工程化假单胞菌NGC7实现甘蔗渣芳香族化合物选择性香草酸生产

来源：Selective vanillate production from sugarcane bagasse-derived aromatic compounds using an engineered Pseudomonas sp. NGC7-based strain（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：论文深度润色

导读

甘蔗渣碱提取物（BAE）中的芳香族化合物是生物基香草酸（VA）的潜在原料。本研究以假单胞菌NGC7为底盘，通过敲除VA O-脱甲基酶基因（vanA4B4）、化学诱变筛选获得SA降解能力不受高浓度VA抑制的突变株，并引入外源HBA羟化酶基因（praI），最终在含有机酸的实际培养基中实现4.30 mM VA的选择性生产，得率达77 mol%。研究揭示了vanR2转录抑制因子突变是解除SA降解瓶颈的关键。

研究背景

甘蔗渣碱提取物（BAE）含有对香豆酸（CA）、阿魏酸（FA）、4-羟基苯甲醛（HBN）、4-羟基苯甲酸（HBA）、香草醛（VN）和香草酸（VA）等芳香族化合物，以及乙酸盐、甲酸盐、乳酸盐和琥珀酸盐等有机酸，但不含葡萄糖或木糖等糖类。假单胞菌NGC7能够利用所有这些芳香族化合物作为碳源。该菌株拥有四套编码VA O-脱甲基酶加氧酶组分（vanA1-vanA4）及其相应氧化还原酶组分（vanB1-vanB4）的基因集，其中vanA4B4是NGC7中负责VA降解的基因集。通过失活vanA4B4，菌株可将FA和VN转化为VA，同时降解CA、HBN和HBA作为碳源。然而，要实现高效选择性VA生产，还需解决两个关键问题：SA在发酵过程中的积累，以及HBA的残留。

研究方法

评估工程菌株VA生产能力的一般流程

本研究所用所有NGC7衍生菌株汇总于表S2。各菌株接种于10 mL LB培养基中，30°C振荡培养16小时。离心收集细胞（12,000 × g，5分钟，4°C），生理盐水洗涤两次，重悬于生理盐水，调节OD600至5.0。该悬浮液作为接种物，取0.2 mL接种至10 mL MMx-3培养基中。MMx-3组成如下：Na₂HPO₄·12H₂O 34.2 g/L，KH₂PO₄ 6.0 g/L，(NH₄)₂SO₄ 2.5 g/L，MgSO₄·7H₂O 490 mg/L，CaCl₂·2H₂O 15 mg/L，FeSO₄·7H₂O 5 mg/L。碳源来自BAE、模拟BAE芳香族化合物（mock BAE_aromatics）、固相萃取浓缩BAE（conc_BAE）或模拟浓缩BAE芳香族化合物（mock conc_BAE_aromatics），30°C振荡培养。某些情况下添加源自BAE的有机酸混合物（mock OA）。

BAE的组成经前期研究确定，含CA（1165 mg/L，7.10 mM）、FA（174 mg/L，0.90 mM）、HBN（41 mg/L，0.34 mM）、HBA（2 mg/L，0.01 mM）、VN（12 mg/L，0.08 mM）、VA（4 mg/L，0.02 mM）、乙酸盐（2.20 g/L，36.6 mM）、甲酸盐（0.15 g/L，3.3 mM）、乳酸盐（0.03 g/L，0.3 mM）、琥珀酸盐（0.02 g/L，0.2 mM）、氯离子（3571 mg/L，100.7 mM）和钠离子（3390 mg/L，147.4 mM）。基于BAE组成，配制模拟BAE溶液（含CA 58.25 g/L、FA 8.70 g/L、HBN 2.05 g/L、HBA 0.10 g/L、VN 0.60 g/L、VA 0.20 g/L）和模拟OA溶液（含乙酸盐110.0 g/L、甲酸盐7.5 g/L、乳酸盐1.5 g/L、琥珀酸盐1.0 g/L）。

BAE中的芳香族化合物通过固相萃取浓缩制备conc_BAE。基于conc_BAE的芳香族化合物浓度，mock conc_BAE_aromatics溶液除CA、FA、HBN、HBA、VN和VA外，还含有丁香醛（SN）和丁香酸（SA）。含BAE的MMx-3培养基命名为MMx-3[BAE]，通过将矿物盐和金属溶解于BAE中并经滤过灭菌制备。补充0.2 mL mock BAE_aromatics溶液的MMx-3命名为MMx-3[mock BAE_aromatics]。同时含0.2 mL mock BAE_aromatics和mock OA溶液的培养基命名为MMx-3[mock BAE_aromatics + mock OA]，含0.25 mL mock conc_BAE_aromatics和0.2 mL mock OA溶液的培养基命名为MMx-3[mock conc_BAE_aromatics + mock OA]。补料分批模式评估中，额外conc_BAE或mock conc_BAE_aromatics按各图注说明补加。

定期采集培养液，用分光光度计（BIOmaster, XB-10, TOMY SEIKO）测定OD600，并用高效液相色谱系统（1200系列；Agilent Technologies）测定芳香族化合物浓度。HPLC配备ZORBAX Eclipse Plus色谱柱（直径4.6 mm，长150 mm，粒径5 μm，40°C运行）。分析柱以5%（v/v）CH₃OH和1%（v/v）CH₃COOH平衡，流速1 mL/min。样品注射后引入含50%（v/v）CH₃OH和1%（v/v）CH₃COOH的另一溶剂，前8分钟梯度升至20%，后5分钟升至100%，保持5分钟。CA、FA、HBN、SN、VA和VN在280 nm检测，HBA和SA在254 nm检测。VA得率按[产生的VA（mol）/添加的FA、VA和VN（mol）] × 100计算。CA、FA、HBA、VA和VN购自Fujifilm Wako Pure Chemical Corporation，HBN和SN购自Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.。

【数据】培养基：LB/MMx-3；培养温度：30°C；培养时间：16h；离心：12,000 × g，5min，4°C；接种量：0.2 mL/10 mL；MMx-3组成：Na₂HPO₄·12H₂O 34.2 g/L、KH₂PO₄ 6.0 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 490 mg/L、CaCl₂·2H₂O 15 mg/L、FeSO₄·7H₂O 5 mg/L；HPLC柱温：40°C；流速：1 mL/min；检测波长：280nm（CA、FA、HBN、SN、VA、VN）/254nm（HBA、SA）

固相萃取

中试工厂的BAE（pH 3.65）由Toray Industries, Inc.提供，该工厂在泰国乌隆他尼的Cellulosic Biomass Technology Co., Ltd.运营甘蔗渣加工中试装置。BAE上样至装有DIAION HP20树脂（Mitsubishi Chemical Co.）的Econo-Column（Bio-Rad Laboratories, Inc.）中，收集流穿（FT）级分。吸附在树脂上的芳香族化合物用甲醇洗脱。蒸发甲醇后溶于氢氧化钠水溶液，用盐酸调节最终pH至8.0。离心（6000 × g，5分钟，20°C）去除沉淀，上清液过滤灭菌，−20°C保存备用（命名为conc_BAE）。conc_BAE含CA（39.40 g/L，240.19 mM）、FA（5.71 g/L，29.41 mM）、HBA（0.30 g/L，2.17 mM）、HBN（1.90 g/L，15.56 mM）、SA（0.20 g/L，1.01 mM）、SN（0.40 g/L，2.20 mM）、VA（1.20 g/L，7.14 mM）和VN（1.20 g/L，7.89 mM）。mock conc_BAE_aromatics溶液按相同浓度配制。

【数据】BAE pH：3.65；树脂：DIAION HP20；洗脱剂：甲醇；pH调节：8.0；离心：6000 × g，5min，20°C；保存温度：−20°C；conc_BAE中CA：39.40 g/L（240.19 mM）；FA：5.71 g/L（29.41 mM）；HBA：0.30 g/L（2.17 mM）；HBN：1.90 g/L（15.56 mM）；SA：0.20 g/L（1.01 mM）；SN：0.40 g/L（2.20 mM）；VA：1.20 g/L（7.14 mM）；VN：1.20 g/L（7.89 mM）

NTG化学诱变及高浓度VA条件下SA降解突变株筛选

vanA4B4缺失突变株NGC711构建于前期研究。NGC711因基因组含有氨基糖苷3′-磷酸转移酶基因（aph）而具有低水平卡那霉素（Km）抗性。为敲除aph，用pK18Δaph通过电穿孔（15 kV/cm）转化NGC711，转化子在含25 mg/L Km的LB琼脂平板上30°C培养。Km抗性克隆划线于含25%（w/v）蔗糖的LB琼脂平板，30°C培养。选择Km敏感的菌落，PCR确认aph缺失（命名为NGC716）。

NGC716接种于LB，30°C振荡培养。OD600达1.0时，取1.0 mL培养液离心（12,000 × g，3分钟，20°C）。细胞洗涤两次，重悬于含5或10 mg/L NTG的100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中，振荡孵育（30°C，30分钟）。随后收集细胞并充分洗涤去除NTG。两种NTG处理条件下的存活率分别为39%和10%。NTG处理细胞接种于LB振荡培养（30°C，16小时）。离心收集细胞（12,000 × g，5分钟，4°C），生理盐水洗涤两次，重悬至OD600为5.0。取100 μL接种于10 mL含1.0 mM SA和5.0 mM VA的MMx-3中振荡培养（61小时，30°C），取等分试样转接至10 mL含2.0 mM SA和10 mM VA的MMx-3中振荡培养（24–36小时，30°C）。培养液梯度稀释后涂布于含10 mM SA的MMx-3平板。30°C培养后，随机挑取90个菌落至LB平板，检测其在高浓度VA条件下的SA降解能力。各突变株接种物按前述方法制备，取0.2 mL接种至含10 μL 1.0 M SA、70 μL 1.0 M VA和0.2 mL mock OA的10 mL MMx-3中，30°C补料分批振荡培养。培养12小时后向培养物中添加相同体积的1.0 M SA和1.0 M VA，评估其在高浓度VA条件下的SA降解能力。

【数据】电穿孔：15 kV/cm；Km筛选浓度：25 mg/L；蔗糖筛选浓度：25%（w/v）；NTG浓度：5或10 mg/L；NTG处理：30°C，30min；存活率：39%（5 mg/L NTG）/10%（10 mg/L NTG）；SA初筛浓度：1.0 mM SA + 5.0 mM VA；二筛浓度：2.0 mM SA + 10 mM VA；SA板浓度：10 mM；筛选菌落数：90个；SA降解评估：1.0 mM SA + 7.0 mM VA + mock OA，12h后补加1:7比例SA:VA

突变株基因组序列分析

两株突变株NGC716-9C和NGC716-12F的基因组DNA由Bioengineering Lab. Co., Ltd.使用DNBSEQ-G400测序仪以2 × 150 bp双端模式测序。使用Cutadapt（ver. 4.0）修剪接头序列，读数质量值q……

【数据】测序平台：DNBSEQ-G400；测序模式：2 × 150 bp双端

研究结果

BAE产VA的初步评估

BAE由CA、FA、HBA、HBN、VA、VN和有机酸组成，NGC7可利用所有芳香族化合物作为唯一碳源。NGC7拥有四套编码VA O-脱甲基酶加氧酶组分（vanA1-vanA4）及其氧化还原酶组分（vanB1-vanB4）的基因集，其中vanA4B4被鉴定为NGC7中负责VA降解的基因集。因此推测，vanA4B4失活株NGC716降解CA、HBN和HBA以获得生物量和能量所需的碳源，并从FA和VN产生VA（图1A）。

结果显示，NGC716在降解CA、HBN和HBA的同时，产生了0.78 mM VA，得率78 mol%（图1B）。当NGC716在MMx-3[mock BAE_aromatics]中培养时，菌株生长并产生0.83 mM VA，得率83 mol%（图S5A）。但最大OD600值约为MMx-3[BAE]中培养时观测值（2.02）的一半。BAE含乙酸盐、甲酸盐、乳酸盐和琥珀酸盐等有机酸，但不含葡萄糖或木糖等糖类。结果表明，NGC716能够在乙酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐或OA模型上生长（图S5B和S5C），说明NGC716在MMx-3[BAE]中的OD600_max高于MMx-3[mock BAE_aromatics]，BAE中的有机酸有利于NGC716的VA生产培养。

【数据】VA产量：0.78 mM（MMx-3[BAE]）/0.83 mM（MMx-3[mock BAE_aromatics]）；VA得率：78 mol%/83 mol%；OD600_max（MMx-3[BAE]）：2.02

BAE芳香族化合物浓度对VA滴度提升的影响

虽然NGC716从BAE中产VA的得率约80 mol%，但由于BAE中FA和VN（转化为VA的底物）浓度较低，滴度不高。因此，通过固相萃取浓缩BAE中的芳香族化合物（命名为conc_BAE，除CA、FA、HBA、HBN、VA和VN外还含SA和SN），有机酸则分离至FT级分。固相萃取揭示conc_BAE含有丁香基化合物SA和SN。NGC716能在SA上生长，因其拥有vanA1B1——vanA1B1-vanA4B4中负责SA降解的基因（图1A）。该特性被认为有利于从conc_BAE选择性生产VA。

当NGC716在MMx-3[mock conc_BAE_aromatics]中培养时，产生0.90 mM VA，得率81 mol%（图2A），且在MMx-3[mock conc_BAE_aromatics + mock OA]中生长得到促进（图2B）。此外，通过补加额外mock conc_BAE_aromatics，VA滴度提高至2.71 mM，得率81 mol%（图2C）。该结果表明，通过固相萃取浓缩BAE中的芳香族化合物可提高VA滴度。然而，工程化VA生产菌株面临两大问题：（i）NGC716在补料分批培养产VA过程中SA发生积累（图2D），尽管该菌株拥有vanA1B1及其他负责SA降解的基因；（ii）HBA在此过程中也发生积累（图2C）。残留的SA和HBA将成为选择性VA生产中的杂质。VA生产补料分批培养过程中SA和HBA应被完全消耗。此外，本研究发现的另一挑战是如何将萃取步骤中与芳香族化合物分离的有机酸（可促进NGC716生长）回用于培养基。因此，本研究进一步（i）工程化VA生产菌株以克服上述两大问题，（ii）考察FT级分作为有机酸供应源制备培养基的适用性。

【数据】VA产量（MMx-3[mock conc_BAE_aromatics]）：0.90 mM；VA得率：81 mol%；VA产量（补料分批）：2.71 mM；得率：81 mol%

化学诱变筛选高浓度VA条件下能在SA上生长的菌株

NGC716能在SA上生长，当该菌株在含SA（1.0 mM）和VA（1.0 mM）的MMx-3中培养时，菌株在降解SA的同时生长（图S6A）。然而，生长速率随VA浓度升高而降低，在SA（1.0 mM）和VA（7.0 mM）共存时未观察到生长（图S6B–D）。当NGC716在含VA和SA混合物及mock OA的MMx-3中补料分批培养（培养12小时后添加VA和SA混合物）时，SA降解呈现类似趋势（图3）。

SA降解随VA浓度升高而降低，尽管菌株可利用有机酸生长。该结果表明，NGC716的SA降解功能受VA浓度升高抑制。细菌SA分解代谢途径已在S. lignivorans SYK-6、Novosphingobium aromaticivorans DSM 12444、Oceanimonas doudoroffii JCM21046T、Microbacterium sp. RG1和Pseudomonas sp. NGC7中有报道，但VA浓度对SA降解的影响此前未被研究。

本研究中，NGC716经NTG处理，尝试分离在高浓度VA条件下能在SA上生长的菌株。在含1.0 mM SA和5.0 mM VA的MMx-3平板上形成菌落的90个菌落被分离，分别接种于含1.0 mM SA、7.0 mM VA和mock OA的MMx-3中振荡培养。培养12小时后，向各培养物添加VA:SA = 7:1的混合物。NGC716无法降解SA，培养36小时后观察到SA积累（图4A）。

90株突变株中，NGC716-9C和NGC716-12F被选作进一步工程化VA生产菌株的实验材料（图4、S7和表S6）。NGC716-9C和NGC716-12F在培养36小时内完全降解SA，培养物中分别剩余94%和95%的VA。随后，NGC716-9C和NGC716-12F分别在MMx-3[mock conc_BAE_aromatics + mock OA]中补料分批振荡培养（图5A和S8A）。NGC716-9C和NGC716-12F分别产生4.35 mM VA（得率78 mol%）和4.25 mM VA（得率76 mol%），SA被完全降解（图5A和B，S8A和B）。SA通过SA分解代谢途径进入TCA循环，不转化为VA，因此VA生产率不受影响。但由于SA是选择性VA生产的杂质，其完全降解是有利的。SA的完全降解解决了工程化VA生产菌株的两大问题之一。

【数据】SA降解评估：1.0 mM SA + 1.0~7.0 mM VA；筛选平板：1.0 mM SA + 5.0 mM VA；评估条件：1.0 mM SA + 7.0 mM VA + mock OA；NGC716-9C：36h完全降解SA，VA剩余94%；NGC716-12F：36h完全降解SA，VA剩余95%；NGC716-9C VA产量：4.35 mM，得率78 mol%；NGC716-12F VA产量：4.25 mM，得率76 mol%

SA降解有效突变的解析

对NGC716-9C和NGC716-12F的基因组DNA进行测序，以解析VA生产过程中SA降解的有效突变。所有在编码序列（CDS）中鉴定的突变汇总于表S7。在NGC716-9C（182个CDS）和NGC716-12F（199个CDS）基因组中鉴定到的突变基因中，有33个为两菌株共有（表S8）。负责SA降解的vanA1B1未发现突变。33个突变基因中，vanR2——SA分解上游途径操纵子（覆盖PSN_2696至PSN_2687位点）的转录抑制因子——被选为关键目标基因（NGC716-9C的命名为vanR2(G41E)，NGC716-12F的命名为vanR2(P58L)）。该操纵子包括vanA1B1（PSN_2692和PSN_2691）、mgaAB（推测的3-O-甲基没食子酸双加氧酶α和β亚基，PSN_2693和PSN_2694）、mgaC（推测的4-羧基-2-羟基-6-甲氧基-6-氧代己-2,4-二烯酸水解酶，PSN_2689）和mgaD（推测的4-羧基-2-羟基粘康酸互变异构酶，PSN_2687）。VanR2作为该操纵子的转录抑制因子发挥作用。

为阐明突变vanR2是否有助于VA生产过程中的SA降解，构建了NGC716-9CΔvanR2(G41E)、NGC716-9CΔvanR2(G41E)::vanR2、NGC716-12FΔvanR2(P58L)和NGC716-12FΔvanR2(P58L)::vanR2菌株（图S……）。

【数据】NGC716-9C突变CDS数：182；NGC716-12F突变CDS数：199；共有突变基因数：33；vanR2突变位点：G41E（NGC716-9C）/P58L（NGC716-12F）

HBA羟化酶基因表达对VA生产的影响

分别评估了pobA（图6A）和praI（图6B）的表达效果（静息细胞测定）。NGC716-9CΔpobA::P_tac-pobA（图6C）和NGC716-9CΔpobA::P_tac-praI（图6D）分别在10 mL MMx-3[mock conc_BAE_aromatics + mock OA]中培养……

【数据】静息细胞测定：pobA/praI表达评估；培养体系：10 mL MMx-3[mock conc_BAE_aromatics + mock OA]

讨论与解读

本研究的核心发现可归纳为三点。第一，vanA4B4基因敲除使NGC7衍生菌株能够从BAE芳香族化合物中选择性积累VA，但SA和HBA的残留成为主要杂质问题。第二，通过NTG化学诱变结合高浓度VA压力筛选，获得vanR2转录抑制因子突变（G41E和P58L），该突变解除了SA分解代谢操纵子的转录抑制，使菌株在VA存在条件下仍能完全降解SA。第三，来源于Paenibacillus sp. JJ-1b的HBA羟化酶基因praI的表达有效解决了HBA积累问题。最终工程菌株在实际培养基中实现4.30 mM VA选择性生产，得率77 mol%。

【编译者解读】本研究展示了经典化学诱变与合成生物学策略结合的有效性——不依赖精细的启动子工程，而是通过筛选获得全局调控因子的自发突变，解决了代谢途径中底物抑制这一瓶颈问题。vanR2突变策略的发现具有通用意义：类似转录抑制因子突变策略可推广至其他存在底物抑制的芳香族化合物生物转化体系。值得注意的是，固相萃取与流穿级分回用的工艺设计将分离工程与发酵工程巧妙衔接，体现了生物过程开发中"单元操作耦合"的工程思维。局限在于NTG诱变的随机性导致大量非目标突变（180+ CDS），后续如能结合CRISPR靶向编辑vanR2，可减少基因组背景噪音，提高菌株遗传稳定性。

参考来源

Alam, M. J. Selective vanillate production from sugarcane bagasse-derived aromatic compounds using an engineered Pseudomonas sp. NGC7-based strain. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2025.11.001

DOI: 10.1016/j.jbiosc.2025.11.001