来源：Automated, modular assembly of reconstituted cell-free systems from in vitro-produced components（Trends in Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
细胞-free蛋白合成系统（CFS）是合成生物学的重要工具，但传统重组系统（如PURE系统）成本高昂、制备繁琐。本研究开发了i-POPFLEX系统——由34个翻译组分和分裂T7 RNA聚合酶组成，全部通过体外合成并借助自动化液体处理平台组装。该系统蛋白产量提升最高8.4倍，成本较商业试剂盒降低96%，制备时间从4天缩短至2天，并支持遗传密码重编程和非天然氨基酸定点掺入，技术就绪水平达到4–5级。
研究背景
细胞-free系统（CFS）能够在活细胞之外的可编程生化环境中实现基因表达和蛋白质合成，为合成生物学和工业生物制造提供了高度灵活性。CFS已广泛应用于代谢通路快速原型化、合成细胞自下而上构建、毒性蛋白高效表达、按需诊断、酶高通量筛选以及非天然氨基酸（ncAA）定点掺入生产抗体药物偶联物（ADC）等领域。
CFS主要分为两类：粗裂解液系统和由单独纯化因子组装的重组系统。粗裂解液保留了大肠杆菌核糖体、tRNA、代谢酶和辅因子的天然生化特性（约占大肠杆菌蛋白质组的20–40%），能够以低成本（约USD 0.03 μl⁻¹）实现毫克至克级蛋白产量，可放大至工业多千升级别。但其组成不明确，限制了可重复性、系统优化和遗传密码重编程。相比之下，以PURE平台为代表的重组系统组成明确，但制备过程依赖体内表达和手工纯化，成本高昂、耗时费力。本研究旨在开发一种全体外、自动化、模块化的重组CFS组装策略，以克服上述瓶颈。
研究方法
POPFLEX组分DNA模板的构建
对于One-Pot PURE系统，使用pET和pQE表达质粒进行蛋白表达。为建立ssOP系统，将pQE表达质粒中的所有基因扩增并克隆至pET21a骨架。Gibson组装在10 μl反应体系中进行，使用扩增基因和pET21a载体片段，加入T5外切酶、Taq连接酶和Phusion DNA聚合酶（均购自New England Biolabs, NEB）。具体操作：2.5 μl扩增基因、2.5 μl pET21a骨架和5 μl 2X Gibson Assembly Master Mix混合，50°C孵育50分钟。取2.5 μl组装混合物转化大肠杆菌BL21(DE3)衍生感受态细胞（NEB）。
【数据】Gibson组装体系：10 μl；温度：50°C；时间：50 min；转化体积：2.5 μl；菌株：E. coli BL21(DE3)衍生株
POPFLEX组分的体内表达
POPFLEX组分按照先前报道的方法并加以修改制备。除EF-Tu外，33个独立的大肠杆菌BL21(DE3)衍生菌株分别用编码目标基因的pET质粒转化，在单个96孔板中、每孔150 μl含100 μg·ml⁻¹氨苄青霉素的LB培养基中培养，板用透气膜（Sigma-Aldrich）密封。转化后，含EF-Tu载体的细胞在14 ml圆底管中、3 ml LB培养基中培养，其余33种细胞在96孔板中、每孔150 μl LB培养基中培养。过夜孵育后，将1.675 ml EF-Tu表达细胞和其余各培养物55 μl合并至500 ml新鲜LB培养基中，在100 μg·ml⁻¹氨苄青霉素存在下，37°C、220 RPM剧烈振荡培养至饱和过夜。监测细胞生长，当600 nm光密度达到0.2–0.3时，加入终浓度0.1 μM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达。培养物继续孵育3小时，然后4°C、4,000 g离心10分钟收获细胞。细胞用预冷的PURE缓冲液A（含50 mM HEPES-KOH pH 7.6、1 M NH₄Cl、10 mM MgCl₂和7 mM 2-巯基乙醇）洗涤一次，储存于−80°C。次日，细胞解冻约2–3小时，重悬于7.5 ml PURE缓冲液A中，使用Q125超声破碎仪（Qsonica）配3 mm直径探头、50%振幅、10秒开/关脉冲、冰上总计20分钟裂解。细胞提取物4°C、21,130 g离心20分钟去除细胞碎片，随后上样至His标签亲和纯化柱，具体如下所述。
【数据】培养基：LB；抗生素：100 μg·ml⁻¹氨苄青霉素；诱导剂：0.1 μM IPTG；诱导OD₆₀₀：0.2–0.3；诱导时间：3 h；离心：4,000 g、4°C、10 min；裂解：Q125超声、50%振幅、10 s on/off、冰上20 min；二次离心：21,130 g、4°C、20 min
i-POPFLEX组分表达DNA模板的构建
所有蛋白表达所需基因均扩增并克隆至pJL1骨架。Gibson组装在10 μl反应体系中进行，取2.5 μl组装混合物转化大肠杆菌DH5-α感受态细胞（NEB）。重组质粒使用FavorPrep™质粒DNA提取迷你试剂盒（Favorgen）提取。RF2、甲硫氨酰-tRNA甲酰转移酶（MTF）、肌酸激酶（CK）、肌激酶（MK）、核苷二磷酸激酶（NDK）和无机焦磷酸酶（PPiase）使用线性DNA模板表达，该模板通过聚合酶链式反应（PCR）制备并经酚-氯仿DNA提取纯化。DNA浓度使用Nabi™纳米分光光度计（MicroDigital Co. Ltd.）在260 nm波长处测量。
【数据】克隆载体：pJL1；转化菌株：E. coli DH5-α；DNA浓度测定波长：260 nm；线性DNA模板表达组分：RF2、MTF、CK、MK、NDK、PPiase
大肠杆菌S12/S30细胞裂解液的制备
大肠杆菌S12/S30细胞裂解液按照先前报道的方法制备。E. coli BL21(DE3)衍生株在37°C、1 L 2X YTPG培养基中、220 RPM剧烈振荡培养至600 nm光密度约0.6，此时加入1 mM IPTG诱导蛋白表达。细胞在指数期（OD₆₀₀达到3.0时）通过4°C、4,000 g离心10分钟收获，用预冷缓冲液A（含10 mM Tris-醋酸 pH 8.2、14 mM Mg(OAc)₂、60 mM KGlu和2 mM二硫苏糖醇（DTT））洗涤三次，储存于−80°C。次日，细胞沉淀解冻2–3小时，按每克湿细胞重悬于1 ml缓冲液A。重悬细胞用超声裂解，冰上总计2分钟，12,000 g离心10分钟（S12）或30,000 g离心30分钟两次（S30），储存于−80°C。所有缓冲液使用前新鲜配制。
【数据】培养基：2X YTPG；诱导：1 mM IPTG；收获OD₆₀₀：3.0；离心：4,000 g、4°C、10 min；裂解：超声冰上2 min；S12：12,000 g、10 min；S30：30,000 g、30 min×2；缓冲液A：10 mM Tris-醋酸 pH 8.2、14 mM Mg(OAc)₂、60 mM KGlu、2 mM DTT
i-POPFLEX组分的体外表达
i-POPFLEX组分的制备采用手动操作或Opentrons OT-2液体处理器。编码i-POPFLEX组分的36个DNA模板各自分别与上述制备的大肠杆菌S12细胞裂解液混合。具体而言，15 μl大肠杆菌细胞裂解液、6.6 μl溶液A、6.3 μl溶液B和DNA模板（终浓度：16.67 ng·μl⁻¹）加入1.5 ml微量管中，终体积45 μl。每管30°C孵育16小时。对于i-POPFLEX组分的自动化体外表达，用Python编写OT-2协议。大肠杆菌细胞裂解液、溶液A、溶液B和DNA模板在1.5 ml微量管中混合，终体积45 μl。反应30°C孵育16小时。孵育后，反应混合物合并至15 ml锥形管中，4°C、21,130 g离心20分钟去除残余细胞碎片。上清液与5 ml PURE缓冲液A混合，上样至ÄKTA系统进行His标签亲和纯化。
【数据】反应体积：45 μl；裂解液：15 μl；溶液A：6.6 μl；溶液B：6.3 μl；DNA模板终浓度：16.67 ng·μl⁻¹；温度：30°C；时间：16 h；离心：21,130 g、4°C、20 min
通过快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化翻译机制
所有His标签翻译因子通过ÄKTA UPC-900系统（GE Healthcare）纯化，使用5 ml HisTrap™ HP柱（Cytiva），4°C操作。样品注射前，柱子用结合缓冲液以3 ml·min⁻¹流速平衡。洗脱使用450 mM咪唑、相同流速，280 nm监测洗脱。收集的级分用含30%甘油的PURE透析缓冲液在4°C透析三次，每次1小时。透析后的溶液使用Amicon® Ultra超滤离心管（Merck Millipore）3 kDa截留分子量浓缩至终浓度10–12 mg·ml⁻¹（POPFLEX和i-POPFLEX分别）。所得溶液储存于−20°C。
【数据】纯化系统：ÄKTA UPC-900；柱子：5 ml HisTrap™ HP；温度：4°C；流速：3 ml·min⁻¹；洗脱：450 mM咪唑；检测波长：280 nm；透析：含30%甘油，4°C，3次×1 h；浓缩：3 kDa MWCO；终浓度：10–12 mg·ml⁻¹；储存：−20°C
SDS-PAGE分析
为验证FPLC纯化蛋白的准确性，额外进行了手动纯化作为对比。各His标签翻译因子使用HisPur™ Cobalt Superflow Agarose树脂（ThermoFisher Scientific）纯化。30 μl琼脂糖树脂在离心柱中用500 μl预冷洗涤缓冲液（95% PURE缓冲液A、5% PURE缓冲液B）洗涤三次。反应混合物加入琼脂糖树脂，4°C孵育1小时。树脂洗涤三次，加入30 μl洗脱缓冲液（10% PURE缓冲液A、90% PURE缓冲液B），4°C孵育1小时。从上清收集蛋白，通过SDS-PAGE分离。8 μl蛋白样品与2 μl 5X SDS-PAGE上样缓冲液（Biosesang）混合，95°C煮沸5分钟，在12% SDS-PAGE凝胶上电泳。分离的蛋白用考马斯亮蓝染色，用Bio-Rad Gel Doc Go成像系统显像。
【数据】树脂：HisPur™ Cobalt Superflow Agarose；树脂量：30 μl；洗涤：500 μl×3次；孵育：4°C、1 h；洗脱缓冲液：10% A + 90% B；上样：8 μl蛋白 + 2 μl 5X缓冲液；煮沸：95°C、5 min；凝胶：12% SDS-PAGE
Native-PAGE分析
Native-PAGE用于验证αHL七聚体结构的组装。Strep标签αHL用Strep-Tactin® XT 4Flow®树脂（IBA）纯化。纯化蛋白与等体积Novex™ Tris-Glycine Native Sample Buffer（2X）（Invitrogen）混合，在12% Native-PAGE凝胶上电泳。分离的蛋白用考马斯亮蓝染色，用Bio-Rad Gel Doc Go成像系统显像。
【数据】纯化树脂：Strep-Tactin® XT 4Flow®；上样缓冲液：Novex™ Tris-Glycine Native Sample Buffer (2X)；凝胶：12% Native-PAGE
自配能量溶液的制备
能量溶液按照先前描述的方法稍加修改制备。4X能量溶液的组分为200 mM HEPES-KOH（pH 7.6），其余组分原文未详述。
【数据】4X能量溶液：200 mM HEPES-KOH (pH 7.6)；其余组分原文未详述
研究结果
复制体内翻译机制合成所面临的挑战
尽管重组CFS在生物铸造厂中具有成本效益的蛋白合成和高通量酶分析的巨大潜力，但各实验室之间的可重复性仍然是一个挑战。为解决这一问题，我们首先尝试复制One-Pot PURE系统，该系统依赖于体外翻译所需全部蛋白组分的共培养和共纯化。参照先前研究，我们使用了两种细菌菌株：E. coli BL21(DE3)衍生株（T7 Express Competent E. coli；NEB）和DH5-α（NEB 5-alpha Competent E. coli；NEB），分别能够识别T7和T5启动子。由于早期工作中使用的优化M15菌株已无法商业获取，我们改用DH5-α进行T5驱动表达，该表达依赖于天然σ70 RNA聚合酶识别T5启动子。编码蛋白翻译机制、各含组氨酸标签（His-tag）的基因被克隆至基于T7的pET和基于T5的pQE质粒中。细胞经培养、裂解，His标签蛋白按照先前发表的方案纯化。尽管我们付出了努力，我们的制备物在蛋白合成（如超折叠GFP（sfGFP）表达）中未表现出活性。虽然DH5-α菌株并非蛋白表达的最适菌株，我们观察到携带pQE质粒的菌株之间存在不一致的生长，这与先前报道的One-Pot PURE系统批次间变异性一致。例如，Ellington等人报道了pQE质粒在−80°C长期储存后T5启动子区域出现缺失，而Murray团队观察到在含甘油溶液中保存的双菌株系统蛋白表达效率降低。
为克服上述局限性并提高蛋白表达的可靠性和效率，我们将重点转向复制Murray团队开发的单菌株One-Pot PURE（ssOP）系统。为确保所有表达菌株的生长速率一致，我们用基于T7启动子的pET载体替换了原始pQE载体，并将16个表达质粒中的14个（补充信息在线表S4和S5）亚克隆至大肠杆菌BL21(DE3)衍生株中，排除了T7 RNA聚合酶（T7RNAP）和释放因子1（RF1）的质粒。先前研究表明，在混合培养中从T7启动子表达T7RNAP会诱导自催化反馈环，导致严重过表达和细胞死亡。为缓解这种不稳定性，我们外源提供T7RNAP作为商业制剂（NEB），确保高效转录而不损害培养物活力。此外，我们有意省略了RF1（一种关键的翻译终止组分），以实现UAG（琥珀）密码子的灵活重新分配用于掺入ncAA。没有RF1，UAG密码子（正常为终止信号）可以被重新利用编码多种ncAA，从而扩展我们重组系统的多功能性。
在蛋白翻译所需的36个独立组分中，34个相应的pET载体分别转化至大肠杆菌中。转化后，所有培养物在Luria–Bertani（LB）培养基中分别过夜培养。然后将培养物合并至500 ml新鲜LB培养基中生长至饱和。在此步骤中，延伸因子热不稳定（EF-Tu）以过量供应（30:1，v/v），因为其在翻译中起关键作用——EF-Tu水平不足会导致tRNA递送不良、核糖体停滞和蛋白产量降低。维持充足的EF-Tu确保体外翻译系统在蛋白合成过程中不受限。培养后，细胞通过超声裂解、离心，His标签蛋白从上清液中纯化。
为改进先前ssOP策略中使用的常规重力流纯化，我们采用了自动化快速蛋白液相色谱（FPLC）系统（图2A）。采用FPLC将蛋白洗脱时间从数小时缩短至约20分钟，同时提高了蛋白产量、纯度和可重复性，这些对于组装稳健的重组CFS均至关重要。这一优化工作流将整体流程缩短至3–4天，而常规手动组装需要5–7天（补充信息在线图S1和表S2）。
使用FPLC纯化的蛋白混合物，我们首先评估了其蛋白合成能力。按照先前研究建立的方案，纯化蛋白混合物经浓缩并调整至终浓度1 mg·ml⁻¹，然后与自配4X能量溶液（补充信息在线表S6）、大肠杆菌总tRNA、从S150蔗糖沉淀中收获的核糖体、商业T7RNAP（NEB）以及编码sfGFP的DNA模板（终浓度：25 ng·μl⁻¹）在5 μl反应中混合。初步测试显示sfGFP表达水平（图2B浅绿色柱）与商业PURExpress系统（图2B红色柱）相当。为探究这一结果，我们考察了来自常规透析缓冲液中MgCl₂和KCl的氯离子的影响。虽然氯离子是转录和翻译反应中常用的辅因子，但据报道它们会抑制酶活性，包括降低T7RNAP的催化效率。为测试替代离子环境，我们将MgCl₂和KCl替换为醋酸盐和谷氨酸盐[分别为Mg(OAc)₂和KGlu]。尽管sfGFP表达仍低于PUREfrex 2.0（图2B橙色柱），但这一替换使sfGFP荧光增加了1.5倍（图2B绿色柱），表明转录和翻译活性增强。
综上所述，我们优化的ssOP系统整合了基于FPLC的His标签纯化和生理相关的醋酸盐/谷氨酸盐缓冲体系（补充信息在线表S7），增强了重组CFS工作流用于体外蛋白合成的稳定性和生产力。我们将这一优化系统命名为Purified components Optimized for Flexible protein expression（POPFLEX），这是一个专为高产率细胞-free蛋白合成设计的模块化平台。我们的POPFLEX方案通常从500 ml培养物中获得250 μl浓度为10–12 mg·ml⁻¹的纯化蛋白溶液。该产量足以支持50次25 μl规模的细胞-free反应，与标准PURExpress试剂盒（E6800S）相比，生产力和试剂利用率提高了最多5倍——后者仅提供相同体积的十次反应试剂。
【数据】菌株：E. coli BL21(DE3)衍生株 + DH5-α；质粒：pET（T7）+ pQE（T5）；FPLC洗脱时间：~20 min（对比数小时）；总流程：3–4天（对比5–7天）；sfGFP模板浓度：25 ng·μl⁻¹；反应体积：5 μl；醋酸盐/谷氨酸盐替换后sfGFP荧光增加：1.5倍；蛋白产量：250 μl @ 10–12 mg·ml⁻¹（500 ml培养物）；反应次数：50次（25 μl规模）；对比PURExpress：10次
转向基于裂解液的细胞-free平台生产翻译机制
构建重组CFS的传统方法依赖于体内到体外的工作流，即翻译因子在活细胞内产生，然后纯化并在体外组装。然而，体内制备翻译机制仍然是主要瓶颈，严重限制了CFS组装的效率。从培养到最终蛋白混合物制备，我们的POPFLEX方案通常需要4天（图2A）。这些劳动密集且耗时的步骤限制了可扩展性和通量。为克服这些限制，我们转向了体外策略来生产34个蛋白组分。这种方法具有显著优势：CFS的开放性使得快速、并行化、自动化兼容的生产成为可能，减少了对大规模细胞培养的依赖，并降低了时间和成本需求。通过整合自动化液体处理，该策略为高通量合成生物学中的高效和经济可持续的流水线奠定了基础。
【数据】POPFLEX制备时间：4天；i-POPFLEX制备时间：2天；蛋白组分数量：34个；自动化平台：OT-2液体处理器
体外合成翻译机制组分的SDS-PAGE验证
通过SDS-PAGE分析验证了体外合成并纯化的翻译机制组分。图3A显示了20种氨酰-tRNA合成酶（aaRSs）的条带，图3B显示了起始因子和延伸因子（IEFs），图3C显示了释放因子（RFs）——其中RF1在i-POPFLEX系统中被省略以实现UAG（琥珀）密码子的重新分配。
【数据】SDS-PAGE验证组分：20种aaRSs、IEFs、RFs；省略：RF1
线性DNA模板对某些翻译组分体外合成效率的必要性
初步尝试使用裂解液中产生的全部35个组分（图3）合成sfGFP未能成功。为鉴定问题组分，我们将它们分为五类：aaRSs、IEFs、RFs、能量和辅助因子。图4显示了不同组分组合对sfGFP合成的影响。
【数据】组分分类：5类（aaRSs、IEFs、RFs、能量、辅助因子）；测试蛋白：sfGFP
半自动化i-POPFLEX平台
图5A展示了i-POPFLEX制备的示意流程。所有手动混合步骤均在自动化液体处理平台（OT-2）上执行，实现了重组CFS的高效模块化组装。共执行四个步骤。
【数据】自动化平台：OT-2；制备步骤：4步
i-POPFLEX通过省略RF1支持非AUG翻译起始
图6A显示，底物（1）用DNB酯激活并通过Fx负载到tRNAfMet(CUA)上。负载的（1）：tRNA偶联物随后加入含有DNA模板的i-POPFLEX反应中，实现底物（1）的N端掺入。图6B显示了非AUG翻译起始的结果。
【数据】底物激活：DNB酯；tRNA：tRNAfMet(CUA)；负载酶：Fx；掺入位置：N端
减少aaRS库最小化tRNA竞争并支持通过重新分配有义密码子实现遗传密码扩展
图7A显示，合成底物用DNB酯激活并分别通过Fx负载到tRNAs上。负载的底物：tRNA偶联物经纯化后加入i-POPFLEX反应中。图7B显示了在有义密码子重新分配条件下的蛋白合成结果。
【数据】底物激活：DNB酯；负载酶：Fx；修饰：有义密码子重新分配
讨论与解读
本研究将重组CFS从一项专业技术转变为适用于常规生物铸造厂使用和工业应用的实用自动化工具。通过用自动化FPLC替代重力流色谱，纯化时间从数小时缩短至约20分钟，提高了因子回收率，消除了批次间变异性。由此产生的POPFLEX（体内产生）混合物产生的sfGFP荧光强度与商业PURExpress试剂盒相当，在−20°C下保存超过6个月仍保持完全活性，并且在FPLC平台上表现出更高的可重复性。
为便于直接比较各制备方法的总体成本，我们采用了与先前基准（One-Pot PURE系统；USD 0.09 μl⁻¹）相同的核算边界（仅试剂成本）。在此框架下，POPFLEX的总体试剂成本估计为USD 0.065 μl⁻¹，较One-Pot PURE降低28%，较PURExpress（USD 1.36 μl⁻¹）降低95%（21倍）。在OT-2平台上实施的生产策略实现了体外转录和翻译所需全部组分的并行表达，将总流程时间从4天缩短至2天。使用OT-2，i-POPFLEX在重复实验中表现出低批次间变异性，表明自动化提高了可重复性并减少了人为误差。
i-POPFLEX系统的成本优势显著——每微升0.05美元，较商业试剂盒降低96%（27倍），蛋白产量提升最高8.4倍。该系统已在多种蛋白和肽合成应用中验证，包括遗传密码重编程和非经典氨基酸的位点特异性掺入，并与台式自动化液体处理平台无缝集成。这些能力使i-POPFLEX达到技术就绪水平4–5级：集成组件已在实验室环境中验证，并正朝着中试规模就绪迈进。全面部署仍需克服若干关键挑战：匹配粗裂解液成本（USD 0.03 μl⁻¹）需要批量试剂生产、优化采购策略和专用高通量组分合成设备；实现毫升和升级产量需要在上下游合成、下游纯化和质量控制方面进行改进，以确保工业通量下的一致性。克服这些障碍将能够生产数千至数百万套完全组装的i-POPFLEX系统，用于生物铸造厂规模的酶工程、代谢通路原型化和大规模变体筛选，从而普及重组CFS技术并加速其在下一代生物制造流水线中的应用。
编译者解读
该研究的核心价值在于将重组CFS从"手工奢侈品"推向"自动化工业品"。选择全体外合成翻译组分并配合OT-2自动化平台，直接击中了传统PURE系统制备周期长、成本高、批次差异大的三大痛点。96%的成本降幅和8.4倍的产量提升，使重组CFS在成本上逼近粗裂解液，在可控性上远超后者。值得注意的是，省略RF1实现UAG密码子重编程的设计，为遗传密码扩展提供了更简洁的底盘。局限在于毫升至升级放大仍需突破——这是所有体外系统的共性瓶颈。从合成生物学应用视角看，i-POPFLEX有望成为生物铸造厂中酶工程和代谢通路原型化的标准工具。
参考来源
期刊：Trends in Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.05.002
DOI: 10.1016/j.tibtech.2026.05.002