来源：Engineering Naematelia aurantialba as a Robust Synthetic Biology Chassis: Stable Episomal Vector Construction and Metabolic Optimization for Enhanced Polysaccharide Synthesis（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
金耳（Naematelia aurantialba）作为一种具有酵母样生长优势的食用真菌，长期缺乏高效遗传操作工具。本研究以菌株NX-20为对象，系统优化了原生质体制备与再生的关键参数，再生率高达46.16%；通过全基因组密码子偏好性分析揭示了其以自然选择为主导的G/C结尾密码子偏好（GC3s为67.15%）；并在基因组GC3谷中鉴定到一个475 bp的最小着丝粒核心元件，构建了可自主复制的游离表达载体。利用该体系异源表达透明颤菌血红蛋白（VHb），在搅拌罐生物反应器中使金耳多糖产量达到25.01 g/L，较野生型提高44.8%。
研究背景
担子菌门真菌是天然产物的重要来源，可合成萜类、甾醇及结构多样的真菌多糖等具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎和抗氧化活性的复杂代谢物。然而，传统获取方式依赖野外采集或耗时的人工栽培，受季节和环境因素制约，且因宿主真菌遗传背景复杂、生长缓慢，产量不稳定、纯化困难。随着合成生物学发展，利用高效微生物细胞工厂异源生产担子菌天然产物已成为趋势。当前最常用的底盘细胞来自细菌（如大肠杆菌）和子囊菌门模式真菌（如酿酒酵母、解脂耶氏酵母和曲霉属），这些系统虽拥有成熟的遗传工具，但在表达担子菌来源的复杂天然产物时往往存在显著局限。金耳具有酵母样单细胞生长特征，为液体发酵和遗传操作提供了天然优势，但缺乏高效遗传工具严重制约了其底盘化开发。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
Naematelia aurantialba NX-20菌株最初从子实体中分离，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC，编号18588）。该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上保存，PDA配方含20.0%马铃薯、1.0%葡萄糖、0.3% KH₂PO₄、0.1% MgSO₄和2.0%琼脂（w/v），于25°C培养7天。种子摇瓶培养使用马铃薯葡萄糖肉汤（PDB），25°C培养3天。种子液体培养基（SLM）组成为：5.0 g/L蔗糖、20.0 g/L酵母提取物、20.0 g/L胰蛋白胨、1.0 g/L MgSO₄·7H₂O、1.0 g/L K₂HPO₄和0.46 g/L KH₂PO₄。再生液体培养基（RLM）组成为：0.8 M麦芽糖、10.0 g/L葡萄糖、2.0 g/L胰蛋白胨、1.0 g/L MgSO₄·7H₂O、1.0 g/L K₂HPO₄和0.46 g/L KH₂PO₄。转基因金耳菌株在添加50 μg/mL潮霉素B（HygB）的选择性PDA平板上于25°C筛选。
【数据】菌株：N. aurantialba NX-20（CGMCC No. 18588）；PDA配方：20.0%马铃薯、1.0%葡萄糖、0.3% KH₂PO₄、0.1% MgSO₄、2.0%琼脂；温度：25°C；时间：7天；SLM：5.0 g/L蔗糖、20.0 g/L酵母提取物、20.0 g/L胰蛋白胨、1.0 g/L MgSO₄·7H₂O、1.0 g/L K₂HPO₄、0.46 g/L KH₂PO₄；RLM：0.8 M麦芽糖、10.0 g/L葡萄糖、2.0 g/L胰蛋白胨、1.0 g/L MgSO₄·7H₂O、1.0 g/L K₂HPO₄、0.46 g/L KH₂PO₄；HygB筛选浓度：50 μg/mL
2.2 抗生素敏感性测定
使用含不同浓度潮霉素B（HygB，Macklin，中国上海）（0、5、10、25和50 mg·L⁻¹）或萎锈灵（cbx，Macklin）（0、50、100、200和400 mg·L⁻¹）的PDA培养基测定抗生素敏感性。金耳NX-20在25°C培养7天。
【数据】HygB浓度梯度：0、5、10、25、50 mg·L⁻¹；cbx浓度梯度：0、50、100、200、400 mg·L⁻¹；温度：25°C；时间：7天
2.3 质粒构建
基于抗生素敏感性结果，选择HygB作为筛选剂。为驱动异源基因表达，从基因组DNA中扩增了金耳甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子（Pnagpd），该启动子含有保守的TATA盒。用Bgl II和Sal I线性化pAN7-1质粒，插入Pnagpd生成pAN7-1-nagpd。随后用BamH I和Hind III线性化pAN7-1-nagpd。通过重叠PCR组装trpC终止子、Pnagpd和Nos终止子（来自pCAMBIA1302）。由于nagpd启动子内部存在一个Hind III位点，在组装过程中将该位点替换为tNOS下游的Xho I位点。将所得重叠片段连接至线性化骨架中，生成pAN7-1-nagpd-hygR-trpC-nagpd-tNOS。在Pnagpd和tNOS之间设计了独特的Sma I和Spe I位点，用于目标基因插入。
【数据】限制性内切酶：Bgl II、Sal I、BamH I、Hind III、Sma I、Spe I、Xho I；启动子：Pnagpd（含TATA盒）；终止子：trpC、Nos（pCAMBIA1302来源）；骨架：pAN7-1
2.4 密码子使用偏好性分析
使用CodonW 1.4.2和EMBOSS explorer中的CUSP程序确定密码子使用参数。计算的指标包括总GC含量、位置特异性GC含量（GC1、GC2和GC3）、有效密码子数（ENc）、密码子适应指数（CAI）、同义密码子相对使用频率（RFSC）和高频（HF）密码子。通过Parity Rule 2（PR2）绘图分析阐明进化驱动力，以A3/(A3 + T3)和G3/(G3 + C3)为坐标。可视化ENc-GC3s关系以区分突变压力和自然选择。理论标准曲线按公式（1）计算：ENc = 2 + GC3 + 29/[GC3² + (1-GC3)²]（1）。最后，进行中性绘图分析（GC12 vs. GC3）以量化突变和选择的相对贡献。
【数据】分析软件：CodonW 1.4.2、EMBOSS CUSP；指标：GC含量、GC1/GC2/GC3、ENc、CAI、RFSC、HF密码子；公式：ENc = 2 + GC3 + 29/[GC3² + (1-GC3)²]
2.5 原生质体制备与优化
金耳NX-20在CM培养基（2.0%葡萄糖、0.2%胰蛋白胨、0.2%酵母提取物、0.1% K₂HPO₄、0.46% KH₂PO₄、0.1% MgSO₄）中于25°C、200 rpm预培养至OD₆₀₀ ≈ 0.6。然后将培养物转移至SLM（10%接种量），培养至OD₆₀₀ ≈ 1.0。取50 mL培养物中的细胞，离心收集（4000 × g，15 min，4°C），用冰预冷去离子水洗涤三次。初步评估了多种裂解酶（包括甘露聚糖酶、driselase、蜗牛酶和溶壁酶）产生原生质体的能力。然而，由于甘露聚糖酶和蜗牛酶单独或组合使用均未能产生可检测的原生质体（图1a），后续优化仅纳入涉及溶壁酶和driselase的有效酶组合（图1b）。通过改变溶壁酶浓度（1.00–3.00%）、酶解时间（1.0–5.0 h）、温度（25–37°C）和振荡速度（30–190 rpm）对原生质体释放进行系统优化。酶解后，通过离心（3000 × g，10 min）纯化原生质体，洗涤两次，重悬于STC缓冲液（0.6 M山梨醇、10.0 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10.0 mM CaCl₂）中。在400×显微镜下观察原生质体，并用血细胞计数板计数。原生质体产量按以下公式计算：Yp = Np/V（2），其中Yp代表原生质体产量（每毫升原生质体数），Np代表原生质体数量，V代表酶解液体积。所有实验重复三次。
【数据】CM培养基：2.0%葡萄糖、0.2%胰蛋白胨、0.2%酵母提取物、0.1% K₂HPO₄、0.46% KH₂PO₄、0.1% MgSO₄；预培养条件：25°C、200 rpm、OD₆₀₀≈0.6；SLM培养：10%接种量、OD₆₀₀≈1.0；离心：4000×g、15 min、4°C；酶种类：甘露聚糖酶、driselase、蜗牛酶、溶壁酶；溶壁酶浓度范围：1.00–3.00%；酶解时间：1.0–5.0 h；温度：25–37°C；振荡速度：30–190 rpm；纯化离心：3000×g、10 min；STC缓冲液：0.6 M山梨醇、10.0 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10.0 mM CaCl₂；计数：400×显微镜+血细胞计数板
2.6 原生质体再生
评估了含不同渗透压稳定剂（KCl、NaCl、麦芽糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖或甘露糖）的RLM。原生质体在STC缓冲液中稀释至1 × 10³细胞/mL，涂布于RLM平板（1%琼脂）上。以ddH₂O稀释的原生质体作为阴性对照。平板在25°C培养7天。原生质体再生率根据菌落数按以下公式计算：Rp = (Cr – Cp) × 100%/Np（3），其中Rp代表原生质体再生率（%），Cr代表RLM上的菌落数，Cp代表再生培养基平板上的菌落数，Np代表原生质体数。
【数据】渗透压稳定剂：KCl、NaCl、麦芽糖、山梨醇、葡萄糖、蔗糖、甘露糖；原生质体稀释浓度：1×10³细胞/mL；琼脂：1%；培养：25°C、7天；阴性对照：ddH₂O稀释
2.7 PEG介导的转化
转化通过混合100 μL STC缓冲液（含10⁸原生质体/mL）、10 μg质粒DNA、50 μg λDNA、6 ng亚精胺和150 μL PTC缓冲液（60% PEG 4000、50 mM CaCl₂、10 mM Tris-HCl，pH 7.5）启动。冰上孵育30 min后，加入1 mL PTC缓冲液，随后在28°C孵育30 min。原生质体经离心回收（4000 × g，10 min，4°C），重悬于1 mL RLM中，25°C静置培养48 h。最后，转化子在含50 μg/mL HygB的再生培养基上筛选7–10天。
【数据】原生质体浓度：10⁸原生质体/mL；质粒DNA：10 μg；λDNA：50 μg；亚精胺：6 ng；PTC缓冲液：60% PEG 4000、50 mM CaCl₂、10 mM Tris-HCl（pH 7.5）；冰浴：30 min；PTC孵育：28°C、30 min；回收离心：4000×g、10 min、4°C；RLM恢复：25°C、48 h、静置；HygB筛选：50 μg/mL、7–10天
2.8 转化子验证
金耳阳性转化子的鉴定按照Yu等人（2024）描述的方法进行。推定转化子先在含50 mg/L HygB的再生培养基（RLM）平板上初步筛选。为促进基因组DNA（gDNA）释放，通过微波照射和速冻交替循环实现细胞壁破碎。使用引物对hyg-F和hyg-R（补充表）通过PCR分析检测推定转化子中的bar基因，参数如下：95°C 10分钟，然后30个循环的95°C 30秒、55°C 30秒和72°C 1分钟。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分析，并在通用生物（中国滁州）测序验证。
【数据】筛选：RLM平板+50 mg/L HygB；细胞破碎：微波+速冻交替循环；引物：hyg-F/hyg-R；PCR参数：95°C 10 min；30个循环（95°C 30 s、55°C 30 s、72°C 1 min）；电泳：1%琼脂糖凝胶
2.9 启动子筛选与荧光强度分析
为优化细胞内异源基因表达，在Sma I和Spe I限制性位点线性化pAN7-1-nagpd-hygR-trpC-nagpd-tNOS质粒构建表达载体。插入针对金耳NX-20进行密码子优化的egfp片段（naegfp），生成中间载体pAN7-1-nagpd-hygR-trpC-nagpd-naegfp-tNOS。为评估转录起始效率，测试了3个异源启动子（tfgpd、gpdA和花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子）和8个内源启动子（nagpd1、nagpd2、naras1、naras2、naras3、naras4、naras5和nasar1）。内源序列以金耳NX-20 gDNA为模板扩增。转录起始位点（TSS）使用伯克利果蝇基因组计划（Berkeley Drosophila Genome Project）的神经网络启动子预测工具预测（http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html，访问日期：2021年9月12日）。启动子区域内顺式作用调控元件的分布……（原文此处截断）
【数据】异源启动子：tfgpd、gpdA、CaMV 35S；内源启动子：nagpd1、nagpd2、naras1-naras5、nasar1；报告基因：naegfp（密码子优化egfp）；TSS预测工具：BDGP神经网络启动子预测
研究结果
3.1 原生质体制备的优化
建立高效遗传转化系统是对金耳进行合成生物学研究和分子改良的前提。高质量原生质体的制备和高效再生是突破致密真菌细胞壁屏障、实现大分子核酸递送的核心环节。由于细胞壁降解效率直接决定原生质体产量，我们首先评估了不同酶系统对金耳NX-20原生质体释放的影响（图1a）。在能够产生原生质体的酶系统中，单独使用溶壁酶表现出最高的水解效率，而甘露聚糖酶和蜗牛酶在测试条件下未能产生可检测的原生质体。值得注意的是，将Glucanex添加到溶壁酶中并未产生预期的协同增益，反而导致产量显著降低（图1b）。这一结果与在蛹虫草或灵芝等其他高等真菌中广泛报道的多种裂解酶协同效应形成鲜明对比。这种差异可能源于金耳作为胶质菌独特的细胞壁组成——富含特定键合的多糖和特征性酸性杂多糖。这种多糖网络恰好与溶壁酶的特定糖苷酶活性谱精确匹配。相反，Glucanex等复合酶系统常含有微量非靶标蛋白酶或非特异性水解酶，这些酶的引入不仅可能诱导竞争性底物抑制，还可能一旦细胞壁保护丧失就对原生质体脆弱的质膜造成早期不可逆损伤。
在确定最佳单酶系统后，反应参数的动力学特征在"产量-活力"平衡中起决定性作用。溶壁酶浓度显著驱动细胞壁降解动力学（图1c）。随着酶浓度增加至20 mg/mL，原生质体释放达到峰值；然而，浓度进一步增加导致产量出现明显下降趋势。这种典型的"过度消化"现象在其他丝状真菌和担子菌的细胞工程中也有观察到。主要机制涉及高浓度粗酶溶液快速剥离细胞壁，同时降解维持渗透稳态所必需的跨膜蛋白，导致新形成的原生质体在极短时间内破裂。同时，酶解反应受温度（图1d）和时间（图1e）的严格调控。30°C被确定为最佳反应温度；偏离该点不仅降低水解酶的催化效率，还可能削弱原生质体的代谢活力和环境耐受性。在时间动力学方面，产量在酶解3.0 h时达到峰值。随后的产量下降进一步表明，延长孵育时间显著增加原生质体暴露于环境胁迫的风险，特别是粗酶溶液中痕量脂肪酶对无壁细胞脂质双层的潜在攻击。
除生化参数外，物理机械环境——具体而言是振荡速度——对原生质体产量具有不可忽视的影响（图1f）。适度的物理搅拌对于维持酶分子与真菌生物量之间的高效传质是必要的。结果表明，110 rpm的振荡速度在促进酶传质和维持原生质体机械稳定性之间提供了理想平衡。较低速度导致酶接触不足，从而降低裂解效率，而过高的速度则诱导强烈的流体剪切应力，导致极其脆弱的金耳原生质体物理破裂。在上述全面优化的条件下（20 mg/mL溶壁酶、30°C、3.0 h和110 rpm），我们成功获得了高密度且纯净的原生质体悬浮液。形态学观察（图1g）证实这些原生质体主要呈规则球形、折光性高。虽然它们大小不一，反映了它们来源于不同发育阶段的酵母样细胞，但总体上表现出健康真菌原生质体群体典型的高活力特征。
【数据】最佳酶系统：单独溶壁酶；最佳酶浓度：20 mg/mL；最佳温度：30°C；最佳时间：3.0 h；最佳振荡速度：110 rpm；甘露聚糖酶/蜗牛酶：无可检测原生质体；溶壁酶+Glucanex：产量显著降低
3.2 原生质体再生的优化
获得原生质体后，提供适当的渗透压环境对于防止细胞裂解和诱导细胞壁从头合成与重建至关重要。如图2所示，在对七种不同渗透压稳定剂的系统评估中，0.6 M麦芽糖表现出优异的性能，再生率高达46.16%。该值显著高于真菌原生质体再生中常用的山梨醇或蔗糖。这一现象具有深远的生物学意义，因为担子菌中渗透压稳定剂的功能往往不仅限于物理支撑。麦芽糖作为一种易代谢的二糖，可能同时充当渗透调节剂和代谢信号分子。在被细胞高效内化后，它作为关键前体直接参与并加速葡聚糖和几丁质等新生细胞壁组分的快速生物合成。类似的双重效应此前在裂褶菌原生质体再生过程中也有揭示。然而，当麦芽糖浓度超过0.6 M的等渗阈值时，再生率显著下降。这种下降很可能是因为过高的渗透压诱导严重的细胞脱水或质壁分离，进而抑制了细胞壁生物合成途径所需的蛋白质翻译和关键初级代谢过程。综上所述，通过酶解系统、反应动力学和再生微环境的系统重建与调控，本研究建立了高效稳定的金耳原生质体制备与再生系统。46.16%的高原生质体再生率为后续高效的PEG介导遗传转化奠定了坚实的细胞材料基础。值得注意的是，这也为金耳游离表达质粒系统的成功开发清除了最关键的技术障碍。
【数据】最佳渗透压稳定剂：0.6 M麦芽糖；最高再生率：46.16%；对照：山梨醇、蔗糖（再生率显著低于麦芽糖）；麦芽糖浓度>0.6 M：再生率显著下降
3.3 九个代谢子系统的密码子使用偏好性（CUB）分析
在成功构建和优化高效金耳原生质体转化系统后，实现稳健的异源基因表达成为开发担子菌细胞工厂的下一个关键挑战。由于担子菌门真菌已进化出不同于细菌和子囊菌模式生物的遗传特征，其翻译效率高度依赖于外源序列对宿主CUB的适应性。因此，对金耳基因组的深入表征——特别是关键代谢子系统中的密码子使用模式——不仅对揭示进化驱动力至关重要，而且对后续合成生物学元件的定制设计也必不可少。基于这一原理，我们对涉及九个核心代谢子系统的基因进行了深入的生物信息学表征，包括转运与分解代谢（TR）、碳水化合物代谢（CM）、氨基酸代谢（AM）……（原文此处截断）
【数据】分析范围：9个核心代谢子系统（TR、CM、AM等）；GC3s：67.15%（来自摘要）；进化驱动力：自然选择主导（来自摘要）
3.4 遗传转化与启动子活性功能评价
（对应图4内容——原文截断，基于摘要和图表清单编译）
图4展示了PEG介导质粒转化金耳NX-20原生质体的示意图（图4a），以及基于PCR的hph（潮霉素B磷酸转移酶）选择标记在候选转化子中的验证（图4b）。
【数据】转化方法：PEG介导；选择标记：hph（潮霉素B磷酸转移酶）；验证方法：PCR
3.5 核心着丝粒（CEN）元件的鉴定与功能表征
（对应图5内容——原文截断，基于摘要和图表清单编译）
图5a显示了金耳NX-20基因组的GC3重叠群扫描图谱，红色方框突出显示一个明显的GC3谷。图5b展示了不同CEN候选元件对荧光素酶表达水平的影响。
【数据】CEN元件大小：475 bp（最小核心元件，来自摘要）；定位：基因组GC3谷中；功能：实现稳定自主游离复制（来自摘要）
3.6 VHb的异源表达与功能表征
（对应图6内容——原文截断，基于摘要和图表清单编译）
图6a展示了携带navhb基因的游离表达载体示意图。图6b通过目标基因的PCR扩增对金耳转化子进行了分子验证。
【数据】异源基因：navhb（透明颤菌血红蛋白基因）；载体类型：游离表达载体；验证方法：PCR扩增
3.7 发酵性能
（对应图7内容——原文截断，基于摘要编译）
在搅拌罐生物反应器发酵中，表达VHb的工程菌株金耳多糖（NAPS）产量达到25.01 g/L，较野生型菌株提高44.8%。
【数据】NAPS产量：25.01 g/L；较野生型提高：44.8%；发酵方式：搅拌罐生物反应器
讨论与解读
本研究成功将具有酵母样生长优势的担子菌金耳开发为高效稳定的新型合成生物学底盘。与传统丝状担子菌相比，金耳的单细胞生长特征为其液体发酵和遗传操作提供了天然工程基础。通过系统优化原生质体制备和再生参数，利用仅含溶壁酶的酶系统和以麦芽糖为专用渗透压稳定剂，建立了高效转化系统。对九个核心代谢子系统CUB的深入分析揭示了以自然选择为驱动力的遗传特征，表现为强烈的G/C结尾密码子偏好。结合内源启动子文库筛选，证实金耳的转录调控系统对异源元件表现出显著的"顽固性"，强调开发内源调控元件是实现稳健表达的先决条件。本研究最具突破性的成果在于从基因组中鉴定并提取了一个475 bp的最小着丝粒核心元件（命名为NaCEN475）。利用该元件构建的游离表达载体系统为长期困扰该领域的遗传嵌合体和荧光异质性等不稳定问题提供了全面解决方案。
编译者解读：本研究的技术路线体现了典型的"问题驱动型"合成生物学方法论——每一步优化都瞄准了非模式担子菌工程化的实际瓶颈。值得关注的是，作者没有盲目堆砌多酶组合，而是通过实验证据揭示了金耳细胞壁组成与溶壁酶活性的精确匹配，这一发现对胶质菌类群的遗传操作具有直接参考价值。475 bp最小着丝粒的鉴定是亮点中的亮点，为其他缺乏游离载体系统的非模式真菌提供了可借鉴的基因组挖掘策略。VHb异源表达使多糖产量提升44.8%，展示了"呼吸代谢工程"在丝状真菌多糖生产中的潜力。不过，原文部分章节信息不完整（如启动子筛选的具体荧光数据、CUB九个子系统的详细统计值），这些细节的缺失使得部分结论的定量支撑略显不足——期待该团队后续发表完整数据。
参考来源
Ma Y. Engineering Naematelia aurantialba as a Robust Synthetic Biology Chassis: Stable Episomal Vector Construction and Metabolic Optimization for Enhanced Polysaccharide Synthesis. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135564
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135564