来源：Precursor balancing by reprogramming pyruvate synthesis for high-yield l-isoleucine production in engineered Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-异亮氨酸是支链氨基酸家族成员，在食品、饲料和医药领域应用广泛，但微生物发酵法生产距离理论产率仍有较大差距。本研究通过系统代谢工程改造大肠杆菌，首次构建了基于PtsG的前体平衡路径，将葡萄糖碳流精准分配至丙酮酸和2-氧代丁酸两条合成线路，最终实现0.67 mol L-Ile/mol glucose的产率——这是迄今报道的葡萄糖基L-异亮氨酸生物合成的最高产率。研究同时显著降低了副产物L-缬氨酸的积累，为下游纯化扫清了障碍。
研究背景
L-异亮氨酸与L-缬氨酸、L-亮氨酸同属支链氨基酸，人体无法自行合成，必须从膳食中获取。其在调节血糖、增强免疫、提供能量和促进肌肉合成等方面具有独特生理功能，因此在食品、饲料、制药及化妆品行业均有重要应用价值。近年来，L-异亮氨酸还作为4-羟基异亮氨酸——一种强效抗糖酵解药物——的生物合成前体而备受关注。随着全球市场对L-异亮氨酸需求不断增长，开发高效的工业生产方法成为迫切需求。微生物发酵因其环境友好、成本低廉、可利用天然生物合成途径且适合大规模操作，被视为最有前景的生产路线。工业发酵中，研究者主要聚焦于谷氨酸棒杆菌的代谢工程改造，虽已取得显著成果，但仍未达到理论产率。本研究的核心目标是通过平衡两种直接前体——2-氧代丁酸和丙酮酸——来提高L-异亮氨酸的葡萄糖产率。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒均列于补充材料中。E. coli DH5α用于质粒构建。所有质粒采用Gibson assembly方法构建（Gibson et al., 2009）。基因敲除和启动子替换使用CRISPR-Cas9系统，操作流程参照已有报道（Jiang et al., 2015）。此外，包括Cgppc、thrABC、asd、ilvA和ygaZH在内的基因染色体整合也通过同一CRISPR-Cas9平台完成。基因删除和整合过程中加入L-阿拉伯糖（2.0 g/L）诱导CRISPR/Cas9系统。来自E. coli K12（BW25113）的IlvGM（AHASII）活性通过在第982位碱基后插入AT/GT恢复。对源自大肠杆菌的thrA和ilvA基因引入点突变，获得突变体thrA S345F和ilvA L447A, L451A, L454A，分别解除L-苏氨酸和L-异亮氨酸的反馈抑制。异源基因ilvC（源自Lactococcus lactis，Shi et al., 2025）、leuDH（源自Labrenzia aggregate，Meng et al., 2021）和ppc（源自谷氨酸棒杆菌）均经过密码子优化以适配大肠杆菌表达系统。
【数据】诱导剂：L-阿拉伯糖 2.0 g/L；突变位点：thrA S345F，ilvA L447A/L451A/L454A；异源基因：ilvC、leuDH、ppc；宿主菌：E. coli DH5α
2.2 培养条件
大肠杆菌菌株在37°C、220 rpm摇床培养，培养基为Luria–Bertani培养基（每升含：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g），按需添加链霉素（50 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）或氨苄青霉素（100 μg/mL）。蛋白表达时，挑取单菌落接种至2YT培养基（每升含：胰蛋白胨16 g、酵母提取物10 g、NaCl 5 g），37°C、220 rpm培养4–5小时至OD600达到1–2，作为自诱导种子液。种子液以5%（v/v）接种量转接至含ZYM液体培养基的摇瓶中。37°C、220 rpm培养3–4小时至OD600达到1–2后，加入L-阿拉伯糖至终浓度2 g/L诱导蛋白表达，随后转至30°C继续培养12.5小时。
【数据】LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L；抗生素：链霉素50 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL；2YT培养基：胰蛋白胨16 g/L、酵母提取物10 g/L、NaCl 5 g/L；接种量：5%（v/v）；诱导温度：30°C；诱导时间：12.5 h；OD600：1–2
2.3 全细胞生物催化条件
L-苏氨酸和L-异亮氨酸合成时，细胞在30°C摇床中诱导12.5小时后收集，4500 rpm离心10 min，重悬于1 mL反应体系（OD600 = 30）中，反应体系含50 mM葡萄糖、80 mM NH4HCO3、2 mM MgCl2和1 × M9盐。生物转化反应在37°C、220 rpm摇床中进行，按需在不同时间点取样。
【数据】离心：4500 rpm、10 min；OD600：30；葡萄糖：50 mM；NH4HCO3：80 mM；MgCl2：2 mM；反应温度：37°C；转速：220 rpm
2.4 1-L发酵罐生物转化
生物转化在1-L生物反应器中进行，条件受控。细胞收集后重悬于500 mL生物转化培养基（pH 7.0）中，培养基含50 mM葡萄糖、80 mM NH4HCO3、2 mM MgCl2和1 × M9盐，终OD600为30。反应过程中每2小时补充葡萄糖（50 mM），每4小时补充NH4HCO3（40 mM）。生物转化在37°C下进行，用NaOH维持pH为7.0。搅拌速度调节以维持溶解氧（DO）浓度约为40%。
【数据】发酵罐体积：1-L；工作体积：500 mL；pH：7.0；葡萄糖补加：50 mM/2 h；NH4HCO3补加：40 mM/4 h；温度：37°C；DO：约40%；OD600：30
2.5 分析方法
细胞光密度用分光光度计（V5100H，METASH，中国）在600 nm处测定。上清液中2-氧代丁酸、丙酮酸和葡萄糖浓度采用高效液相色谱（HPLC，Agilent 1260系列）检测，配备Aminex HPX-87H色谱柱（300 × 7.8 mm，Bio-Rad，美国）和示差折光检测器，样品收集后立即进样。色谱柱以5 mM H2SO4为流动相，55°C、0.4 mL/min洗脱30 min。L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸在60°C下用二硝基氟苯（DNFB）衍生化1小时，加入10 mM KH2PO4终止反应。反应混合物用Agilent ZORBAX plus-C18 3.5 μm色谱柱（4.6 × 150 mm）在40°C下分析，A360nm用二极管阵列检测器（DAD）检测。反应后溶液采用两种流动相的线性梯度洗脱分析（流动相A：乙腈；流动相B：0.1%甲酸；65%-35%流动相B线性梯度21 min；35%-65%流动相B线性梯度21–22 min；85%流动相B保持22–25 min），流速0.4 mL/min。
【数据】HPLC柱温：55°C；流速：0.4 mL/min；流动相：5 mM H2SO4；衍生化温度：60°C；衍生化时间：1 h；C18柱温：40°C；检测波长：360 nm；梯度：65%-35% B（21 min），35%-65% B（21–22 min），85% B（22–25 min）
2.6 结构与分子动力学（MD）分析
乙酰羟酸合成酶II（AHASII）及其突变体的三维结构由Alphafold3（https://alphafoldserver.com/）预测，模型准确性通过ERRAT网络服务器（https://saves.mbi.ucla.edu）验证。所有对接计算使用AutoDock 4.2和Discovery Studio 2019进行，构建包含AHASII、FAD、镁离子和过渡态产物（AHAThDP）的复合物。对接模拟采用程序标准参数进行交互式生长和后续打分。分子动力学（MD）模拟中，拓扑文件通过CHARMM-GUI网络工具（https://charmm-gui.org/）获取。MD模拟在Gromacs 2022.2中进行，采用CHARMM36m全原子力场，TIP3P水模型。中和系统以100 mM磷酸阴离子、10 mM镁离子和适量氯离子构建。能量最小化采用最速下降法运行5000步，系统平衡在等温等压（NPT）条件下进行100 ps。温度维持在310.15 K，每个复合物模拟进行100 ns生产运行。对接结果和MD轨迹均通过PyMOL软件（https://www.pymol.org）可视化。
【数据】力场：CHARMM36m；水模型：TIP3P；离子浓度：100 mM磷酸阴离子、10 mM镁离子；能量最小化：5000步最速下降法；平衡：100 ps NPT；温度：310.15 K；生产模拟：100 ns
2.7 酶活测定
AHASII活性参照已发表方法稍作修改测定（Leyval et al., 2003）。反应混合物含：100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.4）、50 mM丙酮酸钠、50 mM 2-氧代丁酸、10 mM MgCl2、100 μM硫胺素焦磷酸（TPP）和100 μM黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。反应通过向900 μL混合物中加入100 μL粗提物启动。在37°C水浴中孵育20 min后，加入0.1 mL 50% H2SO4酸化终止反应。
【数据】缓冲液：100 mM磷酸钾（pH 7.4）；底物：50 mM丙酮酸钠、50 mM 2-氧代丁酸；辅因子：10 mM MgCl2、100 μM TPP、100 μM FAD；反应温度：37°C；反应时间：20 min；终止：0.1 mL 50% H2SO4
研究结果
3.1 无质粒L-苏氨酸生物合成模块的构建
L-苏氨酸是L-异亮氨酸生物合成的关键前体。鉴于L-异亮氨酸生物合成途径的复杂性，研究者旨在构建无质粒L-苏氨酸生物合成模块，为后续L-异亮氨酸模块保留质粒可用性。以实验室前期构建的工程菌株T01为起始菌株（Shi et al., 2025）。T01的遗传背景如下：PTS系统通过敲除ptsG和过表达glk进行改造，从而提升葡萄糖摄取能力。基因iclR被敲除，并整合了来自谷氨酸棒杆菌的异源ppc基因以增强前体草酰乙酸的供应。为减少竞争途径对前体的消耗，敲除了lysA、metA和tdh基因，分别阻断L-赖氨酸、L-甲硫氨酸和L-甘氨酸的生物合成。此外，ilvA被删除以防止L-苏氨酸向2-氧代丁酸的转化，同时整合了编码大肠杆菌内源L-苏氨酸输出蛋白的rhtC基因以促进其分泌。
相比基于质粒的基因过表达，染色体整合为持续基因表达提供了更稳定的策略。为增强L-苏氨酸生物合成，研究者向染色体引入了多个关键基因拷贝。Ppc（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）催化磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧化生成草酰乙酸（OAA），后者是L-天冬氨酸的前体。L-天冬氨酸随后经ThrA、Asd、ThrB和ThrC依次催化转化为L-苏氨酸。基因簇（thrA、thrB、thrC、Cgppc和asd）被整合至大肠杆菌T01的pflB和ldhA两个染色体位点。结果显示，携带两个拷贝基因簇（thrA、thrB、thrC、Cgppc和asd）的菌株Thr03相较于仅有一个拷贝基因簇的T01，L-苏氨酸产量显著提高；Thr03的产率达到0.12 mol L-苏氨酸/mol葡萄糖。
然而，两轮整合被证明不足以满足L-苏氨酸生物合成的需求。考虑到thrA*、thrB、thrC和asd编码从L-天冬氨酸到L-苏氨酸主途径的关键酶，研究者在Thr03菌株的另外三个基因组位点（lpxM、poxB和adhE）又整合了三拷贝该基因簇，得到最终菌株Thr06。Thr06实现了更高的L-苏氨酸产率（0.45 mol L-Thr/mol葡萄糖），比Thr03（0.12 mol L-Thr/mol葡萄糖）提高了275%（图2a）。RT-qPCR分析显示，工程菌株T01-Thr06中ThrABC、Ppc和Asd的表达水平随基因拷贝数增加而显著上升，这与观察到的L-苏氨酸产量增加一致（见补充材料）。
过表达PPC增强了磷酸烯醇式丙酮酸向草酰乙酸的供应，但大肠杆菌中的PEP羧激酶优先催化草酰乙酸向磷酸烯醇式丙酮酸的逆反应（Hayashi et al., 2006; Li et al., 2017）。为避免草酰乙酸消耗，Thr06的内源pck基因被进一步删除，得到菌株Thr07。考虑到ThrA具有天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶活性，催化草酰乙酸到L-苏氨酸途径中的两个关键反应，Thr07染色体中又整合了一个额外拷贝的thrA*，得到菌株Thr08。该菌株表现出更高的L-苏氨酸产率（0.52 mol L-苏氨酸/mol葡萄糖），较前菌株Thr06（0.45 mol L-苏氨酸/mol葡萄糖）提高了15.6%（图2b）。
多轮关键基因整合后，L-苏氨酸生产菌株的生长性能出现轻微下降（见补充材料）。为进一步扩大L-天冬氨酸前体库，研究者评估了两条不同的生物合成途径：天冬氨酸氨基转移酶（AspC）依赖途径和天冬氨酸解氨酶（AspA）依赖途径。AspC催化草酰乙酸与L-谷氨酸的可逆转氨反应生成L-天冬氨酸和α-酮戊二酸，而AspA直接将延胡索酸和铵离子（NH4+）转化为L-天冬氨酸。据此，分别过表达aspC和aspA基因构建了菌株Thr09和Thr10。Thr09（AspC过表达）未观察到L-苏氨酸产量的改善（图2b）。相比之下，Thr10（AspA过表达）的L-苏氨酸产率显著提升（0.73 mol L-苏氨酸/mol葡萄糖），较Thr08提高了39.7%（图2b）。这些结果表明，以NH4+为氨基供体增强AspA活性，可有效将碳流从TCA循环转向L-苏氨酸生物合成途径。
在L-苏氨酸合成模块中，经过多轮基因组整合ThrA、ThrB、ThrC、Asd和Ppc，这些关键酶的表达水平得到增强。AspA的过表达增加了L-天冬氨酸的供应，有助于L-苏氨酸产率的提高。最终，优化后的无质粒L-苏氨酸合成模块（菌株Thr10）实现了0.73 mol L-Thr/mol葡萄糖的高产率，较实验室前期双质粒L-苏氨酸模块菌株（0.51 mol L-Thr/mol葡萄糖）提高了43%（Shi et al., 2025）。
【数据】Thr03产率：0.12 mol L-Thr/mol glucose；Thr06产率：0.45 mol L-Thr/mol glucose（较Thr03提高275%）；Thr08产率：0.52 mol L-Thr/mol glucose（较Thr06提高15.6%）；Thr10产率：0.73 mol L-Thr/mol glucose（较Thr08提高39.7%，较双质粒模块提高43%）；基因整合位点：pflB、ldhA、lpxM、poxB、adhE
3.2 L-苏氨酸模块与L-异亮氨酸模块的整合
L-异亮氨酸合成模块通过过表达ilvGM、ilvC、ygaZH和ilvA组装。携带质粒pXB1k-ilvA和pLB1S-ilvGM-ilvC-ygaZH的菌株Thr10产生了3.2 mM的L-异亮氨酸。在此基础上，通过删除内源和已引入的rhtC基因，并在119启动子控制下过表达ilvA（催化L-苏氨酸脱氨生成2-氧代丁酸），构建了菌株Ile01。Ile01/pXB1k-ilvA+pLB1S-ilvGM-ilvC-ygaZH的L-异亮氨酸产率（0.09 mol L-Ile/mol葡萄糖）比Thr10/pXB1k-ilvA*+pLB1S-ilvGM-ilvC-ygaZH提高了39.68%（图3a）。
IlvE和IlvD催化L-异亮氨酸生物合成途径的最后两步。为增强ilvE和ilvD的表达，ilvEDA操纵子的天然启动子被替换为强tac启动子，构建菌株Ile02，L-异亮氨酸产率提升至0.30 mol L-Ile/mol葡萄糖，较携带相同质粒（pXB1k-ilvA*+pLB1S-ilvGM-ilvC-ygaZH）的对照菌株Ile01提高了244.3%（图3a）。然而，副产物L-缬氨酸也随之积累，L-Ile/(L-Ile + L-Val)比值从0.94降至0.48。IlvED是L-异亮氨酸和L-缬氨酸生物合成途径的共享酶，因此简单增强ilvED表达不仅强化了L-异亮氨酸合成，也导致了副产物L-缬氨酸的积累。
为解决L-缬氨酸积累问题，研究者限制了胞内丙酮酸的可用性。编码丙酮酸激酶I和II的基因pykF和pykA被敲除，以调节从PEP到丙酮酸的糖酵解通量，分别构建菌株Ile03和Ile04。与Ile02相比，Ile03和Ile04的L-异亮氨酸产率均有所提高，L-Ile/(L-Ile + L-Val)比值也更高，分别为0.92（ΔpykF）和0.64（ΔpykA）。值得注意的是，Ile03的提升更为显著，产率达到0.35 mol L-Ile/mol葡萄糖（图3b），这与课题组前期研究一致，表明丙酮酸供应调控策略在提高L-Ile产量和降低L-Val积累方面是有效的。
在大肠杆菌中，支链氨基酸的摄取由BrnQ转运蛋白介导（Hao et al., 2024; Zhu et al., 2020）。通过删除brnQ基因……
【数据】Thr10+质粒产L-Ile：3.2 mM；Ile01产率：0.09 mol L-Ile/mol glucose（较Thr10+质粒提高39.68%）；Ile02产率：0.30 mol L-Ile/mol glucose（较Ile01提高244.3%）；Ile03产率：0.35 mol L-Ile/mol glucose；L-Ile/(L-Ile+L-Val)比值：Ile01为0.94，Ile02为0.48，Ile03（ΔpykF）为0.92，Ile04（ΔpykA）为0.64；敲除基因：pykF、pykA、brnQ
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程成功开发了一株高效生产L-异亮氨酸的大肠杆菌菌株。PtsG依赖的前体平衡途径首次被构建并应用于L-异亮氨酸生产。减弱TCA循环通量以减少碳损失，在充足供应L-谷氨酸作为氨基供体的前提下，可进一步提升L-异亮氨酸产率。工程化转运系统和协调酶表达等策略也被用于构建L-异亮氨酸生产菌株。最终，工程菌株Ile17/pSB1a-ilvGM-ilvC实现了0.67 mol L-Ile/mol葡萄糖的L-异亮氨酸产率，这是迄今报道的葡萄糖基L-Ile生物合成的最高产率。总体而言，本研究为从葡萄糖提高L-异亮氨酸产率提供了一种可行且高效的策略。
编译者解读
本研究最值得称道之处在于"前体平衡"的系统思维——不是单纯强化合成途径，而是从碳代谢全局出发，通过PtsG依赖路径实现磷酸烯醇式丙酮酸的分流，使一个分子导向丙酮酸、另一个导向2-氧代丁酸。这种精准的代谢分配策略直击L-异亮氨酸低产率的根本瓶颈。TCA循环通量减弱配合亮氨酸脱氢酶解决谷氨酸短缺的设计也体现了代谢网络的整体协调性。不过，多轮染色体整合虽然提高了遗传稳定性，但菌株生长性能的轻微下降提示代谢负担仍需关注。0.67 mol/mol的产率虽为目前最高，但距离理论产率仍有提升空间，工业放大中的鲁棒性也有待验证。
参考来源
Huo, X. (2026). Precursor balancing by reprogramming pyruvate synthesis for high-yield l-isoleucine production in engineered Escherichia coli. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134270
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134270