来源：Multifaceted metabolic engineering of Streptomyces hygroscopicus for milbemycins overproduction（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
米尔贝霉素是一类16元大环内酯类抗生素，在农业和兽医害虫防治领域应用广泛，但工业发酵产量长期受限。本研究以吸水链霉菌SIPI-054为对象，通过三步迭代策略——竞争通路删除、基因簇多拷贝整合、动态CRISPRi调控——实现米尔贝霉素A3/A4摇瓶产量达6.14 g/L，较原始菌株提升3.4倍，为链霉菌天然产物的工业化改造提供了可推广的系统性框架。
研究背景
米尔贝霉素由多种链霉菌产生，其中A3和A4组分的广谱杀螨、杀线虫活性最强，且对哺乳动物毒性低、环境相容性好。米尔贝霉素肟（milbemycin oxime）作为半合成衍生物已广泛用于宠物寄生虫治疗。然而，现有工业菌株多通过紫外诱变、NTG化学诱变、EMS和ARTP等随机诱变手段获得，虽能提升产量，但存在随机性强、劳动强度大、突变积累后进入产量平台期等固有问题。因此，理性代谢工程成为突破产量瓶颈的关键路径。本研究基于基因组与转录组数据，对米尔贝霉素生产菌株吸水链霉菌SIPI-054实施系统性代谢工程改造。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
吸水链霉菌SIPI-054及其衍生菌株在MB琼脂培养基（蔗糖4 g/L、脱脂奶粉1 g/L、酵母提取物2 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.2）上、28°C条件下培养制备孢子；在M-ISP4培养基（胰蛋白胨2 g/L、酵母提取物1 g/L、大豆粉5 g/L、甘露醇5 g/L、淀粉5 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L、CaCO₃ 2 g/L、NaCl 1 g/L、缬氨酸0.5 g/L、FeSO₄ 0.1 mg/L、MnCl₂ 0.1 mg/L、ZnSO₄ 0.1 mg/L、琼脂20 g/L）中添加100 mM MgCl₂用于属间接合转移。大肠杆菌菌株（DH5α、BL23、EPI300和S17-1）在37°C的LB液体或琼脂培养基中培养。DH5α用于质粒构建，BL23用于含米尔贝霉素BGC的BAC质粒（pCL01-mil）编辑，S17-1作为供体菌株用于大肠杆菌与吸水链霉菌SIPI-054间的属间接合转移。根据需要，培养基中添加抗生素浓度如下：卡那霉素50 μg/mL、阿普拉霉素50 μg/mL、壮观霉素50 μg/mL、萘啶酸25 μg/mL。
【数据】培养基：MB（蔗糖4 g/L、脱脂奶粉1 g/L、酵母提取物2 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.2）；M-ISP4（胰蛋白胨2 g/L、酵母提取物1 g/L、大豆粉5 g/L、甘露醇5 g/L、淀粉5 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2 g/L、K₂HPO₄ 1 g/L、CaCO₃ 2 g/L、NaCl 1 g/L、缬氨酸0.5 g/L、FeSO₄ 0.1 mg/L、MnCl₂ 0.1 mg/L、ZnSO₄ 0.1 mg/L、琼脂20 g/L）；温度：28°C（链霉菌）/37°C（大肠杆菌）；抗生素：卡那霉素50 μg/mL、阿普拉霉素50 μg/mL、壮观霉素50 μg/mL、萘啶酸25 μg/mL；MgCl₂：100 mM
2.2 基因组测序与注释
SIPI-054基因组采用PacBio Sequel II平台结合微生物测序方案进行测序，数据用SMRT Link 8.0软件处理。测序数据分别用pb_assembly_microbial（来自SMRT Link 10）、hifiasm和Canu（v2.2）进行组装。蛋白质编码基因用Glimmer（v3.02）预测，聚焦细菌、古菌和病毒等微生物基因组。SIPI-054的全部基因组数据及相关信息已提交至NCBI，GenBank登录号为CP109672.1。
【数据】测序平台：PacBio Sequel II；组装软件：pb_assembly_microbial、hifiasm、Canu（v2.2）；基因预测：Glimmer（v3.02）；GenBank登录号：CP109672.1
2.3 RNA测序与基因表达定量
分别在第3、5、7、9天收集SIPI-054发酵液。使用RNeasy Mini Kit（Qiagen，美国）提取总RNA，每个时间点设三个生物学重复。RNA-seq文库按标准文库制备方案构建，在Illumina NovaSeq 6000平台测序。基因表达水平通过比对测序读段并用StringTie软件定量各基因区段内片段数获得。所得计数用TMM（Trimmed Mean of M-values）算法归一化。基因表达水平进一步用FPKM（Fragments Per Kilobase Million）指标表征，计算公式为：总外显子片段数/（百万比对读段数×外显子长度（kb））。原始RNA-seq数据已提交至GSA数据库（Genome Sequence Archive，https://bigd.big.ac.cn/gsub/，登录号CRA020686）。
【数据】取样时间点：第3、5、7、9天；RNA提取：RNeasy Mini Kit（Qiagen）；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；定量软件：StringTie；归一化：TMM算法；表达指标：FPKM；GSA登录号：CRA020686
2.4 基于iCASRED的BAC质粒pCL01-mil无痕编辑
携带一至三套不同位点特异性整合系统的BAC质粒pCL01-mil，通过前述报道的iCASRED编辑方法在大肠杆菌BL23中获得。具体而言，将含有pCL01-mil特异性sgRNA和同源臂（约500 bp）的一体化编辑质粒（pTarget，补充表S2）电转入阿拉伯糖诱导的BL23/pCL01-mil感受态细胞中。Cas9诱导的双链断裂通过λRed介导的同源重组利用提供的同源臂进行修复，实现无痕序列替换或插入。编辑完成后，编辑质粒通过IPTG诱导染色体整合的靶向sgRNA表达而被有效消除，从而便于后续多轮迭代工程操作。
【数据】同源臂长度：约500 bp；编辑系统：iCASRED（Cas9 + λRed）；质粒消除：IPTG诱导；宿主菌：大肠杆菌BL23
2.5 基因或基因簇删除突变株的构建
所有删除突变株均使用本实验室此前建立的V-F型CRISPR/Cas核酸酶AsCas12f1介导的基因编辑系统构建。质粒构建过程如下：将两个24 nt寡核苷酸体外退火生成间隔序列的双链DNA（dsDNA），随后通过Gibson组装连接到BbsI线性化的pCas12f1载体中，构建靶向载体。接着，以吸水链霉菌SIPI-054基因组为模板，用对应引物（列于表S1）扩增同源臂（各约2.5 kb）。两个同源臂通过重叠PCR连接。所得片段通过Exnase II一步克隆试剂盒（Vazyme，中国）无缝克隆至EcoRI线性化的靶向载体（如pCas12f1-sg42）中，获得编辑质粒（如pCas12f1-sg42/HA42）。这些编辑质粒分别通过接合转移实验导入吸水链霉菌SIPI-054。接合子用表S2所列引物进行菌落PCR验证，随后对扩增产物进行Sanger测序确认。在多轮迭代编辑过程中，每轮编辑质粒通过在37°C连续传代消除，利用其温度敏感复制子（pSG5 ori）。
【数据】编辑系统：AsCas12f1；间隔序列长度：24 nt；同源臂长度：约2.5 kb；克隆试剂盒：Exnase II One-Step Cloning Kit（Vazyme）；质粒消除：37°C连续传代；复制子：pSG5 ori（温度敏感）
2.6 生长曲线测定
SIPI-054生长曲线采用二苯胺法测定。首先，将在MB琼脂培养基上30°C培养7天的SIPI-054琼脂培养物（约1 cm²大小）接种至液体种子培养基中。所得菌悬液在28°C、220 rpm条件下培养约24小时，随后将4%（1 mL）培养物转接至含30 mL发酵培养基的摇瓶中。其次，每24小时从每个摇瓶中收集100 μL样品。第三，向每个样品中加入1 mL新鲜配制的二苯胺比色液（1.5 g二苯胺、100 mL冰醋酸、1.5 mL浓硫酸、1 mL 1.6%乙醛）。混合物在60°C水浴中孵育1小时，期间定期振荡混匀，随后8000 g离心5分钟。最后，取150 μL上清液转移至96孔板，在595 nm处测定吸光度。
【数据】培养温度：30°C（琼脂培养）/28°C、220 rpm（液体培养）；培养时间：7天（琼脂）/24小时（种子）/每24小时取样；接种量：4%（1 mL/30 mL）；二苯胺比色液：1.5 g二苯胺、100 mL冰醋酸、1.5 mL浓硫酸、1 mL 1.6%乙醛；水浴：60°C、1小时；离心：8000 g、5分钟；检测波长：595 nm
2.7 乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A水平测定
为定量米尔贝霉素生物合成所需两个关键前体的胞内库，分别在第3、6、9天收集1 mL发酵液，分为两份等量样品。一份（500 μL）在4°C下8000 g离心5分钟。沉淀经洗涤后重悬于0.1 M PBS缓冲液（生工生物，上海，中国）中。悬液进行冰浴超声破碎（120 W，5秒开/10秒关，总时长5分钟）。裂解液在4°C下10,000 g离心30分钟，收集上清液，适当稀释后用于代谢物定量。乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A浓度使用商业ELISA试剂盒（双赢生物，上海，中国）按制造商说明测定，A-CoA和M-CoA测定的标准曲线见补充图S11。剩余500 μL等分样品用于细胞干重（CDW）测定。代谢物水平按对应样品的CDW归一化，获得单位质量浓度。所有测定均设三次独立生物学重复。
【数据】取样时间：第3、6、9天；离心：8000 g、5分钟、4°C（细胞收集）/10,000 g、30分钟、4°C（裂解液）；超声破碎：120 W、5秒开/10秒关、总时长5分钟；PBS缓冲液：0.1 M；检测方法：ELISA试剂盒（双赢生物）；归一化：细胞干重（CDW）
2.8 米尔贝霉素A3/A4的HPLC分析
发酵结束后，收集500 μL培养液，加入1.5 mL无水乙醇。混合物超声提取30分钟。随后8000 g离心5分钟。取适量上清液经0.45 μm有机微孔滤膜过滤。最后，米尔贝霉素A3/A4浓度用HPLC分析（高效液相色谱，SHUMADZU DGA-20A）定量。HPLC分析条件如下：Hypersil-C18色谱柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）……
【数据】样品量：500 μL培养液；提取：1.5 mL无水乙醇、超声30分钟；离心：8000 g、5分钟；滤膜：0.45 μm有机微孔滤膜；色谱柱：Hypersil-C18（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；仪器：SHUMADZU DGA-20A
研究结果
3.1 多组学分析鉴定吸水链霉菌SIPI-054中的竞争通路
米尔贝霉素生产菌株吸水链霉菌SIPI-054是野生型菌株NRRL 5739（无基因组序列）经多轮物理和化学诱变获得的衍生菌株。本研究进行了全基因组测序以表征SIPI-054的基因组特征，结果显示其基因组序列全长为12,063,392 bp，GC含量70.72%，与另一株米尔贝霉素生产菌株S. bingchenggensis BCW-1的基因组相似。基因组为单条线性染色体，编码10,648个预测蛋白编码基因。antiSMASH序列分析预测存在48个推定次级代谢物BGC，主要分布在染色体臂上，包括21个聚酮合酶（PKS）样BGC、22个非核糖体肽合成酶（NRPS）样BGC和10个萜类BGC，其中若干为含多个生物合成模块的杂合类型。值得注意的是，其中10个PKS基因簇与已知抗生素BGC的相似性超过76%，提示其可能产生结构类似化合物。通过与已报道的S. bingchenggensis BCW-1序列进行比对分析，SIPI-054中的region 6和region 7被定位并确认为共同构成完整的米尔贝霉素BGC（mil BGC）。
为系统鉴定可能与米尔贝霉素生物合成竞争细胞资源的次级代谢物BGC，我们对SIPI-054发酵过程进行了转录组分析（图2A）。转录谱突出显示了三个预测BGC：region 35、region 42和region 48。Region 35此前被鉴定为II型PKS BGC（kel BGC），编码一种结构未鉴定的黄色化合物。mil-BGC与kel-BGC之间的代谢竞争已被证实。然而，kel BGC内的调控基因（kelR）正向调控米尔贝霉素生物合成，因此需要精确的编辑策略。Region 42和region 48分别被预测编码I型PKS和杂合I型PKS/NRPS基因簇。虽然其具体产物尚未表征，但转录组数据显示它们含有活跃转录的PKS基因（图2A和补充表S4），提示其可能消耗胞内前体库（如乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A）。Region 24也表现出高转录活性，但该基因簇与孢子颜色形成相关，因此被排除在删除靶标之外以维持菌株产孢能力。最终，region 35、42和48被选为基因组简化的一级竞争靶标。
【数据】基因组大小：12,063,392 bp；GC含量：70.72%；编码基因数：10,648；预测BGC数：48个（PKS样21个、NRPS样22个、萜类10个）；与已知BGC相似性>76%的PKS簇：10个；mil BGC组成：region 6 + region 7；竞争靶标：region 35（kel BGC）、region 42、region 48
3.2 竞争通路的靶向删除
基于组学指导的靶标，我们使用CRISPR/AsCas12f1系统实施了基因组简化策略。首先，分别删除了上述三个基因簇，即region 35（kel BGC）、region 42和region 48（补充图S1、S2和S3）。值得注意的是，为在删除kel BGC时消除前体竞争同时保留正调控作用，我们特意删除了高表达的结构基因（kelB、kelC和kelD），但保留了正调控基因kelR。结果显示，三个基因簇的单独删除均使米尔贝霉素A3/A4产量提高约20%（图2B）。
除移除外部竞争基因簇外，我们还探索了mil BGC内部的“冗余”区域（62 kb，图S4A）以精简基因簇。尽管同源的meridamycin BGC中类似的中央间隔区被证明与抗生素产生无关，但在SIPI-054中删除该62 kb区域却意外导致抗生素产量和细胞生物量均严重降低（图2B、C和补充图S4C）。转录组分析揭示该区域内存在一个高度共转录的操纵子（命名为transABC），编码两个ABC家族转运蛋白和一个α/β水解酶（NlhH）（补充图S4B）。进一步的遗传学研究表明，破坏该操纵子（ΔtransABC）导致米尔贝霉素产量显著降低，生物量也较亲本菌株SIPI-054明显下降。将transABC操纵子回补至突变株中，抗生素产量和生物量均恢复至与SIPI-054相当的水平（图2B、F和补充图S4C）。上述结果明确表明transABC操纵子对米尔贝霉素生物合成和细菌生长均至关重要。然而，在突变株和亲本菌株中米尔贝霉素均主要存在于胞内，提示这些转运蛋白并非作为米尔贝霉素外排泵发挥作用。鉴于NlhH与参与农药解毒的羧酸酯酶具有同源性，这些发现提示该操纵子可能在细胞自我保护中发挥关键作用——可能通过解毒或外排有毒代谢中间体，而非直接促进米尔贝霉素的外排。因此，该62 kb区域被认定为必需区域并保留在底盘菌株中。
通过整合这三个有效删除，我们获得了最终工程菌株Δkel-42-48（命名为SIPI-A）。摇瓶发酵中，工程菌株的米尔贝霉素A3/A4产量达到2470.6 ± 106.4 mg/L，较起始菌株SIPI-054（1840.9 ± 85.78 mg/L）提高约34.2%，且生长性能无显著差异（图2B和C）。为验证产量提升是否源于前体可用性改善，我们监测了乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的胞内浓度。与假设一致，SIPI-A在整个发酵过程中两种酰基辅酶A水平均持续高于亲本菌株（图2D和E）。这些结果证实，消除特定竞争通路可有效将代谢流重新导向米尔贝霉素生物合成，为进一步工程改造提供了精简底盘。
【数据】单基因簇删除增产：约20%；SIPI-A产量：2470.6 ± 106.4 mg/L；SIPI-054产量：1840.9 ± 85.78 mg/L；增产幅度：约34.2%；62 kb区域删除：产量和生物量严重降低；transABC回补：恢复至亲本水平
3.3 米尔贝霉素BGC在底盘菌株SIPI-A中的多拷贝整合
化合物产量通常与限速酶转录水平正相关，因此我们假设在染色体上稳定整合额外的mil BGC拷贝将驱动更多代谢流向目标产物。本研究在底盘菌株SIPI-A基础上，通过增加其生物合成途径的基因剂量来进一步提高米尔贝霉素产量。首先，为评估在不同染色体位点整合额外BGC拷贝对米尔贝霉素产量的影响，我们将pCL01-mil质粒中的φC31整合酶/attP系统替换为其他四种正交整合酶（φBT1、TG1、R4和SV1），分别获得四个重组质粒：pCL01-mil-B、pCL01-mil-T、pCL01-mil-R和pCL01-mil-S（补充图S5）。将它们导入SIPI-A获得相应工程菌株（图3A）。
发酵实验显示，引入第二个mil BGC拷贝可不同程度地提高米尔贝霉素A3/A4产量，具体提升幅度取决于整合位点。在TG1 attB位点整合mil BGC的工程菌株（SIPI-TG1-mil）产量最高，达到3717.9 ± 101.3 mg/L，较底盘菌株（SIPI-A）提高71.1%（图3B）。相比之下，在SV1 attB位点整合对米尔贝霉素A3/A4产量的提升幅度最小，可能归因于染色体位置效应对mil BGC表达的影响。为确认……
【数据】SIPI-TG1-mil产量：3717.9 ± 101.3 mg/L；较SIPI-A提高：71.1%；整合位点：φBT1、TG1、R4、SV1（替换φC31）；最佳整合位点：TG1 attB
讨论与解读
工业微生物生产菌株的传统改造依赖迭代随机诱变。虽然这种经验性方法成功获得了如吸水链霉菌SIPI-054等高产菌株，但不可避免地导致“产量平台期”——表现为有害突变积累和基因组景观紊乱。本研究表明，突破这一限制需要的不是进一步诱变，而是系统性的、基于组学信息的理性再设计。通过整合基因组精简、BGC扩增和动态通量控制，米尔贝霉素A3/A4产量提升3.4倍，达到6.14 g/L，为迄今报道的最高摇瓶产量。更重要的是，这项工作为系统改造传统工业菌株建立了通用框架，证明即使是高产突变株也可以通过系统性的多层合成生物学和代谢工程策略进一步提升。
多组学指导的基因组简化证实，删除三个高表达的竞争BGC（kel、region 42和region 48）可有效将酰基辅酶A前体重定向至米尔贝霉素生物合成，显著提高产量。在删除kel BGC时，保留正调控基因kelR同时删除结构基因的策略，展示了精细编辑在平衡竞争消除与正调控维持中的重要性。动态CRISPRi系统通过群体感应响应启动子驱动，实现了对TCA循环柠檬酸合酶和脂肪酸合成途径β-酮脂酰-ACP合酶的可逆抑制，避免了永久敲除带来的生长缺陷。
【编译者解读】本研究展示了“竞争通路删除→基因剂量放大→动态调控”三步走策略在工业放线菌中的系统应用价值。亮点在于动态CRISPRi设计——用群体感应启动子驱动可逆抑制，兼顾了前体通量提升与菌体生长维持，这种“按需调控”思路对其它大环内酯类抗生素的菌株改造具有直接借鉴意义。62 kb“冗余”区域的意外发现也提醒我们，基因组精简不能仅凭序列预测，功能验证不可或缺。局限在于动态调控系统的响应时序与发酵工艺的匹配仍需进一步优化。
参考来源
Xu, J. Multifaceted metabolic engineering of Streptomyces hygroscopicus for milbemycins overproduction. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.04.006
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.04.006