来源：Production of bio-indigo from engineered Pseudomonas putida KT2440 harboring tryptophanase and flavin-containing monooxygenase（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
靛蓝是纺织工业中历史悠久的蓝色染料，传统化学合成依赖有毒底物和还原剂，环境负担沉重。本研究以具有芳香族化合物降解能力和高环境胁迫抗性的恶臭假单胞菌KT2440为宿主，通过引入色氨酸酶（tnaA）和黄素单加氧酶（FMO）基因，构建了从色氨酸合成靛蓝的工程菌株HI201。经培养基、温度、底物浓度和转速优化后，在补料分批发酵中实现1.31 g/L靛蓝产量。该策略还验证了多种假单胞菌作为生产宿主的可行性，为环境友好型染料合成提供了新路径。
研究背景
靛蓝是一种特征性的蓝色天然染料，历史上从木蓝属和蓼蓝等植物中提取，数百年来广泛用于织物染色，尤其是牛仔布。传统植物提取法耗时且需大量土地；近年发展的化学合成法因靛蓝溶解度低，需要使用有害化学品和还原剂，对环境产生负面影响。因此，微生物合成靛蓝作为环境友好替代方案受到关注——生物合成代谢物反应条件温和，环境负担小。已有研究在大肠杆菌、恶臭假单胞菌、不动杆菌、丛毛单胞菌和巨大芽孢杆菌中实现了靛蓝生产，微生物利用吲哚或色氨酸作为底物，经单加氧酶或双加氧酶催化合成靛蓝。作者前期在大肠杆菌中引入tnaA和FMO基因，并共表达色氨酸转运蛋白基因aroP和tnaB，获得了当时报道的最高微生物靛蓝产量。
研究方法
2.1 化学试剂
色氨酸和靛蓝购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。吲哚购自Alfa Aesar（美国马萨诸塞州哈弗希尔）。二甲基亚砜（DMSO）购自SAMCHUN Chemicals（韩国首尔）。其余所有培养基组分均购自Difco（美国密歇根州底特律）。
【数据】试剂来源：Sigma-Aldrich、Alfa Aesar、SAMCHUN Chemicals、Difco；溶剂：DMSO
2.2 质粒构建与菌株
本研究所用细菌菌株和质粒信息见表1。大肠杆菌DH5α用作基因重组的宿主。对于色氨酸代谢，色氨酸酶基因（tnaA）源自大肠杆菌K12，黄素单加氧酶基因（FMO）获自甲基噬氨菌（Methylophaga aminisulfidivorans）。tnaA和FMO基因通过T4克隆插入pBBR1MCS2载体，然后通过热激转化大肠杆菌DH5α。重组pBBR1MCS2::FMO::tnaA载体随后通过电穿孔法（2.5 kV，Gene Pulser，Bio-Rad）转化恶臭假单胞菌菌株。为确保后续实验中质粒稳定性，添加50 μg/mL卡那霉素作为筛选抗生素。
【数据】宿主菌：E. coli DH5α（克隆）、P. putida KT2440（表达）；基因来源：tnaA—E. coli K12，FMO—M. aminisulfidivorans；载体：pBBR1MCS2；电转条件：2.5 kV；抗生素：50 μg/mL卡那霉素
2.3 培养基与培养条件
细胞在含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和5 g/L氯化钠的Lysogeny broth（LB）培养基中于30°C预培养。预培养方法：从LB琼脂平板挑取恶臭假单胞菌KT2440单菌落，接种至5 mL LB培养基，于30°C、200 rpm振荡培养18 h。靛蓝生产时，将18 h预培养物按1:50（v/v）稀释接种至5 mL Terrific broth（TB，酪蛋白12 g/L、酵母提取物24 g/L、磷酸氢二钾9.4 g/L、磷酸二氢钾2.2 g/L）中，含15 mM色氨酸。加入适宜浓度抗生素（50 μg/mL卡那霉素）以确保质粒维持。培养物于30°C继续培养72 h。
【数据】预培养：LB培养基，30°C，18 h，200 rpm；接种比：1:50（v/v）；生产培养基：TB（酪蛋白12 g/L、酵母提取物24 g/L、K2HPO4 9.4 g/L、KH2PO4 2.2 g/L）；色氨酸：15 mM；卡那霉素：50 μg/mL；培养条件：30°C，72 h
2.4 靛蓝浓度测定
为分析靛蓝产量，培养样品于13,000 rpm离心15 min，去离子水洗涤两次，重悬于1 mL DMSO中。悬液用BeadBug 6匀浆器（Benchmark Scientific，美国新泽西州赛尔维尔）匀浆，然后于5,500 rpm离心90 s。所得上清液用DMSO稀释至适当浓度并转移至96孔板，使用SpectraMax M2 UV-Vis分光光度计（Molecular Devices，美国加利福尼亚州山景城）在620 nm处测定吸光度，估算靛蓝浓度[31]。
【数据】离心：13,000 rpm，15 min；匀浆后离心：5,500 rpm，90 s；检测波长：620 nm；仪器：SpectraMax M2 UV-Vis分光光度计
2.5 色氨酸和吲哚浓度测定
色氨酸和吲哚浓度采用配备紫外/可见检测器的高效液相色谱系统（YL-9100，韩国）定量。样品在280 nm处检测，使用反相C18色谱柱（ZORBAX SB-C18柱，4.6 × 250 mm，粒径5 μm；安捷伦科技，美国）。操作期间柱温箱温度维持在35°C。流动相A和B分别为水和100%甲醇。流速维持在0.8 mL/min，梯度程序如下（A:B，v/v）：0–20 min（80:20）；20–25 min（20:80）；25–34 min（20:80）；34–38 min（80:20）；38–40 min（80:20）。样品制备时，上清液经0.22-μm Millex-GP注射器过滤器过滤，并用HPLC级水稀释。过滤后的样品稀释并转移至样品瓶中进行色氨酸和吲哚检测。各样品保留时间分别为10.5 min和30.4 min[14]。
【数据】检测波长：280 nm；色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）；柱温：35°C；流速：0.8 mL/min；保留时间：色氨酸10.5 min，吲哚30.4 min
2.6 靛蓝生产的补料分批发酵
补料分批发酵在5 L发酵罐（CNS，韩国大田）中进行，工作体积为2 L。初始培养基组成为M9基本培养基，含60 g/L甘油、2 g/L MgSO4∙7H2O、2 g/L酵母提取物、10 g/L (NH4)2HPO4、6 g/L K2SO4、0.9 g/L NaCl和1 mL微量元素添加物，以100 g/200 mL甘油和10 g/L色氨酸作为补料来源。补料在32 h和49 h进行三次。发酵罐以级联模式运行，溶解氧设定为100%。温度维持在30°C，pH用NaOH/HCl调节至7.0。培养55 h后收集细胞，用分光光度计分析靛蓝产量。
【数据】发酵罐：5 L（工作体积2 L）；初始培养基：M9 + 60 g/L甘油、2 g/L MgSO4∙7H2O、2 g/L酵母提取物、10 g/L (NH4)2HPO4、6 g/L K2SO4、0.9 g/L NaCl、1 mL微量元素；补料：100 g/200 mL甘油 + 10 g/L色氨酸；补料时间：32 h、49 h（三次）；DO：100%；温度：30°C；pH：7.0；培养时间：55 h
研究结果
3.1 恶臭假单胞菌的耐受性及靛蓝生产
微生物生产靛蓝涉及色氨酸或吲哚等底物的代谢[32]。在色氨酸代谢途径中，色氨酸酶将色氨酸代谢转化为吲哚；随后加氧酶将吲哚转化为吲哚酚[33]。吲哚酚随后自发氧化并二聚形成靛蓝——一种蓝色色素（图1A）。前期研究通过引入来自甲基噬氨菌的FMO基因和大肠杆菌K12的tnaA基因，实现了较高的靛蓝产量[34]。然而，吲哚作为靛蓝合成途径的中间体，对微生物具有细胞毒性[35]。据报道，添加超过1 mM吲哚对细胞生长速率产生负面影响，浓度高于5 mM时观察不到细胞生长[36]。
恶臭假单胞菌因能够降解芳香族化合物并扩展底物范围以生物转化为增值产品，是理想的宿主[37]。此外，它对环境胁迫和芳香族抑制剂表现出优异的抗性[18]。为研究恶臭假单胞菌和大肠杆菌对吲哚的耐受性相关的细胞生长情况，我们比较了不同吲哚浓度下的细胞生长（图1B）。两种菌株均在含0–3.5 mM吲哚的培养基中培养，并测定OD600值。两种菌株的OD600值均随吲哚浓度增加而下降，高于6 mM时细胞不生长。为精确比较抑制效果，使用四参数逻辑回归模型计算半数最大抑制浓度IC50值。大肠杆菌K12的IC50为1.57 mM，恶臭假单胞菌KT2440的IC50为2.63 mM，表明吲哚对恶臭假单胞菌的生长抑制较低（图1C）。
这一发现表明恶臭假单胞菌对吲哚具有更高的耐受性；因此，我们制定了以恶臭假单胞菌KT2440为宿主生产靛蓝的策略。首先，为利用吲哚作为底物生产靛蓝，在恶臭假单胞菌菌株中过表达源自甲基噬氨菌的FMO基因。表达FMO的恶臭假单胞菌菌株以0–5 mM吲哚为底物培养72 h。靛蓝产量随吲哚浓度增加逐渐上升，添加3.5 mM吲哚时达到最大产量0.11 mM（图1D）。吲哚浓度高于3.5 mM时靛蓝产量维持，但干细胞重量下降。因此，在高于3.5 mM的吲哚浓度下，吲哚的细胞毒性抑制了细胞生长，对靛蓝生产产生负面影响。这些结果表明，与先前报道中新分离假单胞菌菌株从吲哚生产27 mg/L靛蓝的研究相比，本研究的产量更高，说明FMO的引入增强了细胞内吲哚的利用[38]。
【数据】IC50：E. coli K12为1.57 mM，P. putida KT2440为2.63 mM；最大靛蓝产量：0.11 mM（3.5 mM吲哚）；对照产量：27 mg/L（文献值）
3.2 以色氨酸为底物的靛蓝生产及恶臭假单胞菌菌株的生产潜力
吲哚的细胞毒性限制了其作为高浓度底物用于靛蓝生产[15]。因此，为利用色氨酸作为靛蓝生产底物，我们引入了tnaA基因——该基因将色氨酸降解为吲哚、氨和丙酮酸。源自大肠杆菌K12的TnaA（与前期研究相同）与FMO基因一同插入pBBR1MCS2载体（图2A）。共表达FMO和tnaA的质粒用于转化恶臭假单胞菌KT2440表达菌株，构建恶臭假单胞菌HI201菌株，仅含空载体的恶臭假单胞菌KT2440用作对照。
为评价以色氨酸为底物的靛蓝生产，我们比较了恶臭假单胞菌HI201和野生型菌株在含10 mM色氨酸的TB培养基中的时间依赖性靛蓝产量（图2B）。野生型菌株随时间推移不产生靛蓝，而恶臭假单胞菌HI201菌株产量逐渐增加，96 h后产生0.56 mM靛蓝。以色氨酸为底物比以吲哚为底物获得更高的靛蓝产量。此外，与吲哚相比，色氨酸对细胞无毒性，允许在更高浓度下使用。因此，后续实验中选择色氨酸作为底物，作为提高靛蓝产量的有效策略。
将FMO和tnaA引入恶臭假单胞菌菌株，实现了以色氨酸为底物生产靛蓝。为评价恶臭假单胞菌HI201高效生产靛蓝的潜力，评估了多种恶臭假单胞菌菌株的靛蓝生产能力。我们使用pBBR1MCS2::FMO::tnaA转化11种不同的恶臭假单胞菌菌株，并在10 mM色氨酸存在下比较靛蓝产量。大多数恶臭假单胞菌菌株观察到靛蓝产生，其中恶臭假单胞菌KCTC 1751产0.8 mM、恶臭假单胞菌KCTC 2403产0.77 mM靛蓝（图3）。这些结果表明恶臭假单胞菌可广泛用作靛蓝生产宿主。由于各菌株产量相近，选择恶臭假单胞菌KT2440进行后续研究。
【数据】靛蓝产量（96 h）：0.56 mM（HI201，10 mM色氨酸）；KCTC 1751：0.8 mM；KCTC 2403：0.77 mM；测试菌株数：11种
3.3 生物靛蓝生产反应参数优化
为大规模生产靛蓝，对多种培养条件和培养基组分进行了优化。首先优化培养基。培养基优化在培养基中添加10 mM色氨酸进行，对于M9培养基，添加0.1%酵母提取物作为氮源。所用培养基为LB、TSB、TB、2X YT和M9。将等量预培养细胞（OD600 = 0.8）加入反应混合物中培养72 h比较靛蓝产量（图4A）。TB培养基中靛蓝产量为0.92 mM，约为LB培养基的1.84倍。这表明TB培养基是最适合靛蓝生产的培养基。
随后优化培养温度。温度可影响蛋白质三级结构，进而影响蛋白质变性、错误折叠或酶活性[39]。该优化过程涉及确定活性蛋白表达的最佳诱导温度以产生更多靛蓝。使用含10 mM色氨酸的TB培养基作为培养基，培养72 h。30°C培养时靛蓝产量最高，达0.87 mM（图4B）。
色氨酸是靛蓝生产最重要的底物。为确定适宜的色氨酸浓度，我们在TB培养基中使用浓度分别为0、5、10、15、20和25 mM的色氨酸。培养条件维持在前述实验确定的最适条件（TB培养基、30°C）。靛蓝产量随色氨酸浓度从0增加至25 mM而急剧上升（图4C）。25 mM色氨酸时靛蓝产量最高，达6.55 mM。当色氨酸浓度大于15 mM时，靛蓝产量维持并略有增加。推测是高色氨酸浓度导致底物抑制。因此，基于相对于底物浓度的产量比较，选择15 mM色氨酸作为靛蓝生产底物。
色氨酸被TnaA转化为吲哚，吲哚随后被FMO转化为吲哚酚[40]。靛蓝通过吲哚酚的非酶促二聚化合成[41]。该二聚化反应在氧气存在下自然发生，无需酶参与。通过调节摇床转速控制试管规模培养基中溶解氧量。转速设定为150、200和250 rpm。200 rpm时靛蓝产量最高，达0.62 mM，而较低和较高转速下产量均下降（图4D）。
【数据】TB培养基产量：0.92 mM（为LB的1.84倍）；最适温度：30°C（0.87 mM）；最高产量：6.55 mM（25 mM色氨酸）；选定浓度：15 mM；最适转速：200 rpm（0.62 mM）
3.4 补料分批发酵生产靛蓝
在试管规模优化培养条件的基础上，进行了5 L发酵罐规模的补料分批发酵。为确定初始碳源对靛蓝生产的影响，在M9基本培养基中添加60 g/L甘油作为初始碳源，以100 g/200 mL甘油和10 g/L色氨酸作为补料。补料分批发酵过程中，靛蓝产量随时间逐渐增加（图5A）。通过补料分批发酵，靛蓝最大产量达到1.31 g/L（图5B）。
【数据】靛蓝最大产量：1.31 g/L；初始碳源：60 g/L甘油；补料：100 g/200 mL甘油 + 10 g/L色氨酸；发酵时间：55 h
3.5 产靛蓝恶臭假单胞菌菌株的应用
靛蓝是一种蓝色色素，可作为可视化指示剂。为评估产靛蓝恶臭假单胞菌菌株的应用潜力，进行了抗生素敏感性试验。将大肠杆菌K12、恶臭假单胞菌KT2440和含pBBR1MCS2::FMO::tnaA的恶臭假单胞菌KT2440进行抗生素敏感性测试（图6A）。产靛蓝的恶臭假单胞菌菌株呈现蓝色，可作为可视化指示剂，用于通过薄层色谱法和顶层琼脂法筛选抗菌物质。
【数据】测试菌株：E. coli K12、P. putida KT2440、P. putida KT2440（pBBR1MCS2::FMO::tnaA）；检测方法：薄层色谱法、顶层琼脂法
讨论与解读
本研究构建了以恶臭假单胞菌KT2440为宿主的微生物靛蓝生产体系。通过引入FMO基因实现吲哚向靛蓝的转化，引入tnaA基因则允许以色氨酸为底物。研究发现恶臭假单胞菌对吲哚的IC50为2.63 mM，显著高于大肠杆菌的1.57 mM，体现了该宿主在底物耐受性方面的优势。多种恶臭假单胞菌菌株均能生产靛蓝，表明该策略具有广谱适用性。通过优化培养基（TB）、温度（30°C）、色氨酸浓度（15 mM）和转速（200 rpm），结合补料分批发酵，最终实现1.31 g/L靛蓝产量。产靛蓝菌株的蓝色表型还可作为可视化指示剂，应用于抗菌物质筛选。
编译者解读：本研究的关键价值在于将生产宿主从模式菌大肠杆菌拓展至恶臭假单胞菌——后者天然具备芳香族化合物代谢网络和更强的底物耐受性，这恰好契合靛蓝合成途径中吲哚中间体细胞毒性这一核心瓶颈。从合成生物学应用角度看，选择pBBR1MCS2多拷贝质粒配合T4克隆快速组装，体现了"够用即可"的工程化思维；但质粒-based系统在工业放大中往往面临结构不稳定性问题，未来若整合至染色体或采用诱导型表达系统可能进一步提升鲁棒性。此外，1.31 g/L的产量与大肠杆菌体系相比仍有差距，底物抑制和产物反馈调控机制值得深入挖掘。
参考来源
Kim HJ. Production of bio-indigo from engineered Pseudomonas putida KT2440 harboring tryptophanase and flavin-containing monooxygenase. Enzyme and Microbial Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2024.110529
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2024.110529