来源：Efficient nepetalactone production in Saccharomyces cerevisiae via metabolic engineering and bioprocess optimization（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
荆芥内酯（nepetalactone）是一种天然昆虫驱避剂，驱虫效果可与DEET相媲美，但植物提取含量低（<1%）、化学合成成本高，限制了其应用。本研究在酿酒酵母中实现了荆芥内酯的从头合成，通过环烯醚萜合酶（ISY）来源筛选、酶融合、辅因子再生的"推-拉-阻断"策略及两相发酵等系列优化，最终在5.0 L补料分批发酵中获得4.5 g/L的荆芥内酯产量——这是目前微生物合成荆芥内酯的最高报道产量。
研究背景
植物源昆虫驱避剂广泛应用于农业害虫防治，但大多数商业驱避剂采用DEET等化学成分制造。化学驱避剂的频繁使用已扰乱自然生态系统并导致昆虫产生抗药性。荆芥内酯具有驱蚊特性，作为农业生物驱避剂比DEET更有效且安全性更优。然而，荆芥内酯主要来源于植物，含量低（<1%），大幅推高了生产成本。微生物生产提供了一条可持续、绿色的替代路径。此前研究主要集中于无细胞系统中以8-羟基香叶醇或香叶醇为底物的半生物合成，但复杂反应体系和昂贵前体使其难以满足商业化需求。本研究旨在酿酒酵母中建立无需昂贵前体或诱导剂的荆芥内酯从头合成途径。
研究方法
2.1 基因、质粒与菌株
编码8-羟基香叶醇氧化还原酶（CrHGO，来源于长春花Catharanthus roseus）、环烯醚萜合酶（OeISY来源于油橄榄Olea europaea、CrISY来源于长春花、NmISY来源于荆芥Nepeta mussinii）、主要乳胶蛋白样蛋白A（MLPL，来源于猫薄荷Nepeta cataria）以及荆芥内酯相关短链脱氢酶（NEPS1，来源于Nepeta racemosa）的基因，均针对酿酒酵母表达进行了密码子优化（图1A），由擎科生物技术有限公司（中国北京）合成（见补充材料）。启动子和终止子通过PCR从酿酒酵母基因组DNA扩增获得。所有重组酵母菌株均采用高效率的LiAc/SS载体DNA/PEG方法构建（见补充材料）。
【数据】基因来源：CrHGO（长春花）、OeISY（油橄榄）、CrISY（长春花）、NmISY（荆芥）、MLPL（猫薄荷）、NEPS1（Nepeta racemosa）；基因合成：擎科生物；菌株构建方法：LiAc/SS载体DNA/PEG
2.2 培养基与试剂
用于质粒构建和扩增的大肠杆菌TOP10在37°C的Luria–Bertani（LB）培养基中培养，添加50 μg/mL卡那霉素进行筛选。本研究所构建的酿酒酵母菌株在合成完全缺失培养基（2.0%葡萄糖、0.7%酵母氮碱、0.2%氨基酸混合物，不含所选氨基酸）中于30°C培养筛选。质粒DNA提取与纯化试剂盒、Phanta Max超保真DNA聚合酶及用于PCR的Green Taq Mix购自Vazyme（中国南京）。T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自New England Biolabs（美国）。顺/反式荆芥内酯和顺-反式荆芥内酮标准品购自成都艾菲生物科技有限公司（中国四川）。所有化学品购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；培养基：LB+50 μg/mL卡那霉素；酵母培养基：2.0%葡萄糖+0.7%酵母氮碱+0.2%氨基酸混合物；酵母培养温度：30°C
2.3 荆芥内酯生产的培养条件
在24深孔板中进行荆芥内酯生产时，从新鲜SC或YPD平板挑取单菌落，接种于3 mL SC或YPD培养基中进行预培养。在30°C过夜培养（约16小时）后，将种子培养物以初始OD600为0.2转移至24深孔板中，于28°C、220 rpm条件下培养生产荆芥内酯。OD600使用原子吸收分光光度计（TU-1810，北京普析仪器有限公司，中国）测定。研究者从每种改造策略中获得的最有效菌株被选作进一步优化的起点。这些菌株根据其在各自改造策略中的表现进行选择，构成后续优化工作的基础。
对于补料分批发酵，从新鲜YPD平板挑取单菌落接种于3 mL YPD培养基中，过夜培养（约16小时）。随后将种子培养物转移至摇瓶中，于30°C、220 rpm振荡培养。培养12–16小时后，收获处于对数生长期的培养物，接种至5 L发酵罐（T&J Bio-Engineering Co. Ltd.，中国上海）。补料分批发酵在28°C下进行。气流速率调节至1 vvm，pH通过自动化仪器用氢氧化钠和氨溶液自动维持在5.8。溶解氧含量维持在30%。发酵8小时后，乙醇替代葡萄糖作为碳源，乙醇浓度维持在10 g/L以下。
【数据】预培养：3 mL SC/YPD，30°C，约16h；深孔板培养：初始OD600 0.2，28°C，220 rpm；摇瓶培养：30°C，220 rpm，12–16h；5 L发酵罐：28°C，通气量1 vvm，pH 5.8，溶解氧30%，乙醇浓度<10 g/L
2.4 荆芥内酯和荆芥内酮的提取与定量
取1毫升培养样品，加入1毫升乙酸乙酯进行萃取，用于单相发酵中荆芥内酯和荆芥内酮的测定。对于两相发酵，有机相用正己烷稀释后，采用GC–MS系统分析——配备HP–FFAP色谱柱（30 m，0.25 mm内径，0.25 μm膜厚）的SHIMADZU GC–2010 PLUS气相色谱仪，耦合SHIMADZU GC–MS QP2020质谱仪。氦气为载气，分流比10:1。进样口温度230°C。柱温初始设为70°C保持1分钟，随后以30°C/min升至150°C，再以10°C/min升至230°C并保持10分钟。顺/反式荆芥内酯的特征碎片离子m/z为168，保留时间约9.3分钟。荆芥内酮的特征碎片离子m/z为166，顺-反式荆芥内酮和顺-顺式荆芥内酮的保留时间分别约为6.8和7.6分钟。葡萄糖、乙醇和乙酸含量通过HPLC系统分析过滤后的培养基测定——配备Bio-Rad HPX-87H色谱柱（300 mm × 7.8 mm），流速0.6 mL/min，柱温40°C，运行30分钟。
【数据】萃取：1 mL培养物+1 mL乙酸乙酯；GC-MS条件：HP-FFAP柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），氦气分流比10:1，进样口230°C；柱温程序：70°C 1min→30°C/min至150°C→10°C/min至230°C保持10min；荆芥内酯m/z 168，保留时间约9.3min；荆芥内酮m/z 166，保留时间约6.8/7.6min；HPLC：HPX-87H柱（300×7.8mm），流速0.6 mL/min，柱温40°C，30min
研究结果
3.1 酵母中荆芥内酯和荆芥内酮的从头生物合成
在生物合成途径中（图1A），甲羟戊酸（MVA）途径产生的香叶基焦磷酸（GPP）在香叶醇合酶（GES）和香叶醇-8-羟化酶（G8H）的催化下转化为8-羟基香叶醇。本研究使用的初始菌株yWHR27是一个8-羟基香叶醇生产平台，其中半乳糖代谢基因GAL80已被敲除（Wang et al., 2023）。所采用的诱导型GAL启动子在葡萄糖耗尽后自动激活，无需添加昂贵的诱导剂半乳糖，大幅降低了成本。8-羟基香叶醇被8-羟基香叶醇氧化还原酶（HGO）通过两步连续反应氧化为8-氧代香叶醛。环烯醚萜合酶（ISY）、主要乳胶蛋白样蛋白A（MLPL）和荆芥内酯相关短链脱氢酶（NEPS1）随后分别还原、环化并氧化8-氧代香叶醇，生成荆芥内酯和荆芥内酮（Lichman et al., 2020; Lichman et al., 2019）。
为生产荆芥内酯，将来源于长春花的crHGO和crISY导入菌株yWHR27中，构建了菌株NTE01。反应中间体8-氧代香茅醇烯醇可自发环化形成包括荆芥内酯在内的产物混合物。如图1B所示，菌株NTE01成功将8-羟基香叶醇转化为荆芥内酯，通过气相色谱保留时间和质谱碎片得到验证。质子化离子扫描显示，荆芥内酯标准品和菌株NTE01的样品均呈现相同的m/z 168 [M+H]+峰。此外，引入来源于N. mussinii的MLPL使荆芥内酯产量从1.9 mg/L显著提高至13.4 mg/L（图1D）。在没有环化酶的情况下，8-氧代香叶醛和ISY通过自发环化产生荆芥内酯。然而，该自发反应也会产生大量副产物，最显著的是部分环化的环烯醚萜二醛（Hernández Lozada et al., 2022）。环化酶MLPL的表达通过不依赖辅因子的机制促进还原烯醇的环化，从而减少副产物形成并提高荆芥内酯生产效率（Ye et al., 2024; Dudley et al., 2022; Lichman et al., 2020）。
对于荆芥内酮合成，将来源于N. racemosa的NEPS1导入yWHR27构建菌株NTE03。观察到一对荆芥内酮异构体——顺-反式荆芥内酮和顺-顺式荆芥内酮的产生（图1C），共获得7.1 mg/L荆芥内酮（图1E）。顺-反式荆芥内酮标准品和菌株NTE03的产物均呈现相同的m/z 166 [M+H]+峰。顺-顺式荆芥内酮的含量基于顺-反式荆芥内酮标准品进行定量。NEPS1已被证明在体内和体外均可催化8-氧代香茅醇烯醇的环化及顺-反式荆芥内酯的脱氢反应生成荆芥内酮（Davies et al., 2021; Lichman et al., 2020）。尽管NEPS1被报道可将8-氧代香茅醇烯醇转化为荆芥内酯，但菌株NTE03未观察到荆芥内酯产生（图1E）。这一差异可归因于NEPS1的持续催化作用，导致中间代谢物被快速转化。
与菌株yWHR27相比，菌株NTE01、NTE02和NTE03的细胞生长速率较慢，生物量显著降低。类似地，此前研究也报道了构建荆芥内酯途径后出现细胞生长抑制（Davies et al., 2021），可能是自发环化产生的副产物损害了酵母生长（Hernández Lozada et al., 2022）。菌株NTE02和NTE03的生长状况略优于菌株NTE01，可能是由于引入了MLPL或NEPS1（见补充材料）。因此，在不使用昂贵诱导剂的情况下，成功在酿酒酵母中建立了荆芥内酯和荆芥内酮合成途径。
【数据】荆芥内酯产量：NTE01为1.9 mg/L，引入MLPL后NTE02为13.4 mg/L；荆芥内酮产量：NTE03为7.1 mg/L（顺-反式+顺-顺式异构体）；m/z峰：荆芥内酯168 [M+H]+，荆芥内酮166 [M+H]+
3.2 环烯醚萜合酶来源筛选与酶复合物构建优化荆芥内酯和荆芥内酮合成
在荆芥内酯和荆芥内酮途径中，ISY是将8-氧代香叶醛转化为8-氧代香茅醇烯醇的还原反应关键酶。由于ISY具有混杂还原酶的特性，它还能催化8-羟基香叶醇、8-氧代香叶醇和香叶醇转化为相应产物（Bat-Erdene et al., 2021; Jiang et al., 2021; Campbell et al., 2016）。因此，ISY的催化反应被认为是荆芥内酯和荆芥内酮途径中的限速步骤（Duan et al., 2021; Campbell et al., 2016）。研究者曾采用多步一锅法进行荆芥内酮生产，在体外G8H和GOR反应后加入ISY以避免非特异性底物催化（Bat-Erdene et al., 2021）。另一种策略是使用8-羟基香叶醇作为底物，以防止香叶醇被还原并尽量减少副产物形成（Billingsley et al., 2019; 2017）。尽管这些研究取得了可喜的成果，但这些方法耗时、费力且昂贵，不适合工业规模生产。
不同来源的ISY对不同底物天然具有不同的催化偏好和活性。因此，研究者期望测试HGO与不同ISY及其两两组合，以提高酵母中荆芥内酯和荆芥内酮的合成。基于前期研究，分别测试了来源于油橄榄（OeISY）、长春花（CrISY）和荆芥（NmISY）的ISY在体内的催化性能。将ISY和crHGO基因克隆并分别插入pRS415K和pRS424K质粒中，由GAL7启动子控制表达。如图2A所示，当与nmISY配对时，菌株NTE05和NTE08产生的荆芥内酯和荆芥内酮水平高于与其他菌株配对CrISY或OeISY的组合。与NmISY相比，CrISY对香叶醇生成香茅醇具有更强的催化能力，而NmISY似乎对其他底物（如8-氧代香叶醛）有较强的偏好，这可能与结合口袋和底物进入通道有关（Yu et al., 2024）。此外，使用多拷贝质粒过表达ISY并未产生积极效果。
在荆芥内酯和荆芥内酮合成中，HGO和ISY定位于酵母细胞质中（Watkins and Facchini, 2022）。酶复合物的构建可通过在细胞质中物理连接催化连续反应的酶来实现改进的催化效果（Jiang et al., 2021）。研究者实施了酶-酶融合策略，以增加底物邻近性、减少荆芥内酯途径非期望中间体的产生，并提高途径水平的效率（Liu et al., 2024）。通过柔性蛋白接头（GGGGS）2将crHGO与ISY融合，构建酶复合物（crHGO-crISY、crHGO-nmISY和crHGO-oeISY）。在所有crHGO-ISY融合的菌株中，荆芥内酯和荆芥内酮的产量均显著提高（图2B）。与对照菌株NTE05和NTE06相比，菌株NTE11和NTE12产生的荆芥内酯水平分别提高了190%和360%，达到47.1 mg/L和48.6 mg/L。与对照菌株NTE08和NTE09相比，菌株NTE14和NTE15产生的荆芥内酮水平分别提高了40%和150%，达到21.8 mg/L和23.2 mg/L。酶复合物可能阻止非特异性代谢物有效扩散至其催化中心，提高了荆芥内酯和荆芥内酮途径中的底物利用率。
【数据】荆芥内酯产量提升：NTE11比对照NTE05提高190%至47.1 mg/L，NTE12比对照NTE06提高360%至48.6 mg/L；荆芥内酮产量提升：NTE14比对照NTE08提高40%至21.8 mg/L，NTE15比对照NTE09提高150%至23.2 mg/L；融合接头：（GGGGS）2
3.3 基于"推-拉-阻断"策略提高荆芥内酮产量
（此部分原文节选未完整提供，以下基于可得内容翻译）
"推"策略被用于提高荆芥内酮浓度（图3A）。通过气相色谱和质谱检测到二氢荆芥内酮异构体（图3B）。"拉-阻断"策略结合两相系统（图3C）——有机相萃取将荆芥内酮从水相中分离，防止其进一步转化为二氢荆芥内酮。
【数据】原文未详述具体数值
3.4 辅因子工程改善酵母荆芥内酮生产的氧化还原途径
（此部分原文节选未完整提供，以下基于可得内容翻译）
图4A展示了由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）催化的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生的示意图。通过辅因子工程策略，测定了荆芥内酮浓度及NADPH/NADP+比值（图4B）。
【数据】原文未详述具体数值
3.5 稳健优化与补料分批发酵
（此部分原文节选未完整提供，以下基于可得内容翻译）
图5A为染色体整合示意图。通过稳健优化获得的菌株荆芥内酮产量如图5B所示——其中涉及醛还原酶中间体Ari1、醇脱氢酶6（Adh6）和旧黄酶3（Oye3）等基因的整合。图5C展示了八次重复批次实验的结果。通过染色体整合和两相发酵等生物过程优化，防止了荆芥内酮向二氢荆芥内酮的转化，最终获得高产菌株NTE21，产量达2.5 g/L。在5.0 L补料分批发酵中通过连续分批补料实现了4.5 g/L的创纪录产量。
【数据】NTE21菌株产量：2.5 g/L；5.0 L补料分批发酵产量：4.5 g/L
讨论与解读
本研究通过代谢工程与生物过程优化相结合的策略，成功克服了酿酒酵母合成荆芥内酮的瓶颈。关键创新点包括：ISY来源筛选确定NmISY为最优环烯醚萜合酶；crHGO-ISY酶融合策略使荆芥内酮产量提高40%–150%；辅因子工程改善NADPH再生；两相发酵防止荆芥内酮降解为二氢荆芥内酮。最终获得的高产菌株NTE21产量达2.5 g/L，补料分批发酵产量达4.5 g/L——这是目前微生物中荆芥内酮的最高报道浓度。该研究无需昂贵诱导剂即可实现荆芥内酮的从头生物合成，为工业化生产提供了潜在平台，也为微生物中环烯醚萜类化合物的生物合成优化提供了良好参考。
编译者解读：该研究展示了典型的"推-拉-阻断"代谢工程策略在萜类天然产物合成中的系统应用。值得关注的是，作者巧妙利用GAL启动子在葡萄糖耗尽后自动激活的特性，省去了半乳糖诱导剂的成本——这一设计对工业化放大具有重要意义。酶融合策略（crHGO-ISY）通过空间邻近效应提升代谢通量，思路简洁但效果显著。4.5 g/L的产量在植物源驱虫剂单体微生物合成中处于领先水平，但距离商业化生产（通常需>10 g/L）仍有差距。后续研究可关注发酵工艺的进一步放大验证及代谢副产物对酵母生长的抑制机制。
参考来源
Wang H. Efficient nepetalactone production in Saccharomyces cerevisiae via metabolic engineering and bioprocess optimization. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132440
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132440