来源：Expanding the palette of Streptomyces-based cell-free protein synthesis systems with enhanced yields（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
无细胞蛋白合成（CFPS）是合成生物学的重要工具，但链霉菌来源的CFPS系统产量长期偏低。本研究通过增加细胞提取物浓度和优化裂解方式（超声替代高压匀浆），将模式蛋白EGFP的批量合成产量从约50 μg/mL提升至116.9±8.2 μg/mL，提升超过2倍，并将该方法成功扩展至其他六种链霉菌菌株。该工作为高GC含量天然产物生物合成基因的体外表达提供了更高效的平台。
研究背景
链霉菌属是一类革兰氏阳性丝状细菌，基因组GC含量高（>70%），产生的已知微生物源抗生素超过50%，同时还合成多种具有生物活性的次级代谢产物。随着下一代测序和基因组挖掘技术的发展，越来越多的潜在次级代谢产物基因簇从链霉菌基因组数据中被鉴定出来。然而，从这些基因簇中鉴定新的次级代谢产物仍然面临巨大挑战——基因簇的过表达以合成天然产物十分困难。利用天然链霉菌生产生物活性天然产物常受限于其生长缓慢、生产力低、实验室条件下难以激活基因簇，以及缺乏通用的遗传工具进行菌株工程改造。异源宿主中的过表达同样困难重重。例如，为了克服大肠杆菌中生物合成基因簇表达水平低和溶解度有限的问题，通常需要采用低温表达、密码子优化、启动子工程和分子伴侣共表达，并结合大量的菌株工程和工艺优化。即便如此，大多数化合物的产量仍不理想。发展高效的链霉菌无细胞蛋白合成系统，为上述难题提供了一条新的解决路径。
研究方法
2.1 菌株、培养基和质粒
链霉菌菌株S. lividans B12275、S. lividans 66、S. coelicolor ISP5233、S. rimosus B2659、S. roseosporus NRRL11379和S. species F4474购自美国农业研究服务菌种保藏中心（Peoria, IL）。S. venezuelae ATCC15439购自美国典型培养物保藏中心（Manassas, VA）。所有链霉菌菌株均在液体酵母提取物-麦芽提取物（YEME）培养基中培养，该培养基成分为（每升）：3 g酵母提取物、5 g蛋白胨、3 g麦芽提取物、10 g葡萄糖、340 g蔗糖和5 mM MgCl₂。携带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的质粒pJL1-EGFP作为CFPS反应的模板，该基因已针对链霉菌表达进行密码子优化。
【数据】培养基：YEME（每升含3 g酵母提取物、5 g蛋白胨、3 g麦芽提取物、10 g葡萄糖、340 g蔗糖、5 mM MgCl₂）；质粒：pJL1-EGFP（密码子优化）；菌株来源：ARS Culture Collection / ATCC
2.2 细胞提取物的制备
链霉菌的生长、收获和洗涤步骤与前期报道一致。最后一次洗涤离心后，将细胞沉淀重悬于S30裂解缓冲液中（50 mM HEPES-KOH pH 7.5、10 mM MgCl₂、50 mM NH₄Cl、5 mM β-巯基乙醇、10%（v/v）甘油）。随后，通过匀浆或超声两种方式裂解链霉菌细胞。
匀浆裂解按前期报道进行。简言之，细胞沉淀按每克湿重2.5 mL裂解缓冲液重悬，然后通过EmulsiFlex-B15匀浆机（Avestin，渥太华，加拿大）在12,000 psig压力下单次通过破碎。
超声裂解时，取6 g湿细胞加入6 mL裂解缓冲液，置于50 mL离心管中，在冰水浴中进行超声破碎。使用Q125超声破碎仪（Qsonica，Newtown，CT），输入能量约2000 J（45 s开/60 s关，3 mm直径探头，50%振幅）。
细胞破碎后，裂解液在16,000 g、4°C条件下离心30 min。收集上清液，立即在液氮中速冻，并于−80°C保存备用。
【数据】裂解缓冲液：S30（50 mM HEPES-KOH pH 7.5、10 mM MgCl₂、50 mM NH₄Cl、5 mM β-巯基乙醇、10%甘油）；匀浆条件：2.5 mL/g湿重、12,000 psig、单次通过；超声条件：6 g湿细胞/6 mL缓冲液、2000 J、45s开/60s关、3 mm探头、50%振幅；离心：16,000 g、4°C、30 min；保存：液氮速冻、−80°C
2.3 无细胞蛋白合成与EGFP测定
标准CFPS反应按前期报道进行。为考察细胞提取物浓度对蛋白产量的影响，分别在15 μL反应体系中加入4、5、6、7和8 μL细胞提取物。所有CFPS反应在23°C下孵育3 h。EGFP蛋白产量通过荧光强度转换为浓度（μg/mL）来确定，依据实验室内部制作的标准曲线。所有测量至少进行三次重复。
【数据】反应体系：15 μL；提取物体积：4–8 μL；温度：23°C；时间：3 h；检测方法：荧光标准曲线法；重复次数：≥3
研究结果
3.1 细胞提取物浓度对EGFP产量的影响
近期，我们开发了一种基于S. lividans的CFPS系统用于表达GC-rich基因。经过系统优化后，该链霉菌CFPS系统在批量反应中可合成约50 μg/mL的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。然而，这一产量仍低于经过20余年优化的大肠杆菌CFPS系统（>1000 μg/mL）。蛋白合成依赖于转录和翻译的偶联，这两个步骤中的任何一步都可能成为限速因素，底物（如ATP）同样可能限制反应。前期结果表明底物确实是一个限制因素，但本研究关注的是在反应初期底物充足时，转录或翻译是否限制系统。此前我们发现，在不同质粒浓度下EGFP产量均达到相似水平（约50 μg/mL），增加T7 RNA聚合酶浓度同样不能提高产量。基于这些结果，推测mRNA转录并非限制蛋白表达产量的因素。因此，我们将注意力转向蛋白生物合成机制的催化剂浓度，假设增加催化剂浓度可提高蛋白合成产量。
为验证这一假设，我们在15 μL CFPS反应中将细胞提取物体积从4 μL（26.7%，v/v）变化至8 μL（53.3%，v/v）。此前优化体系中添加5 μL细胞提取物作为对照。结果发现，随着细胞提取物添加量的增加，EGFP产量显著提高。添加8 μL细胞提取物时（在保证必需底物的前提下可加入的最大体积），最终产量达到约90 μg/mL，比添加4 μL细胞提取物时的37.6±7.4 μg/mL高出2倍以上（图2）。EGFP产量的增加表明，CFPS反应中的细胞提取物浓度确实是蛋白合成的限制因素。这一发现与已报道的枯草芽孢杆菌CFPS系统一致，提示这可能是一条通用的CFPS活性提升策略。
【数据】对照产量：约50 μg/mL（5 μL提取物）；4 μL提取物产量：37.6±7.4 μg/mL；8 μL提取物产量：约90 μg/mL（>2倍）；反应条件：23°C、3 h
3.2 超声制备细胞提取物提升EGFP产量
确定链霉菌总蛋白浓度为限制因素后，我们着手改变提取物制备策略，以提高提取物的总蛋白浓度。重点关注细胞裂解步骤。制备细胞提取物的裂解方法有多种，包括高压匀浆、超声、玻璃珠研磨和冻融循环等。在链霉菌CFPS系统开发初期，我们采用匀浆法裂解细胞，将1 g湿细胞沉淀重悬于2.5 mL细胞裂解缓冲液中。细胞破碎并澄清后，测得提取物中链霉菌总蛋白浓度为17.9±0.3 mg/mL。该总蛋白产量低于大肠杆菌细胞提取物（约40 mg/mL总大肠杆菌蛋白），这与增加链霉菌细胞提取物添加量可提高蛋白合成产量的结论一致（图2）。
如果在提取物制备初期就制备更浓缩的细胞提取物，我们推测可以进一步提高CFPS产量。为制备更浓缩的细胞提取物，我们尝试使用超声代替匀浆法裂解细胞，因为超声法可以更方便地减少重悬缓冲液的用量，从而在裂解过程中减少对细胞蛋白的稀释。超声法还有一个额外优势——无需昂贵的设备，这将使链霉菌CFPS系统更容易被普通实验室采用。
采用新的超声方法后，所得细胞提取物的总蛋白浓度为24.4±0.4 mg/mL，比匀浆法制备的提取物高1.4倍。我们随后评估了这种更浓缩的细胞提取物在CFPS中的活性。如图3所示，在每15 μL反应添加5 μL细胞提取物的条件下，超声法制备的提取物使EGFP产量比匀浆法提高了1.5倍。我们还按照之前的方法考察了不同细胞提取物体积对蛋白产量的影响。结果表明，EGFP产量从添加4 μL提取物时的48.5±2.1 μg/mL显著提升至添加6 μL提取物时的116.9±8.2 μg/mL。然而，当提取物添加量进一步增加（>7 μL）时，蛋白产量反而下降，这可能是引入了更多负面因素（如蛋白酶）所致。
总体而言，我们简单的超声方法可制备高活性的链霉菌细胞提取物，且裂解设备易于获取，其他实验室应能轻松采用。值得注意的是，约120 μg/mL EGFP是迄今已知的批量链霉菌CFPS反应中最高的蛋白产量报道。虽然半连续反应此前可产生更多蛋白（约280 μg/mL EGFP），但我们当前改进的批量系统合成速率约40 μg/mL/h，比半连续反应格式（约6 μg/mL/h）更高效。这一结果令人鼓舞，因为：（i）批量反应显著缩短了达到相似蛋白产量所需的反应时间；（ii）批量反应节省试剂（无需大量透析缓冲液）；（iii）批量反应为将来表达复杂天然产物生物合成基因簇提供了一种简便途径。虽然链霉菌CFPS产量仍低于大肠杆菌CFPS系统，但我们相信通过物理化学优化、生物过程工程和菌株工程策略，可以进一步提高整体蛋白产量。
【数据】匀浆法提取物总蛋白：17.9±0.3 mg/mL；超声法提取物总蛋白：24.4±0.4 mg/mL（1.4倍）；5 μL提取物条件下超声法产量提高1.5倍；4 μL提取物产量：48.5±2.1 μg/mL；6 μL提取物产量：116.9±8.2 μg/mL；>7 μL产量下降；合成速率：约40 μg/mL/h（批量）vs 约6 μg/mL/h（半连续）
3.3 扩展高产量链霉菌CFPS系统
在改进S. lividans B12275 CFPS系统后，我们尝试将新的细胞提取物制备方法（即超声法）和细胞-free反应方法应用于其他链霉菌菌株。这一目标可以证明我们方法的通用性，并为探索多种各具优势的链霉菌系统开辟机会。为此，我们选择了六种不同的链霉菌菌株：S. lividans 66、S. coelicolor ISP5233、S. rimosus B2659、S. roseosporus NRRL11379、S. venezuelae ATCC15439和S. species F4474。所有六种菌株的细胞生长、提取物制备和CFPS反应步骤均与S. lividans B12275相同。EGFP产量在23°C下进行3 h CFPS反应后测定。所有测试链霉菌菌株的最终EGFP产量如图4所示，以优化后的S. lividans B12275 CFPS系统作为对照。
数据表明，无需进一步优化，所有六种其他链霉菌细胞提取物均能活性表达EGFP。虽然观察到的蛋白产量各不相同，但七个菌株中有四个产出了超过60 μg/mL的EGFP。具体而言，S. rimosus B2659 CFPS系统在未经任何优化的情况下产生了近100 μg/mL的EGFP，表明该菌株是进一步开发（如物理化学优化、菌株工程）为高产量CFPS系统的良好候选菌株。S. lividans 66系统的EGFP产量达到84.7±4.2 μg/mL，比我们前期报道的产量（42.7±2.4 μg/mL）高出约2倍。这也证明了超声法可以制备出比匀浆法活性更高的细胞提取物。此外，我们还测试了S. venezuelae CFPS系统，获得的报告蛋白产量同样令人满意。
【数据】测试菌株数：6种；>60 μg/mL菌株数：4/7；S. rimosus B2659产量：约100 μg/mL（未优化）；S. lividans 66产量：84.7±4.2 μg/mL（vs 前期42.7±2.4 μg/mL，约2倍）；反应条件：23°C、3 h
讨论与解读
本研究通过两种途径提高了S. lividans CFPS系统的生产力：一是增加每个CFPS反应中催化剂的浓度（即添加更多细胞提取物），二是改进提取物制备工艺以维持更高的总蛋白浓度。优化后的批量模式链霉菌CFPS反应合成EGFP产量达116.9±8.2 μg/mL，为迄今报道的最高产量。为验证新系统的通用性，我们将该方法扩展至六种其他链霉菌菌株，均获得活性表达。这些结果确立了新型链霉菌无细胞系统作为合成生物学应用工具的地位，提高的蛋白表达产量为研究天然产物通路创造了新的机会。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，本研究的核心价值在于用"做减法"的思维解决了"做加法"的问题——不依赖复杂的菌株工程，仅通过调整提取物添加量和更换裂解方式就实现了产量翻倍。超声法替代高压匀浆降低了设备门槛，使普通实验室也能开展链霉菌CFPS研究。局限在于产量仍远低于大肠杆菌系统（约1/10），且未深入解析蛋白酶等负面因子在提取物过量时的具体作用机制。未来若能将此系统与无细胞代谢工程结合，用于天然产物基因簇的体外表达与通路重构，将释放更大潜力。
参考来源
Jian Li. Expanding the palette of Streptomyces-based cell-free protein synthesis systems with enhanced yields. Biochemical Engineering Journal, 2018. DOI: 10.1016/j.bej.2017.11.013
DOI: 10.1016/j.bej.2017.11.013