来源：Directed evolution of an integral membrane monooxygenase unlocks its full potential（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
化学合成2,6-二(羟甲基)吡啶需消耗大量有毒试剂且原子效率低下。本研究对恶臭假单胞菌来源的膜结合双组分二甲苯单加氧酶（XylMA）进行定向进化，通过筛选50,000个突变体，锁定XylM亚基第116位甲硫氨酸（M116）为底物特异性的关键残基。M116G突变使XylMA能够直接双羟基化2,6-二甲基吡啶，将原本复杂的四步胞内反应级联简化为两步，并在450 L中试规模实现17 g L⁻¹产物浓度和1.45 g L⁻¹h⁻¹时空产率。
研究背景
酶已成为制备有机化学工具箱中的重要组成部分。一类特别引人注目的反应源自酶分类第1类——氧化还原反应，通常需要辅因子和还原型辅酶的参与，而这些辅因子的再生颇具挑战。这推动了全细胞生物转化的应用，利用细胞广泛的代谢网络（例如将葡萄糖转化为CO₂）来免去辅因子再生的任务。在膜结合的双铁依赖性单加氧酶家族中，存在一些最有前景但尚未充分开发的氧化还原催化剂，它们利用分子氧和NADH提供的氢，将非活化碳原子依次氧化为醇、醛和羧酸。虽然单加氧酶的化学潜力——尤其是P450酶——已引发广泛关注并催生了多种工业应用，但膜结合双铁依赖性单加氧酶的充分开发仍然困难重重。
研究方法
4.1 一般材料（化学品、引物、菌株）
本研究所用化学品、细胞菌株和质粒，以及培养基组成与配制、摇瓶和实验室规模补料分批生物转化条件，均已在先前报道中详述（Kardashliev et al., 2022）。简言之，XylMA由pSPZ3质粒表达——该质粒为带有卡那霉素抗性基因的pBR322衍生载体，受AlkS/P alkB调控系统控制，可通过DCPK诱导（Panke et al., 1999b）。不同突变体也由同一质粒表达，仅对xylM基因进行了所述修饰。制备规模合成使用E. coli NEB（NEBExpress® Competent E. coli，New England Biolabs）。筛选菌株使用E. coli RARE（Kunjapur et al., 2014），该菌株缺失醛-酮还原酶和醇脱氢酶超家族中六个编码基因。
4.2 易错PCR（epPCR）基因突变
通过epPCR在xylM基因中引入随机核苷酸交换，使用实验室自制的诱变聚合酶（Pfu exo- D141A E143A）（Lundberg et al., 1991）、引物（5‘-ATTGGAGAACACCATATGGAC）和（5’-CGGTTTAGACTGCCTGTATTATC），以pSPZ3质粒为模板。扩增的基因片段通过等温组装（ITA）（Gibson et al., 2009）连接到pSPZ3骨架中（骨架本身使用高保真Phusion聚合酶预混液和引物5‘-CGTGTCCATATGGTGTTCTCC及5’-TGATAATACAGGCAGTCTAAACCG进行PCR扩增），所得构建体用于转化感受态E. coli DH10β细胞，获得约50,000个CFU。从所得琼脂平板中挑取单个克隆进行Sanger测序，验证目标片段已被突变，并估算错误频率——对应每个蛋白变体1–3个氨基酸交换。其余转化子（约50,000 CFU）从平板上刮下、混合，提取合并质粒。
4.3 微量滴定板格式epPCR文库制备
epPCR获得的完整质粒文库用于通过电转化转化E. coli RARE。恢复后，细胞直接在含卡那霉素的液体LB培养基中传代培养8小时至OD600为1。将细胞培养物用新鲜培养基稀释至约80 CFU mL⁻¹，然后取40 µL等分液（平均含3.2个单细胞）分配到十二块384孔微量滴定板中。当文库在96孔微量滴定板中检测时，用一次性移液枪头从预先在LB琼脂（含卡那霉素）上生长的单个菌落直接接种100 µL LB培养基。所得平板在37°C、200 rpm下过夜培养，每孔加入甘油至终浓度10%（v/v），所得母板保存在−80°C或立即使用。
4.4 克隆文库自动针式复制到筛选培养基
分布在384孔微量滴定板中的文库使用Tecan EVO200机器人平台针式复制到新鲜LB培养基中，由EVOware标准软件控制。机器人平台配备液体置换移液系统，以milliQ水为系统液体。移液系统配有八个特氟龙涂层固定枪头，连接四个1000 μL和四个50 μL稀释器，以及两个枪头清洗站。每次移液前，枪头使用2%次氯酸钠水溶液去污，具体如下：枪头在第一个清洗站用蒸馏水从内部（3 mL）和外部（4 mL）冲洗。然后从100 mL槽（Tecan, REF 10613048）中吸取1000 μL 2%次氯酸钠水溶液，在液体系统内孵育10秒，之后将次氯酸钠溶液排回100 mL槽中。为清除枪头中残留的次氯酸盐溶液，在第二个清洗站用蒸馏水从内部（3 mL）和外部（4 mL）冲洗。清洗站配备定制盖子以控制清洗过程中产生的气溶胶，该盖子由丙烯酸板经激光切割机制成。母培养物向筛选培养物的转移使用96针复制器（SCI-4010-OS, Scinomix, Earth City, MO, USA）完成。首先，所有384孔筛选板（平底聚丙烯板M1686, Greiner Bio-one）用机器人移液系统加入30 μL培养基。母培养板在针式复制前以1000 rpm振荡1分钟确保培养物均一。然后，通过机器人机械臂将96针复制器先浸入母板再浸入筛选板来转移细胞。复制一块384孔板需要四次独立的针式复制步骤。在针式复制步骤之间，96针复制器按如下方式去污：使用机器人机械臂，将针式复制器先浸入装有70 mL 2%次氯酸盐水溶液的Omnitray板（REF 242811, Thermo Scientific）中，在次氯酸盐溶液内移动20秒促进清洗。随后在超纯水和95%乙醇中类似地进行两次额外清洗。接着，将针式复制器放入位于PCR循环仪（Biometra TRobot, Analytik Jena, Jena, Germany）内预加热至80°C的带裙边96孔PCR板（REF 4ti-0960, 4titude Ltd., Surrey, UK）中，在加热的PCR板内干燥至少3分钟，然后用于下一次针式复制。自动针式复制的EVOware脚本可在 https://github.com/gregorwschmidt/tecan-libraryreplication 获取。
4.5 微量滴定板格式生物转化反应
将母微量滴定板针式复制到装有20 μL（384孔板格式）或100 μL（96孔板格式）新鲜LB培养基的新板中，培养基补充0.01% DCPK和0.5 g L⁻¹的2（5 g/L水溶液储备液），分别作为XylMA的诱导剂和底物。平板在30°C、300 rpm下孵育12至14小时，允许细胞生长和生物催化反应完成。
4.6 MALDI-TOF MS样品的自动化制备和点样
MALDI-MS样品使用与自动针式复制相同的Tecan EVO200机器人平台制备。首先，使用液体处理系统的1000 μL通道向筛选板每孔加入30 μL浓度为18 mg mL⁻¹的α-氰基-4-羟基肉桂酸基质溶液（溶于含0.1%三氟乙酸（TFA）的70%乙腈水溶液）。接下来，使用集成封板机（RoboSeal, HJ-Bioanalytik GmbH, Erkelenz, Germany）将密封膜（聚丙烯箔，REF 900500, HJ-Bioanalytik GmbH, Erkelenz, Germany）施加到筛选板上，板在集成振荡器（Teleshake, ThermoFisher Scientific, Basel, Switzerland）上以1000 rpm振荡3分钟，使基质溶液与培养物混合。为确保仅将培养上清液与MALDI基质点样到384点MALDI靶板（抛光钢，部件号# 8280781, Bruker Daltonics）上，培养板在机器人系统的集成离心机（Rotanta 46 RSC Robotic, Hettich AG, Baech, Switzerland）中以716 × g离心15分钟。使用集成剥膜器（RoboPeel, HJ-Bioanalytik GmbH, Erkelenz, Germany）从筛选板上移除密封膜。然后，将3 μL样品-基质混合物等分液移液到384点MALDI靶板上。为确保在MALDI板上准确可重复地点样，移液枪头到MALDI靶板的距离必须精确调节至0.2 mm。MALDI靶板安装在3D打印适配板内，以实现自动化操作。
【数据】质粒：pSPZ3（pBR322骨架，卡那霉素抗性）；诱导系统：AlkS/P alkB，DCPK诱导；筛选菌株：E. coli RARE（缺失6个氧化还原酶基因）；生产菌株：E. coli NEB；epPCR聚合酶：Pfu exo- D141A E143A；突变频率：每变体1–3个氨基酸交换；文库规模：约50,000 CFU；384孔板培养：每孔40 µL含约3.2个细胞；96孔板培养：每孔100 µL；母板储存：甘油终浓度10%（v/v），−80°C；针式复制：96针复制器，次氯酸盐去污20秒，80°C干燥≥3分钟；生物转化：LB培养基+0.01% DCPK+0.5 g L⁻¹底物2，30°C，300 rpm，12–14 h；MALDI样品：18 mg mL⁻¹ α-氰基-4-羟基肉桂酸基质（70%乙腈+0.1% TFA），离心716 × g 15 min，点样3 µL，枪头距靶板0.2 mm
研究结果
2.1 化学与进化策略
XylMA的氧化行为难以详细追踪，因为XylM的膜定位以及底物通过膜的可及性、酶动力学和抑制剂机制与动力学的叠加效应几乎无法解开（Bühler et al., 2002; Maruyama et al., 2003）。结合我们此前补料分批生物转化的数据（Kardashliev et al., 2022）以及对假枯烯（Bühler et al., 2002）和间二甲苯（Maruyama et al., 2003）氧化动力学的更详细研究，我们推测了图1所示的反应序列：起始底物1首先且仅被单羟基化为6-甲基-2-吡啶甲醇（2），表明XylMA对1具有高亲和力，以至于排除了其他反应。一旦1被消耗完，XylMA接受2作为底物，但优先将2氧化为6-甲基-2-吡啶甲醛（3），而非将2羟基化为终产物6。这种众所周知的过氧化效应反映了XylMA倾向于作用于氧活化的甲基而非间位非活化甲基，可能是由于更紧密的官能团底物结合（Maruyama et al., 2003）。随着3浓度增加和2浓度降低，XylMA也羟基化3的自由甲基，生成6-(羟甲基)吡啶-2-甲醛（5）。最后一步由持家芳香族脱氢酶催化，将5还原为所需产物6。作为副反应，我们观察到3转化为4，这仅在低浓度或1和2均不存在时出现。值得注意的是，醛类3和5以及羧酸盐4的杀菌活性远高于其他任何相关物质（对E. coli的LD50：1为2.5 g L⁻¹；2为3.5 g L⁻¹；3为1 g L⁻¹；4为0.75 g L⁻¹；5为0.5 g L⁻¹；6为8.5 g L⁻¹；见Kardashliev et al., 2022）。因此，在制备规模合成过程中，必须仔细控制1和2的浓度，因为1的存在会阻断后续反应，而2浓度升高会生成有毒的醛3。如果2能被直接羟基化为6——最好是由一个在1存在时即能催化该反应的XylMA变体来完成——则可以避免这一复杂途径的需求和许多毒性问题。在这种情境下，生成有毒产物3至5的大部分可能性以及对防止1积累的精细补料工艺的需求都将被消除。因此，我们旨在将这两种特性引入XylMA的工程化变体中。
【数据】底物1对XylMA的亲和力：优先单羟基化；产物毒性（LD50，E. coli）：1为2.5 g L⁻¹；2为3.5 g L⁻¹；3为1 g L⁻¹；4为0.75 g L⁻¹；5为0.5 g L⁻¹；6为8.5 g L⁻¹
2.2 检测方法开发和XylM随机突变文库筛选
图1中的化合物1至6对快速筛选检测构成了复杂混合物，因此我们开发了微生物筛选与基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）方法相结合的策略，该方法几乎不需要样品制备。具体而言，我们利用了6的形成需要醛5的还原（图1）这一事实，以及先前报道的菌株E. coli RARE（Kunjapur et al., 2014）还原芳香醛的能力减弱。在该菌株中筛选（而非更稳健的生产菌株）将使得6的任何形成更可能归因于2的羟基化而非5的还原。此外，对XylM的结构特征知之甚少，仅了解其粗略拓扑结构和少数催化重要残基（Wubbolts, 1994）。因此，我们采用了一种朴素方法——易错PCR后筛选大量克隆。我们放弃了产物混合物定量测定的准确性以换取通量，开发了一种定制的半定量MALDI-TOF MS方案，用于直接检测标准化384孔微量滴定板培养上清液中的6。半定量分析之所以可行，是因为筛选宿主E. coli RARE和XylMWT A对2的活性可忽略不计，从而将非特异性背景信号降至最低（图2B）。通过将三个克隆合并到一个孔中并自动化所有液体处理步骤，进一步提高了通量。生成了XylM的epPCR文库，按前述方法克隆（Wubbolts et al., 1994），置于可由二环丙基酮（DCPK）诱导的启动子下，转化可高效转化的E. coli宿主，并进行了表征（50,000个变体，平均每个基因2个氨基酸交换）。从该文库获得质粒制备物，用于转化E. coli RARE。我们将20,000个克隆分布到装有LB培养基的微量滴定板孔中，培养至稳定期，然后重新接种到含有诱导剂和1 mM底物2的新鲜生长培养基中。过夜孵育后，从每孔获得澄清上清液，与基质溶液混合，使用液体处理机器人转移到MALDI靶板上，随后进行MALDI-TOF MS分析。记录目标产物6的信号强度，提取并归一化至内标的信号强度。为鉴定改进变体，将各变体的归一化信号与每块微量滴定板上作为阴性和阳性对照培养的产XylMA的E. coli RARE或E. coli NEB所测信号进行比较。值得注意的是，对照样品如预期仅产生可忽略不计的6（以2为底物），MS几乎无法检测（图S1）。从每块384孔板得分最高的孔中重新培养菌株至96孔板格式，我们鉴定出一个独特克隆，其产生的6水平与阳性对照相当（阳性对照为产XylMA的脱氢酶阳性E. coli NEBExpress菌株，先前曾用于制备6）（Kardashliev et al., 2022）（图2A）。对编码的xylM基因进行Sanger测序，显示氨基酸替换为M116K（XylMM116K）。通过用完全测序的表达XylMM116KA的表达质粒重新转化E. coli RARE确认了结果，确保效果的来源是XylM中的突变而非菌株或表达质粒其余序列中未检测到的突变（数据未显示）。此外，我们在摇瓶中进行了6小时的生物转化，加入递增浓度的2并跟踪6的形成，比较E. coli RARE XylMM116KA与表达XylMA的细胞（图2B）。MALDI-TOF MS分析表明6的信号强度相对增加7至11倍。综合来看，数据强烈表明M116K氨基酸交换导致二甲苯单加氧酶的6-甲基-2-吡啶甲醇羟基化酶（2羟基化酶）活性显著增加。
【数据】文库规模：50,000个变体（平均每个基因2个氨基酸交换）；筛选克隆数：20,000个；筛选底物：1 mM的2；阳性克隆：XylMM116K；MALDI-TOF MS信号增加：7–11倍
2.3 XylM亚基第116位饱和突变
为确定XylM第116位哪种氨基酸残基能最有效地将2转化为6，我们使用适当的简并密码子（NNK）通过定点突变将天然甲硫氨酸替换为其他全部19种规范氨基酸，并使用上述筛选方案在96孔微量滴定板中分析了180个所得变体（>95%文库覆盖率）在E. coli RARE中形成6的能力（图3A）。对表现最好的克隆（图3A中前1%）的xylM基因进行Sanger测序，发现具有6-甲基-2-吡啶甲醇羟基化酶活性的XylM变体在M116位含有N、K、L或G。携带这些突变的XlyMA变体质粒用于重新转化E. coli RARE，并以1 mM的2为底物重复摇瓶水平生物转化实验。为精确量化产物，使用HPLC-UV（图S2），发现6的最终浓度为0.1至0.2 g L⁻¹。相比之下，仅检测到可忽略不计的6。
【数据】饱和突变：M116位19种氨基酸替换；筛选变体数：180个（>95%文库覆盖率）；活性氨基酸：N、K、L、G；产物6终浓度：0.1–0.2 g L⁻¹（HPLC-UV）
2.4 AlphaFold 3结构预测与活性位点模型
AlphaFold 3预测的XylM结构显示，M116位于活性位点二铁中心附近，与配位组氨酸残基相邻。M116G突变改变了底物通道的空间位阻，使得2能够以更适合直接羟基化的方式进入活性位点。
【数据】结构预测方法：AlphaFold 3；突变热点：M116（黄色标记）；二铁中心：红色圆点
2.5 实验室规模与中试规模生物转化
使用E. coli NEB表达XylMAWT和XylMM116GA进行2,6-二甲基吡啶（1）到6的生物转化。（A）实验室规模（1 L）培养表达XylMAWT的E. coli NEB和（B）表达XylMM116GA的E. coli NEB。红色虚线表示添加到培养液中的1的绝对累积量。（C）中试规模（450 L）反应。XylMM116GA在450 L中试规模中实现了17 g L⁻¹的产物浓度和1.45 g L⁻¹h⁻¹的时空产率。
【数据】实验室规模：1 L；中试规模：450 L；产物浓度：17 g L⁻¹；时空产率：1.45 g L⁻¹h⁻¹
讨论与解读
生物催化常能实现可持续的化学合成（Sheldon & Woodley, 2018）。单加氧酶尤其有前景，因为它们能以无与伦比的精度进行区域和立体选择性官能化。然而，它们的工业应用被认为很困难。与膜结合酶常见的情况一样，酶结构通常是未知的。然而，我们的实验室和中试测试表明，通过定向进化确实可以开发出工业上可用的变体。我们希望这些结果能鼓励更多人更频繁地考虑将完整膜羟化酶作为生产目的的酶催化剂——特别是在环保生产方法优先的情况下。
编译者解读
本研究展示了定向进化在膜结合酶工程中的强大威力——无需高分辨率结构信息，仅通过半定量MALDI-TOF MS高通量筛选即可锁定关键残基。M116G单点突变将四步级联简化为两步，同时规避了有毒醛中间体的积累，这一策略对同类多步生物催化路线的简化具有直接借鉴意义。450 L中试规模的成功放大验证了工程酶的工业可行性。值得关注的是，筛选菌株E. coli RARE的设计巧妙利用了其醛还原缺陷来区分直接羟基化与醛还原两条路径，这种"宿主辅助筛选"的策略值得在更广泛的氧化还原酶工程中推广。局限在于，M116位点的发现依赖于随机突变筛选，对结构-功能关系的理解仍依赖AlphaFold预测，理性设计空间尚待挖掘。
参考来源
Kardashliev T. Directed evolution of an integral membrane monooxygenase unlocks its full potential. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134249
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134249