来源：An efficient endogenous type I-E CRISPR-Cas genome-editing platform for producing transglutaminase in Streptomyces mobaraensis（Engineering Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
转谷氨酰胺酶（TGase）是食品、医药和纺织工业中广泛使用的交联酶，茂原链霉菌是其工业化生产主力菌株，但缺乏高效基因组编辑工具长期制约菌株改造。本研究鉴定并改造了茂原链霉菌IPIO2的内源I-E型CRISPR-Cas系统，确定其PAM序列为5′-AAC-3′，构建了编辑效率达70%的单基因敲除和75–80%的大片段删除平台。利用该平台敲除四个与TGase产生负相关的基因后，酶产量提升8.5–18.5%；删除两个生物合成基因簇还使TGase产量额外增加17%。
研究背景
转谷氨酰胺酶（TGase）是一种具有工业重要性的交联酶，由Ando等人首次在茂原链霉菌中发现。该酶催化三种关键反应：酰基转移、脱酰胺以及谷氨酰胺残基（酰基供体）与赖氨酸残基（酰基受体）之间的蛋白质交联。这些催化活性使TGase成为食品、制药、纺织等行业不可或缺的生物催化剂，尤其广泛用于改善肉类、烘焙和豆制品等蛋白基食品的质地、结合性能和整体品质。
已有多种策略被用于提高TGase产量，包括诱变育种、培养基成分优化、发酵条件调控，以及启动子工程、基因拷贝数扩增、信号肽优化和调控基因操作等遗传工程策略。然而，工业化规模生产TGase仍面临挑战。组学驱动的代谢工程——特别是比较转录组学和蛋白质组学——已成为鉴定与产物合成相关酶和调控蛋白的有力手段，但缺乏高效基因组编辑工具限制了进一步菌株改良。
研究方法
菌株与培养条件
本研究所用细菌菌株列于表S1。野生型菌株茂原链霉菌IPIO2及其衍生菌株在高氏一号琼脂培养基（20 g/L可溶性淀粉、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O、0.5 g/L K₂HPO₄·3H₂O、0.5 g/L NaCl、1 g/L KNO₃·3H₂O、0.01 g/L FeSO₄·7H₂O、20 g/L琼脂）上于30°C培养产孢。接合和电转化实验中，使用ISP4琼脂培养基[10 g/L可溶性淀粉、2 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L K₂HPO₄·3H₂O、2 g/L CaCO₃、1 g/L NaCl、1 g/L MgSO₄·7H₂O、100 μL/L无机盐溶液（10 g/L ZnSO₄·7H₂O、10 g/L MnCl₂·4H₂O、10 g/L FeSO₄·7H₂O）、20 g/L琼脂]，补充5% 2 × YT肉汤（16 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）和20 mM MgCl₂，于30°C培养转化子。质粒构建和接合实验中，大肠杆菌DH5α和ET12567/pUZ8002在含适当抗生素的LB培养基或LB琼脂上于37°C培养。
【数据】培养基：高氏一号琼脂/ISP4琼脂/LB；温度：30°C（链霉菌）/37°C（大肠杆菌）；配方：20 g/L可溶性淀粉、0.5 g/L MgSO₄·7H₂O、0.5 g/L K₂HPO₄·3H₂O等；补充：5% 2 × YT、20 mM MgCl₂
内源CRISPR-Cas系统的生物信息学分析
为研究茂原链霉菌IPIO2的内源CRISPR-Cas系统，使用CRISPRCasFinder（https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/CrisprCasFinder/Index）以默认参数分析其基因组序列。分析鉴定出一个I-E型CRISPR-Cas位点。为确定前间隔序列邻近基序（PAM）序列，将鉴定到的CRISPR间隔序列提交至CRISPRTarget（http://bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/crispr_analysis.html）搜索匹配的前间隔序列。这些前间隔序列中频繁出现的侧翼序列被视为潜在PAM。所有侧翼序列（–8至–1 nt）使用WebLogo（https://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）进行比对和可视化，以展示序列保守性和基序分布。
【数据】分析工具：CRISPRCasFinder（默认参数）、CRISPRTarget、WebLogo；序列范围：–8至–1 nt
质粒干扰实验
质粒干扰实验用于验证内源CRISPR-Cas系统的靶向切割活性（图S1）。干扰质粒通过将间隔序列15（S15）或间隔序列10（S10）插入整合载体pSET152构建。含有S15或S10序列的寡核苷酸经合成并带有5′-三核苷酸（NNN）延伸。带有XbaI和EcoRI相容性末端的互补寡核苷酸经设计后，于95°C加热10 min退火，随后缓慢冷却至16°C。所得双链DNA片段连接到XbaI/EcoRI（货号F5581S和F5536S；LABLEAD Inc.）线性化的pSET152载体中，生成一组pSET152-NNN-S15/S10干扰质粒（表S2）。每个质粒通过属间接合以每次实验10⁸个孢子导入茂原链霉菌IPIO2，通过计数接合子数量评估接合效率。
【数据】退火条件：95°C、10 min，冷却至16°C；限制酶：XbaI/EcoRI；孢子用量：10⁸个/实验
基于CRISPR-Cas的编辑质粒和突变株构建
本研究所用全部质粒和引物汇总于表S2和S3。穿梭载体pJTU1278用作CRISPR-Cas编辑质粒的骨架。mini-CRISPR阵列（前导序列-重复序列-间隔序列-重复序列-终止子）使用引物对sgRNA-F1/R1、sgRNA-F2/R2和sgRNA-F3/R3通过PCR扩增，并经重叠PCR组装。所得片段克隆至pBluescript II SK(+)载体，该载体作为生成含靶向间隔序列的mini-CRISPR阵列的模板。pCRISPR-tg-1质粒的构建过程如下：含有靶向tg基因的32-bp间隔序列的mini-CRISPR阵列使用crRNA-F1/tg1-crRNA-R1和tg1-crRNA-F2/crRNA-R2引物对经PCR扩增，并使用引物crRNA-F1/R2通过重叠PCR组装。tg基因两侧的两个同源臂UHA和DHA分别使用引物对tg-UHA-F/R和tg-DHA-F/R经PCR扩增。随后使用NovoRec® Plus一步PCR克隆试剂盒（货号NR005，Novoprotein Scientific Inc.，中国）将mini-CRISPR阵列、UHA和DHA克隆至pJTU1278载体的BamHI/KpnI位点，生成编辑质粒pCRISPR-tg-1。编辑质粒通过电转化导入茂原链霉菌。在30°C培养5–7天后，转化子接种至高氏一号琼脂培养基（含10 μg/mL硫链丝菌素和50 μg/mL甲氧苄啶）。为确认靶基因完全删除并分离纯合突变株，使用两对引物通过菌落PCR筛选转化子：一对位于上下游同源臂外侧（外侧PCR），另一对靶向靶基因或基因簇内部区域（内侧PCR）。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析。纯合基因型删除定义为仅存在外侧PCR产物且无内侧PCR产物。两种产物同时检出表示混合基因型转化子，而仅存在内侧PCR产物则提示删除失败——可能由重组不成功或质粒不稳定所致。编辑效率计算为经PCR鉴定的全部转化子中正确编辑转化子的百分比。质粒消除实验中，基因或基因簇删除正确的转化子转移至不含硫链丝菌素的高氏一号琼脂培养基。传代一次后，单菌落划线接种于含或不含硫链丝菌素的琼脂平板。在不含硫链丝菌素平板上生长但无法在含硫链丝菌素平板上生长的菌落视为已丢失编辑质粒。
【数据】编辑质粒骨架：pJTU1278；间隔序列长度：32 bp；克隆位点：BamHI/KpnI；抗生素：10 μg/mL硫链丝菌素、50 μg/mL甲氧苄啶；培养：30°C、5–7 d；电转化导入
RNA测序
RNA测序（RNA-seq）中，在IPIO2发酵4、12、16、24、28和42 h后收集菌丝体。总RNA提取和RNA-seq由上海派森诺生物科技有限公司完成，每个基因的转录水平以标准化每千碱基百万片段数（FPKM）量化。
【数据】取样时间点：4、12、16、24、28、42 h；定量方式：FPKM
蛋白质组测定
蛋白质组学分析中，在IPIO2发酵16、24和42 h后收集菌丝体。胞内蛋白提取和测序在上海交通大学分析测试中心完成。蛋白质鉴定通过使用BLAST进行肽段数据库搜索实现。每个蛋白的表达量基于对应肽段的峰强度量化，反映每个蛋白的标准化丰度。
【数据】取样时间点：16、24、42 h；鉴定方法：肽段数据库搜索/BLAST
TGase发酵及酶活分析
IPIO2及其衍生菌株在高氏一号琼脂培养基上于30°C培养7 d诱导产孢。将一个琼脂平板上的约10⁹个菌落形成单位孢子接种至30 mL种子培养基（20 g/L甘油、6 g/L酵母粉、25 g/L鱼蛋白胨、2 g/L MgSO₄·7H₂O、2 g/L K₂HPO₄·3H₂O，pH 7.4），在旋转摇床中于30°C、220 rpm培养24 h。随后，将3 mL种子培养液转移至30 mL发酵培养基（同种子培养基），三组平行，在相同条件下培养36–42 h直至TGase活性开始下降。TGase活性使用比色法测定。发酵液先离心，收集上清液并适当稀释。然后，将200 μL稀释样品与2 mL预热溶液A（0.2 M Tris-HCl、0.1 M盐酸羟胺、0.01 M还原型谷胱甘肽、0.03 M N-α-CBZ-Gln-Gly，pH 6.0）混合，在37°C水浴中孵育10 min。加入2 mL溶液B终止反应，溶液B为3 M HCl、12%（w/v）三氯乙酸（TCA）和5%（w/v）FeCl₃（溶于0.1 M HCl）的混合物（各组分等体积混合）。使用分光光度计（TECAN，Spark®）测量反应产物的OD525值。酶活使用羟胺酸标准曲线定量。SDS-PAGE使用12%分离胶和5%浓缩胶，在Tris-甘氨酸-SDS缓冲液中进行。样品与5 × SDS上样缓冲液混合。
【数据】孢子量：约10⁹ CFU；种子培养基：30 mL（20 g/L甘油、6 g/L酵母粉、25 g/L鱼蛋白胨、2 g/L MgSO₄·7H₂O、2 g/L K₂HPO₄·3H₂O，pH 7.4）；培养：30°C、220 rpm、24 h；发酵：30 mL、36–42 h；酶活测定：200 μL样品 + 2 mL溶液A、37°C、10 min；检测波长：OD525
研究结果
茂原链霉菌IPIO2内源I-E型CRISPR-Cas系统的功能鉴定
内源CRISPR-Cas系统是开发简化和高效基因组编辑平台的有前景的候选工具。鉴于异源CRISPR-Cas9系统在茂原链霉菌中效果不佳，本研究试图鉴定并利用其天然CRISPR系统作为潜在的基因组编辑工具。对茂原链霉菌IPIO2基因组的生物信息学分析揭示了一个完整的I-E型CRISPR-Cas位点，包含一个CRISPR阵列和相关的cas基因簇（图1a）。cas基因包括cas3、cas8、cas11、cas7、cas5、cas6、cas1和cas2，参与CRISPR-Cas系统的干扰和适应阶段。与I-E型CRISPR-Cas系统的经典结构一致，Cascade复合物由Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas11组成，形成cascade–crRNA复合物。随后，Cas8亚基识别PAM序列并结合靶DNA，解旋酶-核酸酶Cas3被招募至Cascade–DNA复合物并逐步降解靶DNA（图S2）。此外，RNA-seq分析证实全部八个cas基因在发酵期间均有转录活性（图S3），支持该内源系统的功能潜力。CRISPR阵列由19个保守的29-bp重复序列组成，预测能形成稳定的茎环二级结构（图1b），其间散布18个独特间隔序列（编号为间隔序列1至18，平均长度32 bp）（图1a，图S4）。
为评估这些间隔序列的靶向潜力，使用CRISPRTarget通过BLAST分析全部18个间隔序列。七个间隔序列（间隔序列1、3、8、10、13、14和15）与外源质粒序列具有高同源性，提示它们可能是CRISPR干扰的原始靶标（图S5）。除间隔序列-前间隔序列互补外，I型系统的DNA切割还要求前间隔序列5′-端存在PAM，该序列可区分自身与非自身DNA并启动靶DNA的识别和切割过程。为确定该系统识别的特定PAM序列，首先使用WebLogo分析所有匹配前间隔序列的5′-侧翼序列，揭示推定PAM序列的核苷酸频率（图1c）。为明确确定功能性PAM序列并验证干扰活性，进行了质粒干扰实验（图S1）。从WebLogo分析结果中选取九个候选PAM序列（5′-GAT-3′、5′-GAC-3′、5′-GGT-3′、5′-GGC-3′、5′-AAT-3′、5′-AAC-3′、5′-AGT-3′、5′-AGC-3′和5′-AAG-3′），分别克隆至pSET152中前间隔序列（间隔序列15）上游紧邻位置。天然间隔序列上游紧邻的源自重复序列的5′-CCC-3′序列用作阴性对照。选择间隔序列15作为测试对象，因为它匹配最多的前间隔序列（图S5a）。将十个干扰质粒和载体质粒pSET152分别转化至茂原链霉菌IPIO2。携带PAM 5′-AAC-3′和间隔序列15的质粒其转化效率显著低于阴性对照（图1d，图S6）。携带PAM 5′-AAC-3′和间隔序列10的质粒也观察到类似降低，进一步表明5′-AAC-3′是该系统的PAM序列（图1e，图S6）。这些发现表明内源I-E型CRISPR-Cas系统具有靶切割活性，并识别5′-AAC-3′为其功能性PAM。此外，茂原链霉菌IPIO2基因组含有104,062个5′-AAC-3′位点，平均每个基因15.8个位点，凸显了该天然CRISPR-Cas系统在茂原链霉菌中靶向基因组编辑的应用潜力。
【数据】cas基因：cas3、cas8、cas11、cas7、cas5、cas6、cas1、cas2；重复序列：19个、29-bp；间隔序列：18个、平均32 bp；PAM：5′-AAC-3′；基因组5′-AAC-3′位点：104,062个；平均每位点/基因：15.8个
基于内源I-E型CRISPR-Cas系统的高效基因删除
编码TGase的tg基因被选为茂原链霉菌IPIO2中开发CRISPR基因组编辑工具的初始靶标，因为TGase活性可以方便地使用比色法量化。首先，通过将mini-CRISPR阵列和tg基因两侧的两个供体片段（UHA和DHA）插入复制型质粒pJTU1278构建了CRISPR质粒pCRISPR-tg（图2a）。mini-CRISPR阵列包含重复序列-间隔序列-重复序列结构，由CRISPR阵列的天然启动子驱动表达。在tg编码区内5′-AAC-3′位点下游紧邻处选择了两个32-bp间隔序列。随后构建了仅含两个供体片段的对照质粒1278-tg（图2b）。通过电穿孔导入茂原链霉菌IPIO2后，pCRISPR-tg产生的转化子数量少于对照质粒1278-tg，提示CRISPR介导的靶向导致了细胞死亡。接下来，从含硫链丝菌素的培养基中分别挑取pCRISPR-tg质粒的10个转化子，使用两对引物通过PCR扩增验证：一对位于tg基因两侧（TG-out-F/R），另一对靶向基因内部区域（TG-in-F/R）。对于pCRISPR-tg-1和pCRISPR-tg-2，10个转化子中有7个（70%）使用侧翼引物产生了预期大小的短DNA条带（约460 bp），且内部引物无条带，表明tg基因成功删除。pCRISPR-tg-1-9转化子同时观察到野生型和tg删除条带，被鉴定为混合基因型菌株（图2c）。相比之下，对照质粒1278-tg未观察到任何删除（图2c）。
此外，测定了转化子的TGase活性。与PCR扩增结果一致，tg删除转化子未检测到TGase活性，确证基因删除成功，而混合基因型pCRISPR-tg-1-9转化子显示活性显著降低（图2d）。接下来，评估了质粒消除后无标记突变株的分离效率。将pCRISPR-tg-1-1（已确认tg删除）和1278-tg-1（单交换）转化子进行非选择性产孢以允许质粒消除。每个菌株随机挑取19个单菌落，使用侧翼引物对TG-out-F/R进行PCR分析。来源于pCRISPR-tg-1-1转化子的全部19个菌落（100%）保持tg删除基因型，表明基因删除稳定且完全（图2e）。相比之下，来源于对照1278-tg-1转化子的菌落中约一半（10/19，52.6%）表现出预期的tg删除，其余菌落恢复为野生型基因型（图2f）。综上，这些结果表明内源I-E型CRISPR-Cas系统能够在茂原链霉菌中实现高效精准的基因组编辑，在编辑效率和突变株筛选方面均显著优于传统同源重组方法。
【数据】编辑效率：70%（7/10）；删除片段大小：约460 bp；质粒消除后保持率：100%（19/19）；对照单交换后删除率：52.6%（10/19）
利用比较蛋白质组学和天然CRISPR-Cas系统提高TGase产量
对茂原链霉菌IPIO2在发酵16、24和42 h——分别对应TGase产生的早期、对数期和稳定期后期——进行了比较蛋白质组学分析（图S7）。随后进行时间序列分析以鉴定可能参与TGase生物合成的差异表达蛋白。在丰度持续降低的蛋白中（24 h/16 h和42 h/24 h比较中均≥2倍降低，p < 0.05），选取五个功能已知的蛋白进行进一步研究（图3a）。这些候选蛋白包括含氨基酸腺苷化结构域的蛋白（SMDS_42）、酮合酶链长因子（SMDS_1045）及其共转录的酰基载体蛋白（SMDS_1044）、血红素转运蛋白（SMDS_1204）和RNA聚合酶结合蛋白。
【数据】差异蛋白筛选标准：≥2倍降低、p < 0.05；候选蛋白：SMDS_42、SMDS_1045、SMDS_1044、SMDS_1204、RNA聚合酶结合蛋白
内源CRISPR-Cas系统介导的大片段DNA删除基因组编辑
为评估该系统对大片段DNA删除的能力，选择pum生物合成基因簇（BGC）（11.8 kb）作为删除目标（图4a）。使用靶向该基因簇的两个间隔序列构建编辑质粒，导入菌株后经硫链丝菌素筛选获得转化子。使用两对引物进行PCR筛选，结果显示四个转化子中全部（100%）表现出预期的pum BGC删除条带（图4b）。该系统进一步成功删除了10至40 kb范围内的多个大DNA片段，编辑效率达75–80%。此外，删除pseudouridimycin和piericidin A1生物合成基因簇后，TGase产量增加了17%。
【数据】pum BGC大小：11.8 kb；删除效率：100%（4/4）；大片段删除范围：10–40 kb；大片段删除效率：75–80%；删除两个BGC后TGase产量增加：17%
讨论与解读
代谢工程的进展在很大程度上取决于高效可靠的遗传操作工具的可用性。本研究鉴定并改造了茂原链霉菌的内源I-E型CRISPR-Cas系统，实现了超过75%的基因删除编辑效率。II型Cas9和V型Cas12等CRISPR-Cas系统常用于链霉菌基因组编辑，但其应用常受脱靶效应导致的严重毒性和大编辑质粒低转化效率的限制，尤其在工业菌株中。相比之下，I型系统在放线菌中高度普遍，约占链霉菌中鉴定到的所有CRISPR-Cas系统的98%，表明其具有更好的兼容性和较低的细胞毒性。此外，基因组整合的Cascade复合物使得仅携带合成guide RNA（sgRNA）盒的紧凑质粒即可实现简化的遗传操作，从而提高了转化效率和编辑可行性。传统同源重组需要依次筛选单交换整合子，再经质粒消除后反选择双交换突变株，双交换后获得突变株与野生型回复子的理论概率最高为50%，且该方法本质上耗时费力。
删除四个在TGase产生过程中持续下调表达的基因后，TGase产量提高了8.5–18.5%；删除pseudouridimycin和piericidin A1生物合成基因簇还使TGase产量增加17%，同时改善了产品安全性。该平台为茂原链霉菌的菌株工程和TGase工业化优化提供了有力工具。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于"就地取材"的策略——不强行引入异源CRISPR系统，而是挖掘菌株自身已有的免疫系统并改造为编辑工具。这种思路对许多缺乏成熟遗传操作工具的工业菌株具有普适参考价值。内源系统规避了异源蛋白毒性问题，紧凑的编辑质粒也降低了转化门槛。不过，PAM位点在基因组中的分布密度（平均每基因15.8个位点）虽看似充足，但实际可编辑位点还需考虑靶序列唯一性；此外，该系统对多重编辑或碱基替换等更精细操作的支持能力尚待验证。
参考来源
Wang D. An efficient endogenous type I-E CRISPR-Cas genome-editing platform for producing transglutaminase in Streptomyces mobaraensis. Engineering Microbiology, 2026. DOI: 10.1016/j.engmic.2026.100302
DOI: 10.1016/j.engmic.2026.100302