来源：Integrative analysis reveals casing layer dynamics during Agaricus bisporus cultivation and the growth promoting effect of Pseudomonas putida AT130（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
双孢蘑菇是全球消费量最大的食用菌，其覆土层微生物群落与代谢活动深刻影响产量与品质。本研究整合16S rRNA测序、非靶向代谢组学与功能基因组学，揭示了覆土层微生物群落的阶段特异性演替规律，并分离获得一株具有多重促生活性的荧光假单胞菌AT130。盆栽试验表明，AT130接种可使双孢蘑菇产量提升123.55%，同时改善蛋白质与可溶性糖含量。该菌株有望开发为食品级生物接种剂。
研究背景
双孢蘑菇（Agaricus bisporus）是全球产量最高的食用菌，具有显著营养价值，也是农业废弃物高值化利用的重要途径。其商业化栽培是一个环境可控的生物转化系统：有机物料经发酵形成适宜培养基质，菌丝定殖后被覆土层覆盖，子实体形成受CO₂浓度和温度等环境因子精确调控。覆土层被认为是双孢蘑菇菌丝从营养生长转向生殖生长的关键诱导界面，不仅提供湿度、气体交换和物理支撑的适宜微环境，其活跃的动态生物界面更是触发和调控子实体发育的关键生物学因素。然而，覆土层中哪些微生物和代谢变化与原基形成及后续品质形成相关，仍缺乏阶段尺度的系统研究。
研究方法
2.1 双孢蘑菇栽培条件与覆土层样品采集
双孢蘑菇的商业化栽培在安徽省阜阳市阜南县某农产品公司（115°E，32°N）进行。双孢蘑菇菌种与发酵基质混合后均匀铺于菇床，覆盖5–5.5 cm厚的覆土层（含水量75%，pH 7.5）。栽培初期，菇房温度维持在17–19°C，湿度96–98%。第4天，温度升至21–22°C，湿度98%。当菌丝覆盖基质70%–80%时，温度降至17–19°C，湿度维持在90%，第21天开始采收第一批蘑菇。覆土层样品分别于第0、4、8、13、17和21天采集，标记为D0、D4、D8、D13、D17和D21。该采样时间表覆盖了双孢蘑菇生长的关键转变节点。每个时间点采用五点混合取样法，设置三个生物学重复。样品置于无菌袋中，一部分于−20°C保存用于理化性质测定，另一部分于−80°C保存用于分子和代谢组学分析。
【数据】覆土层厚度：5–5.5 cm；含水量：75%；pH：7.5；温度：17–19°C（初期）→21–22°C（第4天）→17–19°C（菌丝覆盖70%–80%后）；湿度：96–98%→98%→90%；采收时间：第21天；采样时间点：D0、D4、D8、D13、D17、D21；生物学重复：3
2.2 DNA提取与16S rRNA测序
使用FastDNA Spin Kit提取土壤样品总DNA。评估纯度和浓度后，利用338F/806R引物扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区。PCR条件如下：95°C初始变性3分钟；27个循环的95°C变性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸45秒；最后72°C终延伸10分钟。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，随后进行纯化和定量。测序采用Illumina MiSeq PE300平台。获得的序列使用QIIME 2进行质控，过滤低质量序列。代表性操作分类单元（OTU）序列使用SILVA138-16S rRNA数据库进行注释。
【数据】引物：338F/806R；PCR条件：95°C 3min；27个循环（95°C 30s，55°C 30s，72°C 45s）；72°C 10min；琼脂糖凝胶浓度：2%；测序平台：Illumina MiSeq PE300；数据库：SILVA138
2.3 代谢物提取与非靶向代谢组学分析
样品（250 mg，n=3）用500 μL预冷70%甲醇提取液提取，随后涡旋、超声和孵育。离心后取上清液，经0.22 μm PTFE滤膜过滤后进样。液相色谱采用Waters ACQUITY Premier HSS T3色谱柱（2.1 × 100 mm，1.8 μm），流速0.4 mL/min，进样量4 μL。流动相A和B分别为含0.1%甲酸的水溶液和含0.1%甲酸的乙腈溶液。质谱分析在AB TripleTOF 6600上进行，采用正离子和负离子两种模式。原始数据由ProteoWizard转换为mzXML格式，随后使用XCMS进行峰提取、对齐和校正。缺失率大于50%的峰被过滤。缺失值采用KNN插补，峰面积采用SVR校正。代谢物鉴定通过数据库搜索和metDNA方法完成。等量混合样品作为质控（QC），每分析十个样品后插入一个QC样品。保留鉴定分数大于0.5且QC样品CV < 0.5的物质。
【数据】样品量：250 mg；提取液：500 μL 70%预冷甲醇；滤膜：0.22 μm PTFE；色谱柱：Waters ACQUITY Premier HSS T3（2.1 × 100 mm，1.8 μm）；流速：0.4 mL/min；进样量：4 μL；质谱平台：AB TripleTOF 6600；QC插入频率：每10个样品；筛选标准：鉴定分数>0.5，QC CV<0.5
2.4 P. putida AT130全基因组测序与注释
采用SDS裂解-柱纯化法提取DNA。质量评估后，分别使用Illumina Hiseq和Oxford Nanopore PromethION平台进行二代和三代测序。使用fastp进行质控，去除接头、低质量读段和短序列。使用Unicycler软件进行混合组装，获得完整基因组。使用tRNAscan-SE 2.0软件预测基因组中的tRNA，使用Barrnap 0.9软件预测rRNA。使用RepeatMasker 4.0.3软件识别并屏蔽基因组中的重复序列。基因功能注释使用BLAST软件结合Nr、Swiss-Prot、GO、eggNOG/COG、KOG和Pfam数据库完成。基因组圈图使用Rcirclize包生成。CRISPR序列使用MinCED软件预测，基因组岛使用IslandViewer 4网络工具预测。通过这些分析，从多个角度全面了解了该细菌基因组的结构和功能特征。
【数据】测序平台：Illumina Hiseq + Oxford Nanopore PromethION；组装软件：Unicycler；tRNA预测：tRNAscan-SE 2.0；rRNA预测：Barrnap 0.9；重复序列：RepeatMasker 4.0.3；注释数据库：Nr、Swiss-Prot、GO、eggNOG/COG、KOG、Pfam
2.5 双孢蘑菇栽培与理化性质测定
在合肥工业大学（中国安徽省合肥市；117.2°E，31.7°N）建立双孢蘑菇栽培温室。栽培条件与2.1节所述工业化栽培条件一致。实验设两个处理组：AT130接种组——将P. putida AT130菌悬液（10⁸–10⁹ CFU/mL）按50 mL/kg覆土均匀喷洒于覆土层；对照组——喷洒等量无菌生理盐水。每个处理设六个生物学重复，所有单元在同一温室中同步栽培，采用相同操作流程。采收后，子实体蛋白质、脂肪和灰分含量分别按照GB/T 15673-2009、GB 5009.6-2016和GB 5009.4-2016测定，可溶性糖采用蒽酮-硫酸法测定。
【数据】AT130菌悬液浓度：10⁸–10⁹ CFU/mL；喷洒量：50 mL/kg覆土；生物学重复：6；蛋白质测定标准：GB/T 15673-2009；脂肪测定标准：GB 5009.6-2016；灰分测定标准：GB 5009.4-2016；可溶性糖测定：蒽酮-硫酸法
2.6 数据处理与可获取性
群落互作关系采用Herren和McMahon（2017）提出的凝聚力指数评估。凝聚力计算公式如下：(1) Cohesion = connectednessᵢ × Σᵢ₌₁ᵐ abundanceᵢ。群落组装模式基于Sloan等（2006）构建的中性群落模型进行分析。生态位宽度使用R 4.3.2版本中spaa包的niche.width函数计算，公式如下：(2) Bⱼ = 1∕Σᵢ₌₁ᴺ Pᵢⱼ²。为评估不同样品间群落稳定性的影响，采用Yuan等（2021）提出的方法评估微生物群落的稳健性和脆弱性。α和β多样性分析使用QIIME软件（版本1.9.1）进行。微生物群落差异分析使用LEfSe进行。PLS-DA和VIP分析使用SIMCA软件（版本14.1）实现。关键微生物预测因子进一步通过OmicStudio平台上的随机森林分析筛选。组间差异通过SPSS（v20.0）中的ANOVA评估，p < 0.05。图形使用Origin（版本2024）绘制。所有原始序列已提交至中国国家生物信息中心基因组序列档案（GSA）数据库，登录号为CRA031247和CRA031166。
【数据】凝聚力指数公式：Herren & McMahon (2017)；中性群落模型：Sloan et al. (2006)；生态位宽度计算：spaa包，R 4.3.2；α/β多样性分析：QIIME 1.9.1；PLS-DA/VIP：SIMCA 14.1；统计阈值：p < 0.05；GSA登录号：CRA031247、CRA031166
研究结果
3.1 双孢蘑菇发育过程中覆土层微生物群落的演替
Adonis分析显示，双孢蘑菇不同生长阶段覆土层微生物群落结构存在显著差异（R² = 0.277，p = 0.001）。基于栽培条件的动态控制和Bray-Curtis距离算法的PCoA分析，双孢蘑菇的生长过程被分为三个阶段：早期（阶段1，D0-D4）、中期（阶段2，D8-D13）和后期（阶段3，D17-D21）（图1A）。ASV分析进一步显示，阶段1特有的ASV比例最高（42.64%），而阶段2和阶段3特有ASV数量相对较低，分别为14.96%和16.23%。14%的ASV在三个阶段共享（图1B）。在门水平上，变形菌门（Proteobacteria，55.3%–67.9%）和拟杆菌门（Bacteroidota，22.7%–27.3%）在整个栽培过程中始终占优势，而厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度在栽培后期逐渐增加（图1C）。在属水平上，黄杆菌属（Flavobacterium，7.2%–12.8%）和丛毛单胞菌属（Comamonas，1.7%–10.4%）在所有阶段均保持较高丰度，而Methylotenera和Rhodoferax的丰度在阶段2和阶段3显著低于阶段1（图1D）。LEfSe分析进一步鉴定了阶段特异性生物标志物：阶段1富集假单胞菌属（Pseudomonas）和Methylotenera；阶段2富集Allorhizobium、Sphingopyxis和Vogesella；阶段3富集Thermomonas和芽孢杆菌属（Bacillus）（图1E）。
【数据】Adonis：R² = 0.277，p = 0.001；阶段1特有ASV：42.64%；阶段2特有ASV：14.96%；阶段3特有ASV：16.23%；三阶段共享ASV：14%；变形菌门：55.3%–67.9%；拟杆菌门：22.7%–27.3%；黄杆菌属：7.2%–12.8%；丛毛单胞菌属：1.7%–10.4%
3.2 双孢蘑菇生长驱动的微生物群落动态机制
覆土层群落的多样性在双孢蘑菇生长的不同阶段表现出显著的动态变化。从D0到D8，系统发育多样性显著下降（74.89 ± 7.42 → 37.30 ± 5.51）。从D8到D13短暂上升，随后逐渐下降（图2A和B）。覆土层群落的物种丰富度呈现与系统发育多样性同步的演替模式。反映分类群间协调正共现程度的正凝聚力在阶段2达到峰值（0.68 ± 0.06；图2C），指示资源利用泛化程度的生态位宽度在阶段2呈现显著最大值（4.48 ± 1.05，p < 0.05；图2D）。随机森林分析进一步鉴定了在双孢蘑菇不同生长阶段对群落功能有显著贡献的关键物种。假单胞菌属在整个过程中表现出最高的特征重要性，热图显示了这些关键操作分类单元的动态丰度变化（图2E）。
【数据】系统发育多样性：D0-D8从74.89 ± 7.42降至37.30 ± 5.51；正凝聚力峰值：0.68 ± 0.06（阶段2）；生态位宽度最大值：4.48 ± 1.05（阶段2，p < 0.05）
3.3 双孢蘑菇不同生长阶段覆土层代谢物动态变化与生化过程
为分析双孢蘑菇整个生长发育过程中覆土层的生化过程，进一步研究了覆土层的代谢组。通过非靶向代谢组学共鉴定出1108种非挥发性代谢物，其中正离子模式595种，负离子模式513种（表S1）。基于获得的代谢物，PCA显示不同生长阶段的代谢物谱显著分离，PC1和PC2分别解释40.98%和14.18%的方差（图3A）。代谢物分类结果表明，有机酸（18.5%）、氨基酸及其衍生物（16.4%）和核苷酸及其衍生物（4.3%）是检测到的代谢物中的主要类别（图3B）。此外，OPLS-DA分析确认了不同阶段间代谢物的显著差异。评估结果（R²Y = 0.994，Q² = 0.977，p < 0.05）显示组间聚类清晰，表明代谢物谱能够准确区分不同生长阶段，可用于筛选组间差异代谢物（图S1A和B）。基于VIP > 1、倍数变化≥2和≤0.5筛选差异代谢物。结果显示，与阶段1相比，阶段2有208种上调代谢物和85种下调代谢物。与阶段2相比，阶段3有352种上调代谢物和40种下调代谢物（图3C和D）。聚类热图揭示了基于VIP > 1和p < 0.05的差异代谢物（表S2）在不同阶段的动态变化（图3E）。代谢物被分为两个主要聚类：聚类I在阶段1富集并逐渐减少，聚类II在阶段3显著增加。这些聚类主要由有机酸、苯及其取代衍生物、氨基酸及其衍生物组成（表S3）。
【数据】鉴定代谢物总数：1108种（正离子595种，负离子513种）；PC1方差解释率：40.98%；PC2方差解释率：14.18%；有机酸占比：18.5%；氨基酸及其衍生物占比：16.4%；核苷酸及其衍生物占比：4.3%；OPLS-DA：R²Y = 0.994，Q² = 0.977，p < 0.05；阶段2 vs 阶段1：上调208种，下调85种；阶段3 vs 阶段2：上调352种，下调40种
3.4 双孢蘑菇生长过程中代谢模式的动态重塑与阶段特异性调控
对差异代谢物进行单位方差缩放后，K-means聚类将其分为7个亚类（图4A–G）。其中，亚类3（86种代谢物）和亚类5（88种代谢物）呈随时间递减趋势。亚类2（42种代谢物）和亚类6（107种代谢物）呈递增趋势。亚类1（16种代谢物）先增后减，而亚类7（11种代谢物）先减后增。差异代谢物主要集中在有机酸、氨基酸及其衍生物和芳香族化合物中，亚类2、4和6中呈递增趋势的代谢物比例较高（表S4）。KEGG富集分析揭示了双孢蘑菇不同生长阶段的代谢重塑模式（图4H和I）。阶段1与阶段2之间的差异代谢物主要富集在氨基酸、核苷酸和糖代谢途径（如甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，嘌呤/嘧啶代谢，糖酵解/糖异生）。进入阶段3后，脂质代谢、二羧酸代谢和外源化合物降解相关途径（如亚油酸代谢和磷脂代谢）显著富集。此外，ABC转运系统和细胞色素P450介导的代谢途径也显著增强。
【数据】K-means亚类：7个；亚类3：86种代谢物（递减）；亚类5：88种代谢物（递减）；亚类2：42种代谢物（递增）；亚类6：107种代谢物（递增）；亚类1：16种代谢物（先增后减）；亚类7：11种代谢物（先减后增）
3.5 P. putida AT130菌株的分离、鉴定与基因组分析
Procrustes分析显示微生物群落结构与代谢物组成之间存在显著相关性（m² = 0.664，p < 0.01）（图S2A）。Spearman相关分析显示，假单胞菌属、Methylotenera、Vogesella和芽孢杆菌属等属与多种代谢物显著相关（图S2B）。结合LEfSe分析和随机森林的结果，覆土层中的假单胞菌属在双孢蘑菇生长中发挥关键作用。采用培养方法从覆土层中分离获得一株P. putida菌株，命名为AT130，并通过系统发育树分析确认了其分类地位（表S5，图S3）。使用VITEK 2系统进一步评估了该菌株的安全性（表S6）。为获得P. putida AT130的完整基因组信息，使用Oxford Nanopore Technologies平台进行长读长全基因组测序，随后用Illumina高通量短读长测序进行数据校正。ONT平台共获得7,835,598条高质量clean reads，总碱基数为1,166,096,122 bp，GC含量为60.96%。Illumina测序数据的质量评估显示Q20和Q30值分别为99.21%和97.41%，确保了后续组装的准确性。使用Unicycler软件对两种测序数据进行混合组装后，获得了5.78 Mb的完整基因组序列。组装基因组的GC含量为61.94%，与测序读段和特征一致。
【数据】Procrustes分析：m² = 0.664，p < 0.01；ONT clean reads：7,835,598条；总碱基数：1,166,096,122 bp；ONT GC含量：60.96%；Illumina Q20：99.21%；Q30：97.41%；基因组大小：5.78 Mb；组装基因组GC含量：61.94%
3.6 P. putida AT130基因组功能注释与促生活性验证
对P. putida AT130基因组进行COG数据库注释，结果显示基因主要富集在氨基酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢、无机离子转运与代谢等功能类别（图6A）。CAZys数据库注释揭示了该菌株携带多种碳水化合物活性酶编码基因（图6B）。GO数据库注释涵盖了生物学过程、细胞组分和分子功能三大类别的功能基因（图6C）。KEGG数据库注释进一步揭示了该菌株参与多种代谢途径的基因组成（图6D）。体外活性测定证实，AT130具有溶磷活性（图7A）、释钾活性（图7B）和木质素降解活性（图7C）。基因组分析还重建了色氨酸-IAA合成途径（图7D），表明该菌株具备吲哚-3-乙酸（IAA）生物合成能力。
【数据】COG功能类别：氨基酸转运与代谢、碳水化合物转运与代谢、无机离子转运与代谢等；CAZys：多种碳水化合物活性酶基因；体外活性：溶磷、释钾、木质素降解；IAA合成途径：色氨酸-IAA途径
3.7 AT130接种对双孢蘑菇产量与营养品质的影响
盆栽试验进一步表明，AT130接种改善了双孢蘑菇的生产性能。与对照组相比，AT130接种使子实体产量提高了123.55%，并改善了营养性状——蛋白质和可溶性糖含量增加，而灰分含量降低。
【数据】产量提升：123.55%；蛋白质：增加；可溶性糖：增加；灰分：降低
讨论与解读
4.1 双孢蘑菇发育对覆土层细菌群落结构的影响
本研究揭示了双孢蘑菇生长发育过程中覆土层细菌群落结构和组成的动态变化，这一现象在糙皮侧耳和六妹羊肚菌等大型食用菌的生长中也有报道。菌丝扩展和定殖期间，双孢蘑菇菌丝对碳源的强烈需求主要通过覆土层微生物的功能互补来满足。随着菌丝逐渐定殖，变形菌门和拟杆菌门显著富集，这些门类包含纤维素和半纤维素降解基因以及碳水化合物活性酶基因簇，能够高效分解复杂有机物并释放单糖，为菌丝生长提供持续碳源供应。
4.2 覆土层微生物与代谢物的协同变化
本研究中，原基形成期（阶段2）群落凝聚力和生态位宽度达到峰值，表明此时微生物互作最为协调、资源利用最为广泛。代谢组学分析显示，腺苷和色氨酸在该阶段发生显著变化，并富集于能量和氨基酸代谢途径。KEGG富集分析进一步表明，阶段1到阶段2的代谢重塑主要涉及氨基酸、核苷酸和糖代谢，而进入阶段3后则转向脂质代谢和外源化合物降解。这些代谢转变与子实体形成和品质建立的生理需求高度一致。
4.3 假单胞菌属的关键作用与AT130的应用潜力
假单胞菌属在整个栽培过程中表现出最高的特征重要性，且与原基形成期的多种代谢物显著相关。从覆土层中分离的P. putida AT130经全基因组测序和体外活性验证，确认具备溶磷、释钾、木质素降解和IAA生物合成等多重促生功能。盆栽试验中，AT130接种使产量提升123.55%，同时改善蛋白质和可溶性糖含量、降低灰分，显示出作为食品级生物接种剂的良好应用前景。该研究将覆土层微生物群与蘑菇品质联系起来，为双孢蘑菇的精准微生物调控提供了理论依据和实践菌株。
编译者解读
本研究的方法学亮点在于"多组学联动"策略：16S rRNA测序锁定关键微生物类群，非靶向代谢组揭示功能代谢物，全基因组测序则从基因层面验证菌株功能潜力，三者环环相扣。AT130的分离与功能验证遵循了从"群落筛选"到"菌株应用"的完整逻辑链。123.55%的产量增幅在食用菌生物接种剂研究中属于较高水平。值得关注的是，该菌株的多重促生机制（溶磷、释钾、IAA合成、木质素降解）使其不仅适用于双孢蘑菇，也可能对其他覆土栽培食用菌具有应用潜力。后续研究可进一步探究AT130在大规模商业化栽培条件下的稳定性和安全性。
参考来源
Li H. Integrative analysis reveals casing layer dynamics during Agaricus bisporus cultivation and the growth promoting effect of Pseudomonas putida AT130. Food Bioscience, 2026. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108429
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108429