来源：Enhanced rhamnolipid production in Pseudomonas putida through systematic medium optimization and metabolic engineering（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
鼠李糖脂作为最具应用前景的生物表面活性剂，长期受限于产量低、成本高的瓶颈。本研究以非致病性恶臭假单胞菌KT2440为底盘，通过响应面法系统优化培养基组成，使摇瓶产量从1.5 g/L提升至6.1 g/L；进而结合转录组分析与代谢工程改造，过表达鼠李糖前体与脂肪酸合成关键基因，最终在5 L生物反应器中实现40.2 g/L的鼠李糖脂产量，产率达0.56 g/L/h，为目前工程化恶臭假单胞菌的最高报道水平。
研究背景
鼠李糖脂是由微生物产生的两亲性生物表面活性剂，其分子结构由亲水的鼠李糖头部和疏水的脂肪酸尾部组成。这种独特结构赋予其优异的表面活性，能有效降低表面张力和界面张力。除传统表面活性剂的润湿、起泡、乳化等性能外，鼠李糖脂还具备快速生物降解性、低毒性、高选择性和特异性、耐受极端温度/pH/盐度以及抗菌活性等优越特性，应用领域涵盖提高采油率、化妆品、清洁、农业、生物修复和生物医学等。尽管Evonik公司在斯洛伐克建立了首个商业鼠李糖脂生产工厂，但当前生产成本仍显著高于传统石化表面活性剂，主要症结在于产量低和底物昂贵。因此，如何在非致病性宿主中实现鼠李糖脂的高效低成本生产，成为合成生物学研究的焦点。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用全部菌株和质粒详列于补充表S1和S2。以实验室保存的恶臭假单胞菌Δflag（Pang et al., 2024）作为鼠李糖脂合成宿主。大肠杆菌DH5α作为质粒构建的克隆宿主。实验室前期构建并保存的pBBR1MCS5和pMEKa质粒用于基因过表达。
【数据】菌株：P. putida Δflag、E. coli DH5α；质粒：pBBR1MCS5、pMEKa
2.2 基于响应面法的培养基优化
发酵培养基通过RSM进行优化。首先进行单因素试验，确定碳源、氮源和磷酸盐的最佳培养基配方；随后采用Plackett-Burman设计（PBD）鉴定影响鼠李糖脂产量的关键因素；接着通过最陡爬坡实验逐步逼近这些因素的最优水平；最后应用Box-Behnken设计（BBD）精确确定最优值。
在单因素试验中，亲水性碳源（葡萄糖、甘油）各以10 g/L、疏水性碳源（菜籽油、大豆油、玉米油、橄榄油、葵花籽油、油酸甲酯、棕榈酸甲酯、二甲基硅油）各以1%（v/v）分别添加至Luria-Bertani（LB）培养基中，评估不同碳源对鼠李糖脂产量的影响。选择LB培养基进行初始筛选，是因为其在恶臭假单胞菌鼠李糖脂生产中常用（Pang et al., 2025; Pang et al., 2024），便于与前期研究直接比较，并为后续优化奠定产量基础。
随后，在优化碳源的基础上，分别添加20 g/L有机氮源（尿素、酵母提取物）和无机氮源（(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NaNO₃），评估不同氮源的影响。接着测试混合氮源，并筛选磷酸盐KH₂PO₄和Na₂HPO₄。基于上述基础配方，进一步设计单因素实验微调各培养基组分浓度。评估的培养基组分包括葡萄糖（A）、甘油（B）、酵母提取物（C）、NaNO₃（D）、KH₂PO₄（E）、Na₂HPO₄（F）和金属离子溶液（G），实验设计矩阵详见表S3。金属离子溶液由以下化合物组成（除非另有说明，各浓度均为10 g/L）：CuSO₄·5H₂O、ZnSO₄·7H₂O、MgSO₄·7H₂O、FeSO₄·7H₂O、MnSO₄和NiCl₂·6H₂O（0.25 g/L）。
基于上述结果确定各因素的高、低水平，采用PBD实验评估这些因素的相对显著性。使用Minitab软件共设计12组实验，详见表S4。使用Design Expert 8.0版进行统计分析，基于方差分析（ANOVA），p值<0.05的因素视为统计显著。随后，对四个关键因素——葡萄糖（A）、甘油（B）、酵母提取物（C）、NaNO₃（D）进行最陡爬坡实验，以确定其最优水平（表S5）（Jiang et al., 2025; Yan et al., 2021）。基于这些结果，采用BBD进一步优化这四个关键因素的浓度。这些因素在三个水平进行测试：高（+1）、中（0）、低（−1），详见表S6。对于统计不显著的因素，正效应组分设为高水平，负效应组分设为低水平。共进行29组实验，使用二阶多项式方程对响应与变量之间的关系进行建模（表S7）。该模型预测的最优配方称为RSM培养基，随后通过实验验证。
【数据】碳源：葡萄糖/甘油各10 g/L，疏水性碳源1%（v/v）；氮源：20 g/L；金属离子溶液各组分10 g/L（NiCl₂·6H₂O为0.25 g/L）；PBD实验：12组；BBD实验：29组；显著性阈值：p<0.05
2.3 RNA-seq分析
将菌株AB-Δflag在LBG（LB+1%葡萄糖）或RSM培养基中培养，进行RNA-seq分析。简要流程如下：首先将单菌落接种于10 mL LB中过夜培养制备种子液，以2%接种量转移至50 mL LBG或RSM培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养。分别在24 h和72 h取样，用无菌水洗涤后立即置于液氮中冷冻。样品随后送至Novogene进行后续分析。
【数据】接种量：2%；培养基：50 mL LBG或RSM；温度：30°C；转速：200 rpm；取样时间：24 h、72 h
2.4 质粒构建与基因操作
为构建过表达质粒，分别从恶臭假单胞菌KT2440和铜绿假单胞菌PAO1中扩增脂肪酸合成相关基因（包括accA、accBC、accD、fabA、fabB、fabD、fabI和fabG）和dTDP-L-鼠李糖合成基因（rmlBDAC）。这些扩增片段与从恶臭假单胞菌KT2440获得的启动子P10、P51和P46融合。所得构建体与rhlAB基因一起连接至线性化的pBBR1MCS5或pMEKa载体，生成详见表S2的重组质粒。将目标质粒电转化至恶臭假单胞菌Δflag中，生成详见表S1的菌株。
【数据】基因来源：P. putida KT2440、P. aeruginosa PAO1；启动子：P10、P51、P46；质粒载体：pBBR1MCS5、pMEKa
2.5 摇瓶培养
摇瓶发酵时，将单菌落接种于10 mL LB培养基中，37°C培养12–16 h。随后以2%（v/v）接种量转移至250 mL摇瓶中的50 mL RSM培养基，于30°C、200 rpm振荡培养72 h。RSM培养基组成为：15.9 g/L葡萄糖、13.6 g/L甘油、18.8 g/L酵母提取物、8.4 g/L NaNO₃、4 g/L KH₂PO₄、1 g/L Na₂HPO₄和2 mL/L金属离子溶液。对于含有pBBR1MCS5或/和pMEKa衍生质粒的菌株，在发酵培养基中添加50 µg/mL庆大霉素或/和50 µg/mL卡那霉素。当OD₆₀₀达到0.6时，向含有pMEKa衍生质粒的菌株培养物中添加0.5 mM IPTG。
【数据】种子培养：10 mL LB、37°C、12–16 h；接种量：2%（v/v）；发酵体系：50 mL RSM/250 mL摇瓶；温度：30°C；转速：200 rpm；时间：72 h；RSM培养基：15.9 g/L葡萄糖、13.6 g/L甘油、18.8 g/L酵母提取物、8.4 g/L NaNO₃、4 g/L KH₂PO₄、1 g/L Na₂HPO₄、2 mL/L金属离子溶液；抗生素：50 µg/mL庆大霉素、50 µg/mL卡那霉素；IPTG：0.5 mM（OD₆₀₀=0.6时添加）
2.6 5 L生物反应器补料分批发酵
补料分批发酵在5 L发酵罐（BIOTECH-5BG，中国宝兴）中进行。菌株在10 mL LB中过夜培养制备一级种子液。将5%（v/v）一级种子液转移至500 mL摇瓶中的200 mL LB培养基，于30°C、200 rpm振荡培养8 h制备二级种子液。随后将培养物接种至含2 L RSM培养基的5 L生物反应器中，并添加2 mL消泡剂XPJ770（江苏赛欧欣悦消泡剂有限公司）。通过自动添加25% H₃PO₄或50% NH₃·H₂O（v/v）维持pH为7.0。在补料前，搅拌速度自动控制以维持溶解氧（DO）水平在30%–50%范围内。初始碳源耗尽后，搅拌速度固定为500 rpm，自动调节补料以维持DO水平在30%–50%之间。在12 h时添加IPTG至终浓度0.5 mM，诱导鼠李糖脂合成。补料开始时的补料培养基含325 g/L葡萄糖、275 g/L甘油和100 g/L酵母提取物。补料培养基自动添加以维持DO水平在30%–50%之间。添加消泡剂XPJ770以保持泡沫水平低于发酵罐体积的60%。为进一步增强鼠李糖脂合成，在RSM培养基中补充2 g/L一水柠檬酸、0.3 g/L柠檬酸铁铵、2 g/L甜菜碱、0.005 g/L维生素B1和0.005 g/L维生素B12。
【数据】发酵罐：5 L（BIOTECH-5BG）；一级种子：10 mL LB过夜；二级种子：5%（v/v）接种至200 mL LB、30°C、200 rpm、8 h；发酵体系：2 L RSM培养基；消泡剂：2 mL XPJ770；pH：7.0（25% H₃PO₄/50% NH₃·H₂O）；DO：30%–50%；搅拌：补料前自动控制，补料后固定500 rpm；IPTG：0.5 mM（12 h）；补料培养基：325 g/L葡萄糖、275 g/L甘油、100 g/L酵母提取物；补充组分：2 g/L柠檬酸、0.3 g/L柠檬酸铁铵、2 g/L甜菜碱、0.005 g/L维生素B1、0.005 g/L维生素B12
2.7 分析方法
鼠李糖脂浓度按照前期描述的方法测定（Pang et al., 2024）。简要流程：将培养上清液与等体积乙腈混合，4°C静置过夜，随后离心。所得上清液直接用配备Corona带电气溶胶检测器和NUCLEODUR C18 Gravity色谱柱（Macherey-Nagel GmbH & Co. KG，Düren，德国）的UHPLC系统（Thermo Fisher Scientific，美国）分析。流动相为二元梯度系统。
【数据】前处理：上清液与乙腈等体积混合、4°C过夜、离心；检测：UHPLC-电雾式检测器；色谱柱：NUCLEODUR C18 Gravity
研究结果
3.1 系统培养基优化大幅提升鼠李糖脂生物合成
使用前期构建的工程菌株恶臭假单胞菌AB-Δflag对发酵培养基进行系统优化。该菌株是恶臭假单胞菌KT2440的衍生菌株，表达异源rhlAB基因并删除了鞭毛基因簇（Pang et al., 2024）。
首先通过单因素试验评估不同类型和浓度的碳源、氮源、磷酸盐和金属离子对鼠李糖脂产量的影响。在碳源方面，考虑到疏水性底物可能具有消泡特性，同时评估了亲水性碳源（葡萄糖、甘油）和八种疏水性碳源（菜籽油、大豆油、玉米油、橄榄油、葵花籽油、油酸甲酯、棕榈酸甲酯、二甲基硅油）。每种碳源分别以10 g/L或1%（v/v）单独添加至LB培养基中进行摇瓶发酵。结果表明，在疏水性碳源中，油酸甲酯对细胞生长的促进作用最为显著，72 h后OD₆₀₀达到8.8；其次是棕榈酸甲酯，OD₆₀₀达到7.9。然而，鼠李糖脂滴度并未随生物量成比例增加。值得注意的是，尽管油酸甲酯组生长最佳，但未检测到鼠李糖脂产生；棕榈酸甲酯组仅达到1.2 g/L。这表明碳通量主要流向生物量积累而非鼠李糖脂合成（图1A）。
相比之下，亲水性碳源（葡萄糖和甘油）有效促进了产物合成，72 h后滴度分别为1.7 g/L和2.4 g/L（图1A）。前期研究表明，葡萄糖和甘油的混合碳源可协同增强鼠李糖脂产量（Pang et al., 2024）。因此，后续优化以10 g/L葡萄糖和10 g/L甘油作为碳源。
在氮源优化中，分别向上述优化培养基中添加20 g/L有机氮源（尿素、酵母提取物）或无机氮源（(NH₄)₂SO₄、NH₄Cl、NaNO₃），评估对鼠李糖脂产量的影响。结果表明，酵母提取物不仅显著促进细胞生长，还使鼠李糖脂合成获得最大改善。72 h后滴度达到1.9 g/L，OD₆₀₀为6.5。在无机氮源中，NaNO₃表现出有利效果，而以(NH₄)₂SO₄或NH₄Cl作为唯一氮源时，鼠李糖脂合成被完全抑制（图1B）。鉴于前期研究在铜绿假单胞菌发酵中使用了酵母提取物与无机氮源（NaNO₃或(NH₄)₂SO₄）的组合（Moutinho et al., 2021; Wongsirichot & Winterburn, 2025），进一步研究了酵母提取物和NaNO₃作为混合氮源对鼠李糖脂产量的影响。结果显示，使用30 g/L酵母提取物和16 g/L NaNO₃比单独使用任一氮源更能提高鼠李糖脂产量（图S1）。
磷酸盐和金属离子在鼠李糖脂生物合成中发挥关键作用（Alcalde et al., 2024）。磷酸盐既是细胞大分子的必需组分，又是生长和次级代谢的关键调控因子（Alcalde et al., 2024）。同时，铁等金属离子是酶发挥特定催化活性所不可或缺的辅助因子（Sun et al., 2023）。综合优化的磷酸盐浓度（图S1）和前期报道的金属离子溶液水平（Glick et al., 2010; Shatila et al., 2020），后续优化的初始浓度设定为：2 g/L KH₂PO₄、4 g/L Na₂HPO₄和1 mL/L金属离子溶液。
基于上述基础培养基配方，进一步设计单因素实验精细优化各组分浓度。在0–30 g/L葡萄糖范围内，细胞生长随葡萄糖浓度升高而增加，而鼠李糖脂产量在10 g/L葡萄糖时达到峰值3.4 g/L（图1C）。对于甘油，细胞生长和鼠李糖脂滴度均在20 g/L时达到最优（图1D）。值得注意的是，酵母提取物、NaNO₃和KH₂PO₄在产物合成与细胞生长之间表现出明显的解偶联现象：鼠李糖脂滴度分别在20 g/L酵母提取物、8 g/L NaNO₃和3 g/L KH₂PO₄时达到最高；而OD₆₀₀最大值分别在30 g/L酵母提取物、16 g/L NaNO₃和2 g/L KH₂PO₄时观察到（图1E、1F和1G）。Na₂HPO₄和金属离子溶液对鼠李糖脂滴度影响较小，最优条件分别为2 g/L和1.5 mL/L（图1H和1I）。
基于上述单因素实验，采用PBD实验进一步鉴定影响鼠李糖脂产量的关键因素。实验设计矩阵和对应鼠李糖脂滴度见表S4，统计分析结果见表1。在7个测试因素中，葡萄糖（A）、甘油（B）、酵母提取物（C）和NaNO₃（D）被鉴定为显著因素（p<0.05），表明碳源和氮源对鼠李糖脂合成的影响更为突出。在这些因素中，酵母提取物的效应值最高，表明其对鼠李糖脂产量的影响最为显著。KH₂PO₄（E）、Na₂HPO₄（F）和金属离子溶液（G）为非显著因素，因此在后续实验中分别固定为4 g/L、1 g/L和2 mL/L。
通过最陡爬坡法对显著因素进行进一步优化，发现第2组鼠李糖脂产量最高，最优浓度为：12 g/L葡萄糖、15 g/L甘油、20 g/L酵母提取物和9 g/L NaNO₃（表S5）。随后，使用Design-Expert软件在三个水平上进行BBD实验，以进一步优化这四个关键因素。共进行29组实验，分析因素间的相互作用并确定最优组合。详细实验设计和结果见表S6。最终得到的回归方程如下：
Y = -5.54366 + 0.524274A + 0.631923B + 0.181243C + 0.648902D - 0.003514AB + 0.003538AC - 0.001290AD + 0.008949BC + 0.08316BD + 0.000825CD - 0.023346A² - 0.030040B² - 0.009717C² - 0.044821D²
其中Y代表鼠李糖脂滴度，A、B、C、D分别代表葡萄糖、甘油、酵母提取物和NaNO₃的编码值。回归模型的ANOVA分析（表2）显示p值<0.0001，失拟值为0.3980，表明回归模型可靠。针对每对因素生成了三维（3D）响应面图。如图2所示，响应面的峰值位于实验设计空间内，证实了变量设计的合理性以及进一步优化以最大化响应的潜力。
根据软件分析，预测最大鼠李糖脂滴度为5.9 g/L，四个显著因素的最优水平为：葡萄糖15.9 g/L、甘油13.6 g/L、酵母提取物18.8 g/L、NaNO₃ 8.4 g/L。
【数据】油酸甲酯组：OD₆₀₀=8.8，鼠李糖脂未检出；棕榈酸甲酯组：OD₆₀₀=7.9，鼠李糖脂1.2 g/L；葡萄糖组：鼠李糖脂1.7 g/L；甘油组：鼠李糖脂2.4 g/L；酵母提取物组：鼠李糖脂1.9 g/L、OD₆₀₀=6.5；最优葡萄糖浓度：10 g/L（3.4 g/L）；最优甘油浓度：20 g/L；最优酵母提取物浓度：20 g/L；最优NaNO₃浓度：8 g/L；最优KH₂PO₄浓度：3 g/L；PBD显著因素：A、B、C、D（p<0.05）；最陡爬坡最优组：12 g/L葡萄糖、15 g/L甘油、20 g/L酵母提取物、9 g/L NaNO₃；BBD：29组实验；模型p<0.0001，失拟值0.3980；预测最大产量：5.9 g/L（15.9 g/L葡萄糖、13.6 g/L甘油、18.8 g/L酵母提取物、8.4 g/L NaNO₃）
3.2 转录组分析揭示碳代谢重编程与营养摄取增强
为验证实验模型的准确性，分别使用初始LBG培养基和优化后的RSM培养基进行摇瓶发酵实验。如图3所示，在RSM培养基中，菌株AB-Δflag在整个发酵过程中的生长显著增强。具体而言，与LBG培养基相比，12 h时生长提高了44.9%，72 h时提高了53.6%（图3A）。同时，鼠李糖脂滴度在72 h时达到6.1 g/L，较LBG培养基中的1.5 g/L提高了306.7%（图3B）。
【数据】RSM vs LBG生长提升：12 h提高44.9%、72 h提高53.6%；鼠李糖脂滴度：RSM培养基6.1 g/L vs LBG培养基1.5 g/L，提高306.7%
（注：原文结果节选至此，后续3.2节转录组分析及3.3节代谢工程内容在提供的原文节选范围内未完整呈现。基于摘要信息，工程菌株accAD-fabD-R在摇瓶中达到9.8 g/L，5 L生物反应器中达到40.2 g/L，产率0.56 g/L/h，产率系数0.33 g/g碳源。图4和图5分别展示了前体供给工程和5 L发酵罐补料分批发酵的结果。）
讨论与解读
本研究通过"培养基优化—转录组解析—代谢工程改造"的三步策略，系统提升了恶臭假单胞菌的鼠李糖脂合成能力。响应面法将产量从1.5 g/L提升至6.1 g/L（提高306.7%），转录组分析揭示了碳代谢流向的重新编程——Entner-Doudoroff通路通量增强、周质通路通量降低、营养摄取改善，但鼠李糖脂合成通路本身并未显著上调。这一发现精准定位了产量瓶颈：前体供给不足而非合成途径表达受限。据此，过表达鼠李糖合成基因（rmlBDAC）和脂肪酸合成基因（accA、accD、fabD）的工程菌株accAD-fabD-R在摇瓶中达到9.8 g/L，在5 L生物反应器中达到40.2 g/L，产率0.56 g/L/h，为工程化恶臭假单胞菌的最高报道水平。
编译者解读
该研究的价值在于其方法论的系统性——先用组学数据"诊断"瓶颈，再有针对性地进行代谢工程改造，避免了盲目过表达。混合碳源策略（葡萄糖+甘油）和混合氮源策略（酵母提取物+NaNO₃）的协同效应在工业发酵中具有直接适用性。值得注意的是，疏水性碳源虽促进生长却抑制产物合成这一反直觉发现，为底物选择提供了重要警示。局限在于：40.2 g/L的产量虽在假单胞菌中领先，但相比铜绿假单胞菌的工业生产水平仍有差距；且补料培养基中昂贵的酵母提取物和多种维生素添加剂的工业化成本有待评估。未来若能通过适应性进化或动态调控进一步优化碳氮代谢流的分配，有望推动鼠李糖脂的产业化进程。
参考来源
Pang A.-P. Enhanced rhamnolipid production in Pseudomonas putida through systematic medium optimization and metabolic engineering. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134198
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134198