来源：Directed Evolution of the Bacteriophage Endolysin PlyC Reveals a Charge-Mediated Mechanism of Thermal Stabilization（Journal of Biological Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
噬菌体内溶素（endolysin）作为新型抗菌蛋白正进入临床开发，但多数成员热稳定性不足，制约了其储存与递送。本研究以多亚基内溶素PlyC为模型，对热不稳定的PlyCA催化亚基开展三轮定向进化，筛选18,000个突变体后锁定关键点突变N211H。该突变通过电荷介导的静电相互作用将催化亚基结构稳定性提升1.52°C，动力学半衰期延长18.6倍，并与计算筛选所得突变T406R叠加后使热转变温度提高7.46°C。研究揭示了一种此前未知的电荷介导热稳定机制，为其他内溶素的工程改造提供了可推广的方法学框架。
研究背景
双链DNA噬菌体依赖双组分裂解系统释放子代病毒粒子。感染后期，穿孔素（holin）在宿主细胞质膜上寡聚并引发膜通透性破坏，使胞内的内溶素得以穿越细胞膜接触肽聚糖底物。这些酶通过切割肽聚糖中的一个或多个关键共价键，破坏细胞壁结构完整性，促进渗透性裂解并释放子代噬菌体。当外源添加时，重组内溶素对革兰氏阳性菌表现出强效杀菌活性，被视为小分子抗生素的潜在替代品。尽管革兰氏阴性菌外膜构成的物理屏障通常阻碍外源内溶素接触肽聚糖，但已有越来越多天然或工程化内溶素能够穿越或渗透外膜。链球菌C1噬菌体内溶素PlyC具有多项临床关注的溶菌特性——它是迄今表征的内溶素中效力最强的成员之一。然而，与多数内溶素一样，PlyC的热稳定性有限，这对其长期储存和治疗应用构成实际障碍。
研究方法
菌株与培养条件
酿脓链球菌（S. pyogenes）D471在含1%（w/v）酵母提取物的Todd Hewitt肉汤中常规培养。大肠杆菌（E. coli）菌株在Luria-Bertani（LB）肉汤中、37°C通气培养，除非另有说明。需要时，向培养基中添加氨苄青霉素（100 μg/mL）和/或氯霉素（35 μg/mL）。
【数据】菌株：S. pyogenes D471、E. coli DH5α、E. coli BL21(DE3)pLysS；培养基：Todd Hewitt肉汤+1%酵母提取物、LB肉汤；温度：37°C；抗生素：氨苄青霉素100 μg/mL、氯霉素35 μg/mL
分子克隆与定点突变
plyC操纵子由plyCB、一个称为裂解基因间位点（lysin intergenic locus，lil）的非编码区以及plyCA组成。plyC操纵子和单独的plyCA分别克隆至pBAD24载体，plyCB克隆至pBAD33载体。其他PlyC相关结构构建体的标准50 μL聚合酶链式反应（PCR）体系包含：1 ng模板DNA、1x Q5反应缓冲液、0.2 mM dNTP混合液、各0.5 μM引物和1 U Q5 DNA聚合酶（New England Biolabs）。以pBAD24::plyC为模板，使用表S3所列引物扩增gyh（引物GyH-F和GyH-R）、chap（引物CHAP-F和CHAP-R）、plyCΔgyh（引物PlyCB_lil-F、PlyCB_lil-R、PlyCΔGyH-F和CHAP-R）和plyCΔchap（引物PlyCB_lil-F和PlyCΔCHAP-R）。plyCΔgyh通过重叠延伸PCR构建，使用三组引物：首先分别用PlyCB_lil-F/PlyCB_lil-R和PlyCΔGyH-F/CHAP-R引物对扩增两个PCR产物，随后用PlyCB_lil-F和CHAP-R将两个产物融合产生全长plyCΔgyh。以plyCΔgyh为模板，用PlyCB_lil-F和PlyCΔΔ-R扩增plyCΔΔ。gyh和plyCΔΔ构建体中编码螺旋对接域的核苷酸序列均包含翻译的C端6x组氨酸标签。热循环仪加热条件为：98°C 30秒，35个循环（98°C 10秒、60°C 30秒、72°C 30秒/kb），72°C 2分钟。PCR产物用MfeI和XbaI限制性内切酶（New England Biolabs）双酶切，连接至pBAD24的EcoRI和XbaI位点，然后转化至E. coli DH5α。DNA测序确认后，各质粒构建体转化至E. coli BL21(DE3)pLysS进行蛋白表达。
【数据】PCR体系：50 μL；模板DNA：1 ng；dNTP：0.2 mM；引物：0.5 μM/each；Q5聚合酶：1 U；退火温度：60°C；延伸：72°C 30秒/kb；酶切位点：MfeI/XbaI（EcoRI/XbaI）
蛋白表达与纯化
PlyC相关结构构建体和点突变体在补充氨苄青霉素（pBAD24）或氯霉素（pBAD33）的LB培养基中、37°C通气（180 rpm）培养表达。各培养物生长至对数中期后，用0.25%（w/v）L-阿拉伯糖诱导蛋白表达4小时。随后收集细胞，洗涤并重悬于补充1 mM苯甲基磺酰氟（Sigma-Aldrich）的PBS（pH 7.2）中。细菌通过超声裂解。所得裂解液在4°C下13,000 rpm离心1小时以澄清，经0.2 μm注射器过滤器过滤得到粗裂解液。除GyH和PlyCΔΔ外，各蛋白样品均按前述方法纯化至均一。GyH和PlyCΔΔ使用固定化金属亲和色谱（IMAC）纯化：粗裂解液上样至Ni²⁺负载的Profinity IMAC柱（Bio-Rad），以补充10 mM咪唑的PBS（pH 7.2）平衡；柱子经洗涤后用20至500 mM咪唑阶梯梯度洗脱蛋白。含高纯度GyH或PlyCΔΔ的洗脱级分对PBS（pH 7.2）透析、无菌过滤，储存于−80°C。构建PlyC点突变体时，使用Phusion定点突变试剂盒（Thermo Scientific）将突变引入plyCA。每个突变置于正向30核苷酸磷酸化引物的中间位置，磷酸化反向引物与上游相邻30核苷酸互补。标准50 μL PCR反应体系包含：1 ng pBAD24::plyC、1x Phusion HF缓冲液、0.2 mM dNTP、各0.5 μM引物和1 U Phusion DNA聚合酶。热循环条件为：98°C 30秒，25个循环（98°C 10秒、65°C 30秒、72°C 4分钟），72°C 5分钟。突变PCR产物连接后转化至E. coli DH5α。DNA测序确认突变后，各质粒构建体转化至E. coli BL21(DE3)pLysS进行蛋白表达。
【数据】诱导剂：0.25%（w/v）L-阿拉伯糖；诱导时间：4h；转速：180 rpm；裂解：超声；离心：13,000 rpm、4°C、1h；IMAC：Ni²⁺柱、咪唑20-500 mM梯度；PCR：65°C退火、72°C延伸4min
定向进化方法
使用Mutazyme II（Agilent Technologies）对plyCA进行易错PCR（epPCR），突变率设定为每个plyCA基因2至3个核苷酸。标准50 μL epPCR反应体系包含：3 μg pBAD24::plyCA（750 ng靶DNA）、1x Mutazyme II反应缓冲液、0.2 mM dNTP混合液、各0.5 μM引物（GyH-F和CHAP-R）和0.05 U Mutazyme II DNA聚合酶。热循环条件为：95°C 2分钟，30个循环（95°C 30秒、60°C 30秒、72°C 2分钟），72°C 10分钟。突变plyCA文库随后用MfeI和XbaI限制性内切酶双酶切，连接至pBAD24的EcoRI和XbaI位点。所得pBAD24::plyCA突变构建体转化至携带pBAD33::plyCB的基因修饰E. coli DH5α菌株，然后涂布于补充氨苄青霉素和氯霉素的LB琼脂平板。值得注意的是，使用E. coli DH5α pBAD24::plyCA、pBAD33::plyCB双转化体共表达PlyCA和PlyCB时，PlyC全酶可以被重建。后续筛选方法按前述流程进行。简要概括：96孔平底未处理聚苯乙烯微量滴定板的每孔加入200 μL补充氨苄青霉素和氯霉素的LB。作为对照，第1列接种编码亲本PlyC的细菌菌落。其余每孔接种突变库中的一个单菌落。微量滴定板在37°C、通气（300 rpm）条件下过夜培养。制备复制板：向新96孔微量滴定板每孔加入180 μL含氨苄青霉素和氯霉素的LB，然后从过夜培养板每孔转移20 μL至复制板对应孔。原始板储存于4°C备用。复制板在37°C通气培养1小时后，向每孔加入0.25%（w/v）L-阿拉伯糖诱导蛋白表达4小时。微量滴定板3,000 rpm离心10分钟，移除每孔上清，加入50 μL B-PER II细菌蛋白提取试剂（Thermo Scientific）重悬并在室温孵育20分钟裂解细菌。每孔总体积用PBS（pH 7.2）补至120 μL，不溶性裂解物通过4°C、3,000 rpm离心10分钟去除。随后从每孔取110 μL可溶性粗裂解液转移至96孔热循环仪板，A1至D1孔的裂解液除外——这四孔含过表达亲本PlyC的裂解液各取100 μL转移至最终96孔平底板，作为未加热的裂解活性阳性对照。96孔热循环仪板在热循环仪中于预先优化的非允许温度下孵育（温度优化步骤参见文献[25]；该温度比使亲本内溶素失活的最低温度高2至3°C）。最后，将100 μL热处理的可溶性裂解液转移至最终96孔平底板。残余溶菌活性以酿脓链球菌为底物通过浊度降低法测定。初步显示动力学稳定性增强的PlyC突变体使用相同孵育温度重新筛选以排除假阳性。重筛后，确认稳定性增强的PlyC突变体可溶性裂解液经进一步表征。
【数据】epPCR突变率：2-3个核苷酸/plyCA基因；模板：3 μg pBAD24::plyCA（750 ng靶DNA）；Mutazyme II：0.05 U；PCR：95°C 2min、30循环（95°C 30s、60°C 30s、72°C 2min）、72°C 10min；筛选体积：200 μL LB/孔；诱导：0.25% L-阿拉伯糖、4h；裂解：50 μL B-PER II、室温20min；离心：3,000 rpm、10min；热处理温度：非允许温度（亲本失活温度以上2-3°C）
研究结果
PlyC结构组分的稳定性分析
先前对PlyC的热分析表明，PlyCA的C端CHAP结构域可能是全酶中最热不稳定的结构组分。为扩展这一发现，本研究对更多PlyC构建体进行了量热表征。除先前研究的PlyC、PlyCA、PlyCA的CHAP结构域和PlyCB CBD外，评估的其他构建体还包括PlyCA的N端GyH结构域、PlyCΔGyH（缺失PlyCA GyH结构域的PlyC全酶）、PlyCΔCHAP（缺失PlyCA CHAP结构域的PlyC全酶）和PlyCΔΔ（同时缺失PlyCA GyH和CHAP结构域的PlyC全酶）。各PlyC构建体在大肠杆菌中重组表达并纯化。使用差示扫描量热法（DSC），在20 mM磷酸钠（pH 7.0）中、等摩尔浓度下测定各纯化蛋白的热稳定性。所有样品从15°C加热至105°C，升温速率1°C/min，随后立即以相同速率冷却。与既往研究一致，PlyCA和PlyCB CBD的热稳定性差异显著。在全酶背景下（符合五态热转变模型），PlyCA的热转变温度（T G = 48.27°C）比PlyCB CBD（T G = 75.85°C）低27.58°C。分离状态下，PlyCA（T G = 45.92°C）相对于复合形式被去稳定化，其热转变温度比分离的PlyCB CBD（T G = 75.44°C）低29.52°C。对PlyCA分离的GyH结构域（T G = 47.74°C）和CHAP结构域（T G = 47.81°C）的量热分析显示，两个结构域的热转变温度几乎相同。当与PlyCB CBD复合时，从PlyCA中删除GyH结构域使催化亚基稳定性提高1.34°C（T G = 49.61°C），而删除CHAP结构域使PlyCA轻微去稳定化0.43°C（T G = 47.84°C）。然而，PlyCΔΔ构建体未检测到中央螺旋对接域的独立热转变温度，这一观察可能反映了螺旋对接域与PlyCB CBD的同步解折叠。加热后冷却步骤的结果显示各样品均发生不可逆解折叠。
【数据】缓冲液：20 mM磷酸钠（pH 7.0）；升温范围：15-105°C；速率：1°C/min；PlyCA T G：48.27°C（全酶）、45.92°C（分离）；PlyCB CBD T G：75.85°C（全酶）、75.44°C（分离）；GyH T G：47.74°C；CHAP T G：47.81°C；ΔGyH：+1.34°C（T G=49.61°C）；ΔCHAP：−0.43°C（T G=47.84°C）
定向进化筛选概览
由于未复合和复合的GyH与CHAP结构域表现出相近的热稳定性谱图，且中央螺旋对接域的量热分析不具结论性，因此将整个PlyCA亚基作为定向进化靶标。筛选流程示意如图2A所示。简言之，使用epPCR生成突变plyCA文库，与PlyCB在大肠杆菌中共表达以产生功能性PlyC全酶变体。蛋白表达后，含突变酶的可溶性裂解液在优化的非允许温度下热处理以使亲本PlyC酶失活。随后测定对酿脓链球菌的残余溶菌活性，以鉴定动力学稳定性增强的变体。推定阳性克隆使用一系列热处理温度重新筛选以排除假阳性，并确定热耐受性最先进的领先变体。每轮的领先变体用作下一轮epPCR的模板。总体上，三轮定向进化共筛选了18,000个PlyC突变体以寻找动力学稳定性增强的变体（图2B）。第一轮以野生型plyCA为epPCR模板，在35°C筛选6,000个PlyC突变体后选出35个候选克隆，经重筛去除假阳性后，在宽温度范围内测定残余溶菌活性以确定领先候选。第二轮定向进化以编码第一轮领先候选的plyCA为模板进行epPCR，在42°C筛选额外6,000个第二代PlyC突变体后共选出75个突变候选进行重筛。确定领先候选后，以编码该特定突变体的plyCA为模板进行最后一轮epPCR。最终6,000个第三代PlyC突变体在45°C筛选，鉴定出60个候选进行重筛。第三轮定向进化结束时的领先候选命名为PlyC 33D2，共编码四个PlyCA氨基酸突变N211H、S224N、G249C和A407S。
【数据】筛选总数：18,000个突变体；轮次：3轮；第一轮：6,000个突变体、35°C、35个候选；第二轮：6,000个突变体、42°C、75个候选；第三轮：6,000个突变体、45°C、60个候选；PlyC 33D2突变：N211H、S224N、G249C、A407S
PlyC 33D2及其点突变体的动力学稳定性
在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）中测定了PlyC 33D2的热诱导动力学半衰期（t 1/2），并与野生型进行比较。在这些及后续评估动力学稳定性的实验中，各纯化内溶素以等浓度在45°C下孵育总计3小时。每20分钟取出等分试样，冰上冷却后测定对酿脓链球菌的残余裂解活性。数据以未加热对照的裂解活性进行归一化。动力学半衰期t 1/2对应于将内溶素相对溶菌活性降至50%所需的时间（分钟）。在45°C下，PlyC 33D2突变体的t 1/2为45分钟，相较野生型PlyC（t 1/2 = 18分钟）代表2.5倍的动力学稳定性提升（图3A，表2）。随后，将PlyC 33D2编码的每个突变分别单独引入以评估各自对内溶素动力学稳定性的贡献。PlyC(PlyCAS224N)、PlyC(PlyCAG249C)和PlyC(PlyCAA407S)在45°C下的t 1/2值分别为28、21和27分钟，代表较野生型1.2至1.6倍的动力学稳定性提升（图3B，表2）。相比之下，PlyC(PlyCAN211H)的t 1/2为外推的335分钟，相当于较野生型18.6倍的动力学稳定性提升。PlyC(PlyCAN211H)的动力学稳定性比PlyC 33D2高7.4倍，表明将PlyCAN211H与PlyC 33D2中一个或多个额外突变组合会降低动力学稳定性。
【数据】缓冲液：PBS（pH 7.2）；孵育温度：45°C；总时长：3h；取样间隔：20min；PlyC 33D2 t 1/2：45min（2.5倍）；野生型 t 1/2：18min；S224N t 1/2：28min（1.6倍）；G249C t 1/2：21min（1.2倍）；A407S t 1/2：27min（1.5倍）；N211H t 1/2：335min（18.6倍）
定向进化领先候选的热稳定性
在20 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中考察了野生型PlyC和PlyC(PlyCAN211H)的热稳定性。使用PlyC进行的圆二色（CD）热变性实验显示PlyCA呈现单一的协同热诱导结构转变。PlyCA折叠态与解折叠态浓度相等时的温度定义为结构中点温度（T 1/2）。野生型PlyC和PlyC(PlyCAN211H)的PlyCA T 1/2值分别为50.09°C和51.61°C（图4A，表3）。因此，PlyCAN211H突变在pH 7.0下将催化亚基的结构稳定性提高了1.52°C。野生型PlyC和PlyC(PlyCAN211H)的量热分析证实PlyCAN211H突变（T G = 50.26°C，van't Hoff解折叠焓（ΔH vH）= 199.25 kcal/mol）相较野生型（T G = 48.27°C，ΔH vH = 171.23 kcal/mol）将催化亚基的热稳定性提高1.99°C（图4B，表3）。尽管催化亚基的解折叠是不可逆的，但先前的DSC分析表明PlyCA的转变温度和解折叠焓与扫描速率无关，提示在测试条件下动力学扭曲极小。因此，van't Hoff焓以表观值报告。这些生物物理实验的集体结果表明PlyC(PlyCAN211H)相较野生型具有改善的热稳定性。使用剂量-响应浊度降低法，溶菌活性分析……（原文后续内容未提供）
【数据】缓冲液：20 mM磷酸钠（pH 7.0）；野生型 T 1/2：50.09°C；N211H T 1/2：51.61°C；ΔT 1/2：+1.52°C；野生型 T G：48.27°C、ΔH vH：171.23 kcal/mol；N211H T G：50.26°C、ΔH vH：199.25 kcal/mol；ΔT G：+1.99°C
电荷特异性PlyC(PlyCAN211)突变体的热稳定性
为探究N211H突变稳定化的机制基础，构建了N211位点的电荷特异性突变体并对其热稳定性进行了系统表征。远紫外CD光谱用于评估野生型PlyC及各种PlyC(PlyCAN211)电荷突变体在20 mM磷酸钠（pH 7.0）中的二级结构组成。动力学稳定性分析在45°C、PBS（pH 7.2）条件下进行。各突变体的热稳定性数据揭示了N211位点侧链电荷状态对PlyCA稳定性的关键影响。
【数据】缓冲液：20 mM磷酸钠（pH 7.0）；动力学分析：45°C、PBS（pH 7.2）；N211位点电荷突变体：原文未详述各突变体具体数值
pH依赖性热稳定性
为阐明pH对野生型PlyC和PlyC(PlyCAN211H)热稳定性的影响，各样品在20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0至8.0）中以1°C/min的速率加热。所得CD热变性数据和DSC数据均显示，在pH 6.0条件下，PlyCAN211H突变体的稳定化效果最为显著。在pH 6.0时，该突变将结构稳定性提升3.48°C，热稳定性提升4.10°C。
【数据】缓冲液：20 mM磷酸钠；pH范围：6.0-8.0；升温速率：1°C/min；pH 6.0时ΔT 1/2：+3.48°C；pH 6.0时ΔT G：+4.10°C
PlyCA N211H突变在全酶中的位置及潜在相互作用伙伴
PlyC全酶结构由八个PlyCB单体组成，它们相互作用形成CBD八聚体（灰色）。PlyCA亚基由N端GyH结构域（蓝色）、中央螺旋对接域（黄色）和C端CHAP结构域组成。N211H突变位于GyH结构域与螺旋对接域之间的连接区。结构建模显示，质子化的H211侧链可能与N端糖基水解酶结构域中的两个酸性残基形成有利的静电场相互作用，可能使延伸的连接区结构锚定在结构域表面。
【数据】结构位置：GyH结构域与螺旋对接域之间的连接区；相互作用残基：PlyCAE113、PlyCAD150（原文未详述其他参数）
PlyCA H211静电相互作用伙伴的鉴定
使用CD热变性实验，在以下背景下测定了PlyCAN211H突变的稳定化潜力：PlyC(PlyCAE113A)、PlyC(PlyCAD150A)、PlyC(PlyCAD208A)或PlyC(PlyCAE113A,D150A)。当E113或D150被丙氨酸替代后，N211H突变带来的稳定化效应显著减弱或消失，证实这两个酸性残基是H211静电相互作用的功能伙伴。
【数据】突变背景：E113A、D150A、D208A、E113A/D150A；稳定化效应：E113A或D150A背景中N211H稳定化效应减弱（原文未详述具体数值）
PlyCAN211H与PlyCAT406R突变的叠加稳定化效应
将PlyCAN211H与独立理性计算筛选中鉴定的稳定化突变PlyCAT406R组合后，在pH 6.0条件下热稳定性叠加提升7.46°C。该组合突变体的热转变温度达到54.60°C，使其成为源自中温噬菌体的高稳定性内溶素。结构模型显示，PlyCAH211残基（粉色棍状，顶部）被建模到源自GyH结构域（蓝色）的连接区结构中，与PlyCAE113和PlyCAD150（绿色棍状，顶部）的静电相互作用被突出显示。
【数据】组合突变：N211H+T406R；pH 6.0时ΔT G：+7.46°C；组合突变体T G：54.60°C
讨论与解读
抗生素耐药性是对公共卫生的现实威胁，给全球医疗系统带来沉重的临床和经济负担。噬菌体内溶素是正在临床开发中的替代治疗药物。然而，对许多此类酶而言，固有的热不稳定性仍是可能阻碍后续开发的主要限制。这一特性与蛋白治疗药物的实际开发高度相关——增加的热稳定性通常能增强其在制造、储存、运输和制剂过程中抵抗不可逆失活的能力，还可能延长生物制品在生理和环境相关条件下的功能寿命。本研究表明，定向进化方法可特异性提升溶菌酶（如内溶素）的热稳定性。来自两种独立蛋白工程方法（定向进化和计算机模拟筛选）的稳定化突变可以组合并产生叠加效应。这些经过验证的工程方法及所阐明的独特稳定化机制，现在可以扩展到其他内溶素和溶菌酶，以提升其作为抗菌生物制剂的实际应用价值。
编译者解读：本研究以"电荷介导的锚定"这一物理化学机制为切入点，将定向进化与理性设计巧妙结合——前者无偏筛选出N211H这一"意外"突变，后者则通过结构建模破解了其稳定化原理，并进一步实现突变叠加。从合成生物学应用角度看，该方法论的可迁移性值得关注：热稳定性是蛋白药物产业化的共性瓶颈，而本研究建立的高通量筛选-机制解析-组合优化的闭环流程，为其他内溶素乃至更广泛的抗菌酶的稳定性工程提供了可直接套用的范式。不过，N211H单独突变虽大幅提升动力学稳定性，但与33D2其他突变组合时反而下降，提示多突变间的上位效应不可忽视——这为未来工程改造中突变组合策略的制定提供了重要警示。
参考来源
Heselpoth RD. Directed Evolution of the Bacteriophage Endolysin PlyC Reveals a Charge-Mediated Mechanism of Thermal Stabilization. Journal of Biological Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.jbc.2026.113393
DOI: 10.1016/j.jbc.2026.113393