来源：Characterization and functional analysis of FruR in Streptomyces lincolnensis: A pleiotropic regulator that links fructose metabolism to lincomycin biosynthesis（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
糖类碳源对链霉菌次级代谢的调控长期备受关注，但果糖如何影响林可霉素生物合成，其分子机制尚不清楚。本研究以林可霉素产生菌——林肯链霉菌为对象，发现外源果糖以浓度依赖方式抑制林可霉素产量，并鉴定出DeoR家族转录调控因子FruR为这一抑制效应的核心介导者。FruR不仅直接抑制自身果糖代谢操纵子的转录，还直接结合林可霉素生物合成基因lmbA的启动子区域，阻断其表达。研究还揭示FruR参与调控碳代谢、脂肪酸合成及氧化应激相关基因，确立其作为连接初级代谢与次级代谢的多效调控因子的地位。
研究背景
链霉菌是天然活性产物的丰富来源，约三分之二的已知天然抗生素由该类菌产生。除抗生素外，链霉菌还合成抗真菌剂、抗寄生虫剂、免疫抑制剂及抗肿瘤药物等多种化合物，在医药和农业领域具有重要应用价值。次级代谢产物的生物合成受到多种转录因子的严密调控，依据功能可分为全局调控因子、多效调控因子和途径特异性调控因子，三者共同构成复杂的调控网络。碳源代谢作为能量和前体物质的主要供应途径，在此过程中发挥关键作用。初级代谢调控因子通过两种主要机制影响次级代谢：一是通过控制碳源摄取和利用来间接调节前体物质的可利用性；二是直接结合次级代谢生物合成基因簇中基因的启动子区域，激活或抑制其转录。然而，碳源代谢与次级代谢之间的直接分子联系仍有待深入解析。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
本研究所用细菌菌株和质粒列于附表S1。大肠杆菌菌株在LB培养基中、37°C条件下培养；林肯链霉菌分别使用ISP4培养基（可溶性淀粉10 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、NaCl 1 g/L、CaCO3 2 g/L、琼脂15 g/L，使用前每250 mL补加2.5 mL 2 M MgCl2、250 μL 1 g/L MnCl2·4H2O和250 μL 1 g/L ZnSO4·7H2O）、MS培养基（豆粉20 g/L、甘露醇20 g/L、琼脂20 g/L）、YEME培养基（蛋白胨5 g/L、酵母提取物3 g/L、麦芽提取物3 g/L、葡萄糖10 g/L、蔗糖340 g/L，使用前每25 mL补加62.5 μL 2 M MgCl2）、R2YE培养基（蔗糖103 g/L、MgCl2·6H2O 10 g/L、葡萄糖10 g/L、酵母提取物5 g/L、K2SO4 0.25 g/L、蛋白胨0.1 g/L、琼脂20 g/L，使用前每200 mL补加以下溶液：25 mL 57.3 g/L TES（pH 7.2）、20 mL 27.7 g/L CaCl2、3 mL 250 g/L L-脯氨酸、2.5 mL 5 g/L KH2PO4、1.25 mL 1 M NaOH、0.5 mL微量元素溶液（0.2 g/L FeCl3·6H2O、0.04 g/L ZnCl2、0.01 g/L CuCl2·2H2O、0.01 g/L MnCl2·4H2O、0.01 g/L Na2B4O7·10H2O和0.01 g/L (NH4)6Mo7O24·4H2O））或ISP2培养基（酵母提取物4 g/L、麦芽提取物10 g/L、葡萄糖4 g/L、琼脂20 g/L，pH 7.0），均在28°C培养。藤黄微球菌28001在培养基III（葡萄糖5 g/L、酵母提取物3 g/L、胰蛋白胨5 g/L、牛肉提取物10 g/L、NaCl 3.5 g/L、K2HPO4 3.68 g/L、KH2PO4 1.32 g/L、琼脂18 g/L）中、37°C培养。根据需要添加抗生素，终浓度分别为：卡那霉素50 μg/mL、阿普拉霉素50 μg/mL或萘啶酸10 μg/mL。
【数据】培养基：LB/ISP4/MS/YEME/R2YE/ISP2/培养基III；温度：28°C（链霉菌）/37°C（大肠杆菌、藤黄微球菌）；抗生素浓度：卡那霉素50 μg/mL、阿普拉霉素50 μg/mL、萘啶酸10 μg/mL
2.2 生物信息学分析
使用BLASTp（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）鉴定FruR同源蛋白。多序列比对使用ClustalW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw）完成，并用ESPript 3.0（https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php）可视化。系统发育分析采用MEGA 11中的最大似然法进行，所得进化树用iTOL（https://itol.embl.de/）注释。FruR-PfruR复合物结构使用AlphaFold3（https://alphafoldserver.com/）预测，并在PyMol中可视化。
【数据】分析工具：BLASTp、ClustalW、ESPript 3.0、MEGA 11（最大似然法）、iTOL、AlphaFold3、PyMol
2.3 突变菌株构建
本研究利用CRISPR/Cas9系统敲除fruR基因。简要步骤为：以林肯链霉菌基因组为模板，分别使用引物UfruR-F/R和DfruR-F/R扩增fruR的上游和下游同源臂。为引入sgRNA编码序列，使用引物sgfruR和UfruR-R对上游臂进行二次扩增。将含sgRNA序列的上游臂和下游臂无缝克隆（ABclonal）至经SpeⅠ和HindⅢ（Yeasen）线性化的pKCcas9dO载体中。所得重组质粒pKCcas9dfruR经测序验证后，通过接合转移导入林肯链霉菌。接合子通过菌落PCR筛选并经测序确认。为消除敲除质粒，菌株在YEME培养基中、37°C传代两次。基因破坏后，fruR残留1–80 bp片段，用于后续实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析。使用引物fruRn-F/R从林肯链霉菌基因组扩增fruR编码序列及其启动子区域。PCR产物与pIB139质粒分别用NsiⅠ和EcoRⅠ（Yeasen）酶切。另使用引物fruR-F/R扩增fruR编码序列，PCR产物与pIB139分别用NdeⅠ和EcoRⅠ（Yeasen）酶切。经T4 DNA连接酶（Takara）连接后，构建重组质粒pIBPNfruR和pIBfruR并经测序验证。为构建fruR回补菌株（CfruR）和过表达菌株（OfruR），将pIBPNfruR和pIBfruR分别导入ΔfruR菌株和野生型菌株，整合至φC31 attB位点。接合子通过菌落PCR筛选并经测序确认。
【数据】敲除方法：CRISPR/Cas9；载体：pKCcas9dO；限制酶：SpeⅠ、HindⅢ、NsiⅠ、EcoRⅠ、NdeⅠ；回补/过表达载体：pIB139；整合位点：φC31 attB；传代条件：YEME培养基、37°C、两次
2.4 发酵与林可霉素生物检测
将林肯链霉菌孢子悬液划线于MS琼脂平板，28°C培养4天。切取1 cm × 1 cm菌丝体琼脂块，转接至25 mL SFPⅠ培养基（玉米浆30 g/L、可溶性淀粉20 g/L、葡萄糖10 g/L、(NH4)2SO4 1.5 g/L、豆粉1 g/L、CaCO3 4 g/L，pH 7.2），28°C、200 rpm振荡培养4天。随后取1 mL培养物转接至25 mL SFPⅡ培养基（葡萄糖105 g/L、豆粉20 g/L、NaNO3 8 g/L、(NH4)2SO4 6 g/L、NaCl 5 g/L、玉米浆3.5 g/L、K2HPO4 0.025 g/L、CaCO3 8 g/L，pH 7.8），在相同条件下继续培养6天。补加果糖的发酵培养基与SFPⅡ类似，即在调节pH至7.8之前向SFPⅡ培养基中加入不同质量的果糖。林可霉素生物检测以藤黄微球菌28001为指示菌。发酵液以12,000 rpm离心5 min，收集上清液用于分析。将藤黄微球菌悬液与培养基III在55°C混合后倒入平板。凝固后放置牛津杯，加入190 μL样品或林可霉素标准溶液（4、6、8、10、12和14 μg/mL）。平板在37°C培养18 h，测量抑菌圈直径。以抑菌圈直径对林可霉素浓度的自然对数绘制标准曲线，根据标准曲线确定样品浓度。残糖浓度使用葡萄糖浓度分析仪（SBA-40C）测定，残留果糖浓度采用间苯二酚比色法测定。
【数据】SFPⅠ培养：28°C、200 rpm、4天；SFPⅡ培养：28°C、200 rpm、6天；离心：12,000 rpm、5 min；林可霉素标准品：4–14 μg/mL；生物检测：37°C、18 h；葡萄糖测定：SBA-40C分析仪；果糖测定：间苯二酚比色法
2.5 RNA提取与qRT-PCR
从SFPⅡ培养基中培养第2、4、6天收集的林肯链霉菌菌体中提取总RNA。细胞沉淀在液氮中充分研磨，随后使用TRIzol试剂（Thermo Fisher）提取RNA。为消除残留基因组DNA，样品经DNaseⅠ（Takara）处理。cDNA合成以800 ng总RNA为模板，使用M-MLV逆转录酶（Takara）在10 μL反应体系中进行。qRT-PCR按照作者此前研究描述的方法进行，以持家sigma因子基因hrdB作为内参。相对基因表达水平采用2-ΔΔCT方法分析。设置三个独立生物学重复。
【数据】RNA提取：TRIzol法；DNaseⅠ处理；cDNA合成：800 ng总RNA、10 μL体系、M-MLV逆转录酶；内参基因：hrdB；分析方法：2-ΔΔCT；生物学重复：3次
2.6 蛋白纯化与凝胶迁移率变动分析（EMSA）
使用引物exfruR-F/R从林肯链霉菌基因组扩增fruR编码序列。PCR产物与表达载体pET28a(+)分别用NdeⅠ（Yeasen）和BamHⅠ（Thermo Fisher）酶切，经T4 DNA连接酶（Takara）连接。重组质粒pETfruR经测序验证。蛋白纯化时，将pETfruR转化至大肠杆菌BL21(DE3)。菌株在LB培养基中37°C培养至OD600约0.6，加入0.5 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，16°C孵育16 h。收集菌体，用PBS缓冲液（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4，pH 7.4）洗涤，超声破碎后取上清进行Ni-NTA亲和层析。His6-FruR蛋白透析至EMSA结合缓冲液（10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、5%甘油，pH 8.0），用超滤离心管（Millipore）浓缩，Bradford法测定蛋白浓度。EMSA实验中，5 ng生物素标记DNA探针与不同浓度的His6-FruR蛋白在含0.05 μg/μL poly(dI-dC)（Sigma-Aldrich）的EMSA结合缓冲液中、28°C孵育……
【数据】表达载体：pET28a(+)；限制酶：NdeⅠ、BamHⅠ；诱导条件：0.5 mM IPTG、16°C、16 h；PBS缓冲液：137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4，pH 7.4；EMSA结合缓冲液：10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、5%甘油，pH 8.0；探针：5 ng生物素标记DNA；poly(dI-dC)：0.05 μg/μL；孵育温度：28°C
研究结果
3.1 果糖抑制林可霉素生物合成
果糖是一种普遍存在的天然碳水化合物，是链霉菌的主要碳源之一。尽管具有代谢相关性，果糖利用的调控机制仍未得到充分阐明，其特定影响次级代谢物生物合成的机制也鲜有探索。为评估果糖对林可霉素生物合成的影响，在SFPⅡ培养基中分别补加5、10和20 g/L果糖。随着果糖浓度的增加，林可霉素产量逐渐降低，呈现明显的浓度依赖性抑制效应（图1a和S1）。这些结果表明，外源果糖显著抑制林肯链霉菌中林可霉素的生物合成。基于这一观察，作者进一步研究了果糖介导抑制效应的分子机制。林肯链霉菌基因组分析鉴定出三个相邻基因——SLINC_3628（编码果糖特异性PTS转运蛋白FruA）、SLINC_3629（编码果糖-1-磷酸激酶FruK）和SLINC_3630（编码DeoR家族转录调控因子FruR）——为参与果糖代谢的候选基因（图1b）。RT-PCR分析证实fruR、fruK和fruA构成一个转录单元，命名为fru操纵子（图1c）。此外，qRT-PCR显示果糖补加显著上调fruR的表达（图1d和e），表明果糖激活果糖代谢途径。值得注意的是，FruR作为DeoR家族调控因子，可能是果糖信号的中枢介导者，在抑制林可霉素生物合成中发挥关键作用。
【数据】果糖补加浓度：5、10、20 g/L；效应：浓度依赖性抑制林可霉素产量；基因：SLINC_3628（fruA）、SLINC_3629（fruK）、SLINC_3630（fruR）；操纵子结构：fruR-fruK-fruA单转录单元
3.2 FruR在链霉菌属中广泛分布
鉴于FruR在果糖介导的林可霉素生物合成抑制中可能发挥关键作用，对FruR进行了生物信息学分析。fruR基因全长762个核苷酸，编码253个氨基酸的蛋白，分子量为27.0 kDa。该基因位于编码未表征主要协助转运蛋白（MFS）的SLINC_3631基因下游，位于fruK和fruA上游。作为DeoR家族转录调控因子，FruR具有N端DNA结合结构域和C端配体结合结构域。FruR同源蛋白在链霉菌属中广泛分布，且fruRKA基因排列高度保守，表明该调控模块在链霉菌中发挥保守功能（图2a、b和S2）。
【数据】fruR基因：762 bp；编码蛋白：253个氨基酸、27.0 kDa；结构域：N端DNA结合结构域、C端配体结合结构域；分布：链霉菌属广泛存在、fruRKA排列保守
3.3 FruR是林可霉素生物合成的负调控因子
为研究FruR在林可霉素生物合成中的调控作用，利用CRISPR/Cas9构建了fruR敲除菌株ΔfruR，基因缺失经PCR和测序确认（图3a、b和c）。发酵6天后，ΔfruR菌株的林可霉素产量较野生型（WT）菌株提高3.6倍（图3d）。为排除遗传操作的影响，用天然启动子驱动的fruR回补ΔfruR菌株，构建回补菌株CfruR，其林可霉素产量恢复至WT水平（图3d）。此外，向WT菌株引入额外拷贝的fruR（构建OfruR菌株）显著降低了林可霉素产量（图3d）。有趣的是，发酵6天后，ΔfruR菌株的残留葡萄糖高于WT菌株，而OfruR菌株低于WT菌株，提示FruR可能影响葡萄糖利用，从而影响林可霉素产量（图S3）。此外，在YEME培养基中的生长曲线分析显示，ΔfruR和OfruR菌株的生长均慢于WT菌株，表明FruR调控细胞生长（图3e）。然而，在MS和R2YE平板上的形态观察显示所有菌株之间没有变化，表明FruR不控制形态发育（图3f、g和S4）。这些结果表明FruR负调控林可霉素生物合成。
【数据】ΔfruR菌株产量：WT的3.6倍；回补菌株CfruR：恢复至WT水平；OfruR菌株：产量显著降低；生长：ΔfruR和OfruR均慢于WT；形态：无差异
3.4 FruR通过结合反向重复序列直接调控fru操纵子表达
转录调控因子常表现出自身激活或自身抑制效应，因此首先检测了FruR是否调控fru操纵子的表达。提取发酵第2、4、6天收集菌体的RNA，通过qRT-PCR分析fruR的表达水平（图4a）。结果显示，在全部三个时间点，ΔfruR菌株中fruR的表达均显著高于WT菌株（图4b）。与此一致，ΔfruR菌株在发酵第2天的果糖利用率显著高于WT菌株（图S5）。鉴于WT与ΔfruR菌株林可霉素产量的差异在发酵第4天最为显著，选取第4天的菌体进行后续qRT-PCR分析。此外，为进一步确认这一自身抑制效应，进行了靛蓝素合成酶报告实验。将PfruR启动子驱动的idgS-sfp（编码靛蓝素合成酶和磷酸泛酰巯基乙胺转移酶）整合至WT和ΔfruR菌株的φC31 attB位点。如图4c所示，ΔfruR菌株的靛蓝素产量显著高于WT菌株，表明PfruR的强度在ΔfruR菌株中显著增强，从而进一步证实FruR的自身抑制效应。为确定FruR是否直接调控fru操纵子，用纯化的His6-FruR蛋白与PfruR探针进行EMSA实验。如图4d和S6所示，His6-FruR特异性结合PfruR探针，证明FruR直接抑制fru操纵子的表达。进一步为阐明FruR调控林可霉素生物合成的机制，鉴定了FruR的结合基序。DNase I足迹实验揭示PfruR探针内存在两个不同的FruR保护区域（图4e和f）。对多个链霉菌种中fruR启动子序列的比较分析，在两个保护区域中均鉴定出一个潜在保守的反向重复序列，预测对FruR结合至关重要（图4f和S7）。随后对该反向重复序列进行定点突变并进行EMSA，结果显示完全破坏该序列后FruR丧失结合PfruR探针的能力，表明该反向重复序列即为FruR结合基序（图4g）。这些结果表明，FruR通过结合基序-GYCCGAACSTGT-直接抑制fru操纵子的表达。此外，序列分析显示PfruR中的两个FruR结合基序分别位于−35区上游和−10区下游（图4f）。基于这些观察，提出了一个推测性工作模型：两个FruR分子分别结合两个基序，形成二聚体并环绕启动子核心区域，从而可能阻止RNA聚合酶接近（图5a）。为验证该模型，使用AlphaFold3模拟了FruR-PfruR复合物的结构，显示FruR结合-GYCCGAACSTGT-位点并形成同源二聚体（图5b）。该机制的验证仍需进一步的结构和生化研究。
【数据】时间点：第2、4、6天；ΔfruR菌株fruR表达：三个时间点均显著高于WT；果糖利用率：ΔfruR第2天显著高于WT；报告实验：ΔfruR靛蓝素产量显著高于WT；结合基序：-GYCCGAACSTGT-（反向重复序列）；保护区域：2个；基序位置：−35区上游和−10区下游
3.5 FruR直接抑制林可霉素生物合成基因lmbA的表达
为阐明FruR调控林可霉素生物合成的机制，通过qRT-PCR分析了林可霉素生物合成（lmb）基因簇中关键基因的表达水平。如图6a所示，生物合成基因lmbA的表达在ΔfruR中显著上调，而调控基因lmbU和抗性基因lmrC的表达无变化。有趣的是，在lmbA启动子区域内鉴定出一个潜在的FruR结合位点-GCGCGAACGTGC-，EMSA证明His6-FruR能特异性结合PlmbA探针（图6b）。此外，靛蓝素合成酶报告实验确认……
【数据】lmbA表达：ΔfruR中显著上调；lmbU、lmrC表达：无变化；FruR结合位点：-GCGCGAACGTGC-（lmbA启动子内）；结合验证：EMSA特异性结合PlmbA探针
3.6 FruR调控碳代谢相关基因
除直接调控林可霉素生物合成基因外，FruR还调控参与碳代谢的多个基因。在aceE2、glmU和murQ的启动子区域均鉴定出FruR结合位点（图7a）。这些基因分别参与丙酮酸脱氢酶复合体、肽聚糖前体合成和N-乙酰胞壁酸代谢等碳代谢途径（图7b）。EMSA实验证实His6-FruR能够特异性结合paceE2、PglmU和PmurQ探针（图7c）。qRT-PCR分析显示，这些基因的表达在ΔfruR菌株中发生改变，表明FruR通过调控碳代谢基因影响碳通量和细胞生长。
【数据】靶基因：aceE2、glmU、murQ；结合验证：EMSA特异性结合对应探针；功能：碳代谢途径相关
3.7 FruR调控icmB、whiB和sigR
进一步实验揭示FruR还控制与脂肪酸合成（icmB）和氧化应激响应（sigR）相关的基因。在icmB、whiB和sigR的启动子区域均鉴定出FruR结合位点（图8a）。EMSA实验证实His6-FruR能够特异性结合PicmB、PwhiB和PsigR探针（图8b）。qRT-PCR分析显示这些基因的表达在ΔfruR菌株中发生变化（图8c），表明FruR在脂肪酸代谢和氧化应激响应中发挥广泛的生理调控作用。
【数据】靶基因：icmB、whiB、sigR；结合验证：EMSA特异性结合对应探针；功能：脂肪酸合成、氧化应激响应
3.8 FruR调控子
综合上述结果，FruR作为多效调控因子，直接调控自身操纵子（fru操纵子）、林可霉素生物合成基因（lmbA）、碳代谢基因（aceE2、glmU、murQ）以及脂肪酸合成和氧化应激相关基因（icmB、whiB、sigR），构成一个复杂的调控网络（图9）。
【数据】调控子成员：fru操纵子、lmbA、aceE2、glmU、murQ、icmB、whiB、sigR
讨论与解读
本研究鉴定出FruR为林肯链霉菌中连接果糖代谢与林可霉素生物合成抑制的新型多效调控因子。果糖以浓度依赖方式抑制林可霉素产量，FruR作为直接转录抑制因子，同时抑制自身操纵子和关键代谢靶基因的表达。其自身抑制机制涉及FruR结合自身启动子中的两个反向重复基序-GYCCGAACSTGT-，可能形成二聚体空间阻碍RNA聚合酶接近，DNase I足迹实验和AlphaFold3建模为该模型提供了证据。FruR直接抑制lmb簇关键生物合成基因lmbA的转录，这种直接转录控制模式与其他初级代谢调控因子存在相似性。FruR还调控碳代谢基因（aceE2、glmU、murQ）、脂肪酸合成基因（icmB）和氧化应激响应基因（sigR），表明其具有广泛的生理调控作用。这些发现将FruR定位为连接初级代谢与次级代谢的多效调控因子，为理解碳源依赖的次级代谢调控提供了新视角，也为代谢工程改造以提高林可霉素产量提供了潜在靶点。
【编译者解读】该研究采用"表型驱动—分子机制解析—调控网络扩展"的经典路径，从果糖抑制林可霉素产量的现象出发，逐步锁定FruR并阐明其直接结合靶基因启动子的分子机制。方法组合（CRISPR/Cas9敲除、EMSA、DNase I足迹、报告系统）严谨且互补，为研究初级代谢调控因子跨界调控次级代谢提供了范式。值得注意的是，FruR的多靶点特性使其成为代谢工程改造的潜在靶点——但作为负调控因子，其敲除虽可提高产量，也伴随生长减缓，实际应用时需权衡生物量积累与产物合成之间的平衡。后续若能在工业发酵条件下验证ΔfruR菌株的产量优势，将更具转化价值。
参考来源
期刊：Journal of Biotechnology, 2026
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.06.007
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.06.007