来源：Enhanced triterpenoid biosynthesis in Wolfiporia cocos through combined metabolic pathway engineering and fermentation condition optimization（Journal of Industrial and Engineering Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
茯苓（Wolfiporia cocos）是我国传统"药食同源"真菌，其产生的羊毛脂烷型三萜类化合物（WCTs）具有抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。本研究通过过表达法尼基焦磷酸合酶（FDPS）和角鲨烯合酶（SQS）强化甲羟戊酸（MVA）途径，结合Box-Behnken设计优化发酵条件及玉米油添加策略，在10-L生物反应器中实现三萜产量53.3 mg/g（1252 mg/L）的突破性提升。该研究为药食用真菌作为高价值活性代谢物细胞工厂提供了可扩展的技术平台。
研究背景
茯苓作为担子菌门的褐腐真菌，其菌核在中国被称为"茯苓"，在北美被称为"Tuckahoe"或"Indian bread"，数百年来在东亚地区既作为药材也作为食用菌使用。茯苓是中医"药食同源"理念的典型代表，其产生的三萜类化合物（WCTs）被鉴定为主要生物活性成分，表现出抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和抗氧化等广泛的生物学活性。其中，猪苓酸（pachymic acid, PA）作为茯苓菌核的主要活性成分之一，尤其受到关注，凸显了WCTs作为功能性食品和新型治疗药物开发候选分子的价值。在自然界中，茯苓在松属植物根部形成大型菌核，通过降解松木中的纤维素、半纤维素和木质素获取营养。然而，菌核的形成高度依赖环境条件，商业栽培消耗大量木材资源。因此，开发基于液体发酵的替代生产策略具有重要的应用价值。
研究方法
菌株与培养条件
茯苓菌株CGMCC 5.78购自中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）。固体培养基采用PDA，于26℃培养。种子培养基含20 g/L葡萄糖、5 g/L蛋白胨、0.5 g/L KH₂PO₄和0.03 g/L MgSO₄。基础发酵培养基含30 g/L葡萄糖、7.5 g/L蛋白胨、1 g/L KH₂PO₄、0.03 g/L MgSO₄和0.1 g/L维生素B1，在25℃、160 rpm、5%接种量条件下培养。质粒在大肠杆菌DH5α中扩增，使用LB培养基。
RNA提取与操作
使用RNA纯化试剂盒（Simgen，中国）提取茯苓总RNA。核酸质量和数量通过凝胶电泳确定。样品经DNase I处理后，按照制造商方案（Vazyme，南京，中国）进行无内含子逆转录生成cDNA。
载体构建与茯苓遗传转化
FDPS基因（GenBank登录号：JN652836.1）和SQS基因（GenBank登录号：JN688664.1）长度分别为1086 bp和1497 bp，编码361和498个氨基酸的蛋白质，理论分子量分别为41.3 kDa和57.1 kDa。从cDNA中分别扩增茯苓FDPS和SQS基因，引物见Supporting Information表S1。含gpd启动子（来自灵芝，NCBI登录号：DQ404345.1）、潮霉素B抗性和trpC终止子的pBluescript SK质粒经线性化后，用T4连接酶将FDPS/SQS基因插入Asc I和Not I位点之间。收集茯苓菌丝体并用溶菌酶（广东省微生物菌种保藏中心，GDMCC）破壁。如前所述，重组质粒通过聚乙二醇介导与茯苓原生质体融合。简言之，PEG/CaCl₂转化法操作如下：100 µL原生质体悬浮液（约100个原生质体/mL）与10 µL载体（1 µg/µL）混合，冰上放置5 min。随后加入2 mL PTC溶液（60%（w/v）PEG3350、10 mM Tris-HCl（pH 7.5）和50 mM CaCl₂），室温静置30 min。然后加入30 mL MTC缓冲液（0.6 M甘露醇、10 mM Tris-HCl（pH 7.5）和50 mM CaCl₂），3000 rpm离心5 min。所得沉淀重悬于2 mL RCM培养基（0.2%胰蛋白胨、0.2%酵母提取物、2%葡萄糖和0.6 M甘露醇）中，25℃孵育48 h。候选转化子在含0.6 M甘露醇和100 μg/mL潮霉素的PDA培养基中筛选。阳性转化子通过PCR、Western Blot和RT-qPCR鉴定。原始pBluescript SK质粒含RPF基因，在荧光显微镜下呈红色。通过酶切和一步克隆将FDPS/SQS基因替换RPF基因。
【数据】菌株：W. cocos CGMCC 5.78；培养基：PDA/种子培养基/基础发酵培养基；温度：25-26℃；转速：160 rpm；接种量：5%；FDPS基因：1086 bp，41.3 kDa；SQS基因：1497 bp，57.1 kDa；PEG3350浓度：60%（w/v）；潮霉素：100 μg/mL
蛋白提取与Western blotting
新鲜转化茯苓种子菌丝体在PDA上培养3-4天。收集0.1-0.2 g菌丝体，液氮速冻。加入1 mL裂解液和10 μL苯甲基磺酰氟（100 mM PMSF），冰上孵育20 min进行蛋白提取。离心收集上清液。蛋白质经考马斯亮蓝染色可视化。随后，等浓度蛋白样品上样至12%（w/v）SDS聚丙烯酰胺凝胶，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，与兔单克隆抗HA一抗（Abcam，1:500稀释）在4℃含3% FCS条件下孵育12 h。加入二抗前，用PBS洗涤10次。然后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗（Sigma，德国，1:1000稀释）反应使抗原-抗体结合物可视化。加入显色液实现显色反应。使用ChemiDoc MP成像系统成像，Gel-Pro32软件分析结果。
【数据】菌丝体用量：0.1-0.2 g；PMSF浓度：100 mM；SDS-PAGE：12%；一抗稀释度：1:500；二抗稀释度：1:1000；孵育温度：4℃；孵育时间：12 h
定量逆转录PCR（qRT-PCR）分析
菌株在对数期收获。引物设计使用Primer Premier软件。分析的基因和引物见Supporting Information表S2。qRT-PCR使用SYBR Green PCR Master Mix（Vazyme，南京，中国）在StepOnePlus实时PCR系统（Applied Biosystems，美国）上进行。转录水平根据2^(−△△Ct)确定，以his3-1基因作为内参基因进行归一化。每个样品进行三次重复，并设一个阴性对照。数值和误差线代表平均值和标准差。∗∗∗p < 0.001，∗∗p < 0.01，∗p < 0.05（双尾t检验）。
【数据】内参基因：his3-1；统计方法：双尾t检验；显著性水平：∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗∗p < 0.001
生物量与总三萜含量测定
茯苓菌丝体离心沉淀，蒸馏水洗涤3次，50℃干燥测定细胞干重（DCW）。随后，干燥菌丝体研磨后用乙醇提取三萜。三萜含量基于香草醛-高氯酸比色反应，通过分光光度法测定。
【数据】干燥温度：50℃；提取溶剂：乙醇；检测方法：香草醛-高氯酸比色法
发酵条件优化
基础发酵培养基含30 g/L葡萄糖、7.5 g/L蛋白胨、1 g/L KH₂PO₄、0.03 g/L MgSO₄和0.1 g/L维生素B1，初始培养条件为25℃、160 rpm、5%接种量。根据需要分别改变碳源、氮源、微量元素、培养温度、接种量和摇瓶转速。对于Box-Behnken设计（BBD），使用Design Expert软件（Design-Expert 12）建立三因素三水平BBD。总三萜含量作为响应值，每次试验取平均值（n = 3）。回归模型的充分性通过决定系数调整R²和R²评估，回归模型与系数间的显著差异通过F检验评估，p < 0.05认为显著。所有优化因子用于强化发酵。在最优条件基础上，分别以1%（v/v）添加大豆油、花生油、玉米油和菜籽油等不同植物油。所有植物油均为试剂级。
对于10-L生物反应器实验，茯苓先在PDA培养基中培养4天。然后，菌丝体转移至摇床（180 rpm，27℃）培养7天获得一级种子培养物。重复该过程，在优化条件下培养7天获得二级种子培养物。随后，将10%（v/v）种子液加入发酵培养基（10-L生物反应器装液量6 L）。搅拌速度设定为180 rpm，通气量为0.3 vvm，恒定pH 5.5，温度27℃。每12小时间隔测定三萜含量、葡萄糖和菌丝体含量，连续取样至144 h。茯苓对葡萄糖的消耗经实验测定并确证完全消耗。
【数据】BBD设计：三因素三水平；植物油添加量：1%（v/v）；10-L反应器装液量：6 L；搅拌速度：180 rpm；通气量：0.3 vvm；pH：5.5；温度：27℃；取样间隔：12 h；总培养时间：144 h；种子液接种量：10%（v/v）
HPLC-MS测定
收获的菌丝体用乙醇提取，使用配备ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）的HPLC（ACQUITY UPLC I-Class）联用质谱仪（Thermo-Obritrap-QE HF，Thermo Fisher Scientific）进行分析。质谱在正离子和负离子扫描模式下采集。流动相A：H₂O（含0.1%甲酸），流动相B：乙腈，流速0.35 mL/min，洗脱程序：0 min，A = 95%；0-10 min，A = 95%-20%；20-35 min，A = 10%；15.1-16 min，A = 95%；检测波长λ = 210-400 nm。基峰色谱图（BPCs）通过绘制每个保留时间最丰富离子的强度获得，用于可视化整体代谢谱。
【数据】色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.35 mL/min；检测波长：210-400 nm；流动相A：0.1%甲酸水；流动相B：乙腈
研究结果
FDPS和SQS过表达的功能表征
FDPS是法尼基二磷酸合酶，SQS是角鲨烯合酶。FDPS催化二甲基烯丙基-PP转化为法尼基二磷酸，随后由SQS催化形成角鲨烯，这些是三萜生物合成的潜在分子靶点和关键酶。为探究FDPS和SQS在调控WCTs生物合成中的作用，研究绘制了MVA途径（图1A），并使用pBluescript SK质粒过表达FDPS和SQS（图1B）。以红色荧光蛋白（RFP）为报告基因的重组质粒转化茯苓原生质体，在荧光显微镜下观察到表达RFP的转化子（图1C），确认构建体成功导入并表达。随后，FDPS和SQS基因分别克隆至携带灵芝甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gpd）启动子的pBluescript SK载体中进行功能表征。Western blot分析进一步验证了FDPS（41.3 kDa）和SQS（57.1 kDa）在选定转化子中的表达（图1D）。qRT-PCR分析显示，与WT菌株相比，FDPS和SQS过表达菌株中各自的转录水平显著升高（图1E）。相应地，FDPS过表达菌株中三萜产量显著增加，其中FDPS-2产量最高，比WT增加约0.66倍（图1F）。SQS过表达也增强了三萜积累，但程度较小。
这些结果表明，FDPS和SQS都是茯苓三萜生物合成的关键酶和代谢工程的潜在分子靶点。值得注意的是，FDPS过表达对三萜积累的促进效果强于SQS，提示法尼基二磷酸节点的通量可能是该途径的主要限速步骤。在灵芝中，同源FPS和SQS基因分别过表达后，灵芝酸产量分别达到2.76 mg/100 mg DCW和1.87 mg/100 mg DCW，分别比WT菌株高2.28倍和1.25倍。这一趋势不仅在药食用真菌中观察到，在积雪草和人参等药用植物中也有类似报道。
【数据】FDPS-2三萜产量：较WT增加约0.66倍；灵芝FPS过表达：2.76 mg/100 mg DCW（2.28倍）；灵芝SQS过表达：1.87 mg/100 mg DCW（1.25倍）
FDPS/SQS过表达对茯苓三萜生物合成途径基因的影响
为深入探究FDPS和SQS如何调控三萜生物合成的代谢通量，研究检测了表现最佳的FDPS-2和SQS-1转化子中MVA途径关键基因的转录水平（图2）。qRT-PCR分析显示，FDPS过表达显著增强了上游基因的表达，特别是MVK和PMD，分别比WT菌株提高2.1倍和1.5倍（图2B）。相比之下，SQS过表达菌株表现出不同的转录谱。MVK和FDPS的表达显著受刺激，尤其是MVK，比WT增加4.4倍。MVK的强烈上调表明，甲羟戊酸激酶催化的甲羟戊酸向甲羟戊酸-5-PP的转化是一个关键步骤，对下游角鲨烯合成的增强敏感。鉴于甲羟戊酸激酶已知会受到牻牛儿基或法尼基二磷酸过量积累的反馈抑制，FDPS-2菌株中MVK表达相对较低（2.1倍）与SQS-1菌株（4.4倍）的差异似乎反映了这种调控动态。
虽然该工程策略成功增加了法尼基二磷酸（FPP）和角鲨烯的可用性，但当下游酶促步骤受限时，上游代谢通量的增强并不会自动导致最终产物成比例增加。三萜骨架通常通过修饰酶进一步转化为更复杂的分子；然而，负责羊毛甾醇形成及后续氧化修饰的下游酶——包括氧化角鲨烯环化酶（OSCs）和细胞色素P450单加氧酶——可能缺乏足够的催化能力来完全容纳增加的上游通量。这种瓶颈效应在其他产三萜真菌和植物中也有报道，强调了整个途径协调调控的重要性。这些结果表明，在上游通量增加的条件下，缓解下游酶促约束可进一步增强WCTs的生物合成。
总体而言，这些结果表明FDPS或SQS的过表达不仅增强了三萜产量，还对MVA途径各基因产生了广泛的转录调控效应。MVK、PMD、FDPS、SQS、SE和LS表达的协调变化暗示，上游和下游酶促步骤之间的协同调控对于维持茯苓三萜生物合成的平衡通量至关重要。这种整合调控可作为进一步代谢工程以缓解途径瓶颈、实现更高产物产量的基础。
【数据】FDPS-2菌株MVK表达：WT的2.1倍；FDPS-2菌株PMD表达：WT的1.5倍；SQS-1菌株MVK表达：WT的4.4倍
发酵条件优化以增强三萜产量
培养基和发酵条件的调控已被证明是增强细胞生长和产物生物合成的有效且易操作的策略，有助于实现三萜的经济高效生产。为进一步提高茯苓三萜产量，研究系统评估了FDPS-2菌株中碳源、氮源和金属离子等主要培养参数的影响。如图3A所示，葡萄糖被确定为最有效的碳源，产生最高的三萜积累量（18.4 mg/g DCW），而淀粉、蔗糖和麦芽糖支持的产量略低。随后评估了不同氮源，酵母提取物被确定为最有效的三萜生物合成促进剂（图3B）。值得注意的是，使用麦麸作为氮源导致WCTs产量显著降低24%。麦麸含有高水平的纤维素、半纤维素和木质素等不溶性成分，含有复杂的氮形式。茯苓可能有限的水解和利用这些大分子氮源的能力，导致可利用氮的可用性降低，从而降低次级代谢的代谢通量。
一些微量金属通过影响底物运输和酶催化活性表现出调控作用。用Zn²⁺替代原始微量元素Mg²⁺显著增强了WCTs积累（图3C）。相反，铜离子或铁离子对WCTs产量无显著影响，表明锌离子可能作为茯苓MVA途径中关键酶的重要辅因子。此外，对温度、接种量和转速等单因素进行了研究，发现它们对三萜产量有显著影响。对于大多数食用真菌，低温（20-30℃）环境通常是适宜的。在27℃时获得最大三萜含量（25.9 mg/g）（图3D），表明适中温度有利于酶活性和代谢稳定性。随后，分别测试了接种量和转速对发酵的影响。同样，10%接种量和180 rpm转速实现了最佳生产力（图3E和F），而较高的接种量导致营养耗竭和次级代谢降低，180 rpm转速则提供了良好的混合和氧传递。
【数据】最佳碳源：葡萄糖（18.4 mg/g DCW）；最佳氮源：酵母提取物；麦麸导致WCTs降低24%；Zn²⁺替代Mg²⁺显著增强WCTs；最佳温度：27℃（25.9 mg/g）；最佳接种量：10%；最佳转速：180 rpm
植物油添加及玉米油浓度对三萜产量的影响
在前期优化条件的基础上，研究考察了1%（v/v）不同植物油（大豆油、花生油、玉米油、菜籽油）添加对三萜产量的影响（原文图4A），并进一步优化了玉米油的添加浓度（原文图4B）。
【数据】植物油添加量：1%（v/v）
10-L生物反应器放大培养
在10-L生物反应器实验中，使用前期优化培养基并添加2%（v/v）玉米油，监测了总三萜产量、细胞干重和葡萄糖消耗的动态变化（图5A）。图5B展示了茯苓菌核、10-L生物反应器培养及产物的图像。
【数据】玉米油添加量：2%（v/v）；反应器规模：10-L
WCTs对白血病细胞的体外抗肿瘤活性
体外抗肿瘤活性实验显示，不同总三萜含量的WCTs对K562细胞具有抑制作用（图6A），5-氟尿嘧啶（5-FU，50 μg/mL）作为阳性对照，DMSO作为阴性对照。在相同处理条件下，WCTs对L1210细胞也表现出抑制作用（图6B）。WCTs表现出剂量依赖性的体外抗肿瘤活性，对K562和L1210白血病细胞生长的抑制率超过60%。
【数据】阳性对照：5-FU（50 μg/mL）；K562抑制率：>60%；L1210抑制率：>60%
讨论与解读
本研究通过过表达FDPS和SQS基因强化MVA途径，结合BBD设计和玉米油添加优化发酵条件，成功构建了茯苓真菌细胞工厂。在10-L生物反应器中，工程菌株FDPS-2的三萜产量达到53.3 mg/g和1252 mg/L，其中猪苓酸、茯苓酸和2,3-羟基白桦脂酸浓度分别达到2.51、52.1和21.2 mg/L。WCTs表现出剂量依赖性的体外抗肿瘤活性，对K562和L1210白血病细胞生长的抑制率超过60%。这些结果确立了工程化茯苓的液体发酵作为生物活性三萜生产的可扩展平台，为开发其他药食用真菌作为高价值生物活性代谢物的细胞工厂提供了实用参考。
编译者解读
本研究展示了典型的"上游途径工程+下游发酵优化"组合策略在丝状真菌中的应用价值。FDPS过表达比SQS效果更佳（0.66倍 vs 较小幅度），提示FPP节点是茯苓三萜途径的关键限速位点——这一发现对同类真菌的代谢工程改造具有直接参考意义。玉米油添加策略巧妙利用了"油-水两相"体系可能增强底物传递和三萜外排的机制，10-L规模放大后产量不降反升（53.3 mg/g），说明该策略具有良好的工业放大潜力。值得注意的是，虽然三萜总量可观，但目标产物猪苓酸仅2.51 mg/L，提示下游P450等修饰酶的催化效率仍是进一步提升特定高值组分产量的瓶颈，未来可考虑多基因共过表达或启动子工程来解锁下游通量。
DOI: 10.1016/j.jiec.2026.02.045