达合成（CFPS）反应

使用两种市售CFPS试剂盒（PURExpress体外蛋白合成试剂盒和PUREfrex 1.0），按制造商说明操作。简要而言，PURExpress体外蛋白合成试剂盒的反应溶液含40%溶液A、30%溶液B、20 U RNase抑制剂和DNase-free蒸馏水，最终反应体积25 μL。PUREfrex 1.0试剂盒的反应溶液含50%溶液I、5%溶液II、5%溶液III、20 U RNase抑制剂和DNase-free蒸馏水，最终反应体积20 μL。向反应溶液中加入SP1（75 ng，含全长绿色荧光蛋白（GFP）报告蛋白序列，图S4）及与SP1等摩尔浓度的SP2。37°C孵育2小时后，将反应溶液转移至384黑色孔板，使用微孔板读数器（SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader，Molecular Devices，美国加利福尼亚州圣何塞）在25°C测量全长GFP报告蛋白的荧光信号，激发波长470 nm，发射波长510 nm。

对于分裂GFP（GFP1/10和GFP11）自互补的分裂T7开关，SP1设计为含GFP11结构域序列，并向反应溶液中加入100 ng GFP1/10表达盒。所有其他反应程序和条件与上述相同。

对于分裂β-半乳糖苷酶（α亚基和ω亚基）自互补的分裂T7开关，SP1设计为含β-半乳糖苷酶α亚基序列，反应溶液中额外加入55 nM β-半乳糖苷酶ω片段（Molecular Depot）和0.75 mM氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷（Sigma）。37°C孵育1小时后，用DNase-/RNase-free蒸馏水将反应溶液稀释至60 μL，转移至96孔透明板。使用微孔板读数器测量570 nm处吸光度。如有需要，使用iPhone 11相机拍摄图像。

【数据】PURExpress反应体积：25 μL（40%溶液A、30%溶液B、20 U RNase抑制剂）；PUREfrex反应体积：20 μL（50%溶液I、5%溶液II、5%溶液III、20 U RNase抑制剂）；SP1用量：75 ng；孵育：37°C、2 h；荧光测量：激发470 nm、发射510 nm、25°C；GFP1/10表达盒：100 ng；β-半乳糖苷酶ω片段：55 nM；氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷：0.75 mM；比色孵育：37°C、1 h；稀释体积：60 μL；吸光度：570 nm

2.3 体外转录

靶RNA通过体外转录生成。首先使用各质粒（Integrated DNA Technologies）及含T7启动子序列的相应引物（表S4）通过PCR生成靶RNA区域对应DNA序列。随后制备转录反应溶液，含1 μg PCR产物、1.5 μL 10×反应缓冲液（终浓度0.75×）、1.5 μL rNTP（各7.5 mM）、1.5 μL T7 RNA聚合酶混合液和14.5 μL DEPC处理水。转录反应在37°C孵育16小时。PCR产物经DNase I消化后，使用Monarch RNA纯化试剂盒纯化RNA转录产物，使用Nanodrop（SpectraMax iD5 Multi-Mode Microplate Reader）测量260 nm波长处吸光度进行浓度定量，使用前储存于−80°C。

【数据】PCR产物用量：1 μg；10×反应缓冲液：1.5 μL（终浓度0.75×）；rNTP：1.5 μL（各7.5 mM）；T7 RNA聚合酶混合液：1.5 μL；DEPC处理水：14.5 μL；转录孵育：37°C、16 h；定量：260 nm吸光度；储存：−80°C

2.4 统计分析

所有统计分析使用GraphPad Prism软件（v8.0；GraphPad Software, Inc.，美国加利福尼亚州拉荷亚）进行。数据以平均值±标准差表示。检测限（LOD）通过统计分析计算。具体而言，与NTC在统计学上可区分的最低浓度定义为LOD。两组间统计学差异使用双尾Student's t检验评估。所有实验重复两次。P值低于0.001以三个星号表示，低于0.01以两个星号表示，低于0.05以一个星号表示。

【数据】统计软件：GraphPad Prism v8.0；数据表示：平均值±标准差；LOD定义：与NTC统计学可区分的最低浓度；检验方法：双尾Student's t检验；实验重复：两次；显著性水平：P<0.05，P<0.01，P<0.001

研究结果

3.1 分裂T7开关CFPS系统的工作原理

如图1所示，分裂T7开关CFPS系统利用两种不同的DNA探针（分裂探针1和2；SP1和SP2），设计为仅在靶核酸存在时通过CFPS系统启动转录（TX）和翻译（TL）。第一探针SP1包含四个关键区域：（i）与靶核酸一半结合的互补序列（灰色显示）；（ii）T7启动子序列（橙色）；（iii）核糖体结合位点（蓝色）；及（iv）报告蛋白序列（绿色）。为确保CFPS系统的准确性、抑制非预期的分子间和分子内相互作用，SP1的T7启动子序列与T7启动子的部分序列（16个核苷酸，橙色）杂交，且T7启动子之后的区域设计为双链。第二探针SP2包含T7启动子的部分序列（四个核苷酸，橙色）及能与靶核酸另一半结合的序列（灰色显示）。考虑到所提分裂T7开关系统的反应温度（37°C），SP1与SP2之间重叠区的熔解温度设计为12°C。SP1和SP2仅在靶核酸存在时结合形成TWJ结构，从而完成带切口位点的双链T7启动子。这进而通过CFPS系统中T7 RNA聚合酶和核糖体的作用分别启动TX和TL，从翻译的报告蛋白产生强信号。重要的是，通过改变报告蛋白类型（如GFP或lacZ）可获得不同信号读数（荧光或比色）；所有过程均在等温条件（37°C）下于单管中完成。

【数据】SP1区域数：4个（靶标结合序列、T7启动子序列、核糖体结合位点、报告蛋白序列）；SP1 T7启动子杂交长度：16 nt；SP2 T7启动子部分序列：4 nt；重叠区熔解温度：12°C；反应温度：37°C

3.2 分裂T7开关CFPS系统的检测可行性

首先，我们使用全长GFP报告蛋白比较了具有切口位点、分为4:16片段的分裂T7启动子与双链T7启动子（完整T7）的TX–TL效率（Pardee et al., 2016）。如图S1(A)所示，带切口位点的分裂T7启动子产生的荧光信号与完整T7启动子相当。相反，作为阴性对照的部分双链分裂T7启动子产生可忽略的荧光信号。这些结果清楚证实，即使在CFPS系统中，分裂T7启动子的功能与完整T7启动子一样有效，可用于检测靶核酸。

此外，我们评估了T7启动子后间隔对分裂T7开关CFPS系统功能的影响。图S1(B)结果显示，在四种不同构型中——包括连续结构（T7启动子后无间隔）、含切口位点结构（nick）、T7启动子后含5-mer或10-mer间隔的结构（5-mer和10-mer）——T7启动子后含5-mer间隔的结构产生最高荧光信号，因此用于后续实验。

随后，我们采用与多种高危型癌症相关的人乳头瘤病毒（HPV）作为模型靶标，设计针对HPV16 L1基因特异性的SP1和SP2，以验证分裂T7开关CFPS系统的检测可行性。由于靶位点影响转录效率（Han et al., 2023；Shin et al., 2023），与其他高危型HPV（包括18、31、33、45和52型）的L1基因比对后，选择了两个HPV16特异性独特序列（位点1和2）。如图S2所示，两个位点之间未观察到显著差异；因此我们选择位点2中的靶序列，其GFP报告蛋白荧光强度的倍数变化高于位点1。此外，SP1浓度优化为75 ng，通过最小化非特异性背景信号产生更高的GFP报告蛋白荧光强度倍数变化（图S3）。

随后我们在优化条件下逐一排除分裂T7开关CFPS系统的各组分后测量荧光光谱。图2(A)结果显示，当靶核酸和组成分裂T7开关的两种DNA探针（SP1和SP2）缺失时，观察到可忽略的荧光信号，这可能是因为带切口位点的双链T7启动子未形成，因此TX–TL过程未启动。重要的是，仅当所有组分都存在时才产生显著高荧光信号，强调各组分在靶标检测中不可或缺的作用。

随后，我们通过凝胶电泳分析确认了靶核酸存在时TWJ结构的形成。如图2(B)所示，在无靶标时SP1和SP2不结合产生TWJ结构（d），而当SP1、SP2和靶标同时存在时成功形成TWJ结构（g），表现为出现电泳迁移率最高的新凝胶条带，且SP1、SP2和靶标对应凝胶条带消失。

【数据】分裂T7启动子分割比例：4:16；最佳间隔：5-mer；SP1最佳用量：75 ng；靶标：HPV16 L1基因；比对的HPV类型：18、31、33、45、52型；TWJ形成条件：SP1+SP2+靶标同时存在

3.3 分裂T7开关CFPS系统的检测灵敏度与特异性

我们评估了分裂T7开关CFPS系统的检测灵敏度。如图3(A)所示，GFP报告蛋白的荧光信号随HPV16靶DNA浓度增加而升高。值得注意的是，所提系统检测到浓度低至50 pM的HPV16靶DNA，与无靶DNA对照形成鲜明对比（*P < 0.05，Student's t检验）。分裂T7开关CFPS系统获得的检测灵敏度较以往toehold开关系统显著提高——后者无预扩增时的检测浓度范围为数十至数百纳摩尔（Pardee et al., 2016）。因此，所提系统聚焦于转录水平调控，比以往依赖toehold介导链置换调控翻译过程的CFPS系统具有更高精度。

此外，我们验证了分裂T7开关CFPS系统的特异性。由于特异性DNA探针（SP1和SP2）通过与其他HPV类型序列比对设计（图S2），仅在HPV16 DNA存在时观察到显著增强的荧光信号，而其他HPV类型以比HPV16高10倍的浓度存在时产生的荧光信号与无靶标对照（NTC）相当，确认了高特异性（图3(B)）。

【数据】HPV16靶DNA最低检测浓度：50 pM（*P<0.05）；以往toehold系统检测范围：数十至数百nM（无预扩增）；其他HPV类型浓度：HPV16的10倍；特异性验证：其他HPV类型信号与NTC相当

3.4 分裂报告蛋白自互补的引入

当使用全长GFP报告蛋白时，含靶标识别区和核糖体结合位点的较短序列（称为退火探针1和2；A.N.1和A.N.2）通过化学合成，并与编码报告蛋白（如全长GFP；720 bp）的PCR扩增产物连接（图S4）。虽然该过程可以产生足够的SP1，但涉及连接和纯化等复杂程序，可能降低SP1的整体产率。因此，为简化分裂T7开关系统的制备过程并确保高效率，我们提出一种利用分裂报告蛋白自互补的简便方法。如图4(A)所述，GFP报告蛋白的全长序列在第十和第十一β链之间分为两部分：GFP1/10和GFP11。GFP1/10片段本身无荧光，仅当GFP11片段存在时才变得高度荧光。

【数据】全长GFP长度：720 bp；分裂位点：第十和第十一β链之间；分裂产物：GFP1/10和GFP11；GFP1/10单独状态：无荧光

讨论与解读

分裂T7开关代表了CFPS在分子诊断应用中的新途径。该策略聚焦于CFPS系统中转录阶段的调控，与以往toehold开关CFPS系统采用的策略完全不同。系统的关键组件是靶核酸诱导TWJ结构形成，从而完成带切口位点的双链分裂T7启动子。因此，通过CFPS系统发生有效的TX-TL过程，利用不同报告蛋白产生荧光和比色信号。此外，通过采用报告蛋白（分裂GFP和β-半乳糖苷酶）的自互补，简化了两种DNA探针（SP1和SP2）的制备程序。该系统还可通过简单替换两种DNA探针中的靶标特异性DNA序列来检测多种靶核酸（HPV16、HPV18和SARS-CoV-2），证明其广泛适用性。尽管结果令人鼓舞，仍需通过采用非对称重组酶聚合酶扩增（RPA）或RPA-转录反应等预扩增方法（可产生单链DNA作为扩增产物）来进一步改进系统。此外，未来研究需通过分析真实人体样本获得真实诊断特征。

编译者解读

本研究巧妙地将分裂T7启动子与三向连接结构结合，把检测逻辑从翻译层面前移至转录层面，从根本上规避了toehold开关的泄漏翻译问题。检测限从30 nM降至10 pM，千倍提升令人印象深刻。从合成生物学应用角度看，分裂报告蛋白自互补策略显著简化了探针制备流程，提高了系统可及性；一管式等温操作也为现场快检提供了可能。局限在于目前仍以合成缓冲液体系验证为主，真实临床样本中的基质效应和稳定性尚待考察，未来结合RPA等预扩增策略有望进一步推向实际诊断应用。

参考来源

Kim D. Split T7 switch-mediated cell-free protein synthesis system for detecting target nucleic acids. Biosensors and Bioelectronics, 2024. DOI: 10.1016/j.bios.2024.116517

DOI: 10.1016/j.bios.2024.116517