来源：Metabolic engineering of Pseudomonas putida KT2440 for upcycling of terephthalic acid into levulinic acid（Journal of Biotechnology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
塑料降解产生的对苯二甲酸（TPA）因化学稳定性高而持续累积于环境中，造成二次污染。本研究通过向恶臭假单胞菌KT2440引入TPA分解代谢基因（tpaK、tphA、tphB）并整合乙酰丙酸（LA）合成途径，首次实现了该菌株以TPA为底物直接生物合成LA。优化培养条件后，在连续补料及甘油共底物策略下，LA最高产量达25.40 mM，为塑料废弃物高值化利用提供了新路径。
研究背景
石油基塑料的大量生产与消费导致化石资源枯竭和环境污染。即使经过机械和化学回收，仍有相当比例的塑料废弃物最终被焚烧或填埋，传统回收策略难以成为综合性解决方案。可生物降解塑料因此受到关注，而TPA作为PBAT和PET的关键前体，其芳香环共振结构赋予其高度化学稳定性，降解需消耗大量能量，且代谢中间产物会诱发氧化应激和细胞毒性。尽管部分菌属如丛毛单胞菌属、红球菌属、噬氢菌属和假单胞菌属被报道能代谢TPA，但微生物对芳香化合物的代谢仍是重大挑战。本研究旨在通过代谢工程手段，使模式菌株恶臭假单胞菌KT2440获得以TPA为底物生产LA的能力——LA是聚合物、药物、溶剂、增塑剂和生物燃料合成中的重要中间体。
研究方法
2.1 化学试剂
LA和TPA购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。葡萄糖购自Duksan Reagent（韩国安山）。蔗糖和甘油购自Junsei（日本东京）。其他所有培养基组分均购自Difco（美国密歇根州底特律）。
2.2 质粒构建与菌株
本研究所用细菌菌株和质粒信息见表2。恶臭假单胞菌KT2440保存于实验室。大肠杆菌DH5α用作基因重组的宿主。为构建TPA分解代谢途径，将编码tpaK、tphB和tphA₁ₗₐbc的基因串联克隆至pSEAV221载体，得到质粒pGE_KBA。tpaK在BBa_J23114启动子控制下表达，而tphB和tphA₁ₗₐbc置于Ptac启动子控制下。质粒构建通过T4 DNA连接酶完成，随后通过热激法转化至大肠杆菌DH5α。
【数据】菌株：E. coli DH5α；质粒：pSEAV221（pGE_KBA）；启动子：BBa_J23114（tpaK）、Ptac（tphB/tphA₁ₗₐbc）；转化方法：热激法
2.3 LA合成的培养条件
预培养：从LB琼脂平板挑取恶臭假单胞菌KT2440单菌落，接种至5 mL液体LB培养基（含胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠5 g/L），于30°C、200 rpm振荡培养18 h。LA生产：将预培养物以1:50（v/v）比例稀释至5 mL M9基本培养基（M9 5X；磷酸氢二钠33.9 g/L、磷酸二氢钾15.0 g/L、氯化钠2.5 g/L、氯化铵5.0 g/L）中，含5 mM TPA，于30°C培养48–120 h。添加卡那霉素（50 μg/mL）以确保质粒维持。
【数据】预培养：LB培养基、30°C、200 rpm、18 h；LA生产：M9基本培养基（5X）、5 mM TPA、30°C、48–120 h；抗生素：卡那霉素50 μg/mL；稀释比：1:50（v/v）
2.4 恶臭假单胞菌KT2440突变株的构建
采用sacB介导的pK19mobsacB载体，通过同源重组构建恶臭假单胞菌KT2440染色体DNA缺失突变株。敲除突变株构建方法：扩增每个基因上下游约500 bp片段并连接形成基因盒，插入pK19mobsacB载体。质粒通过电穿孔转化至恶臭假单胞菌KT2440。菌落首先在含卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板上筛选，随后在含25%蔗糖的LB平板上筛选。选择卡那霉素敏感且蔗糖不敏感的菌落，通过菌落PCR和测序确认缺失。采用相同的sacB介导同源重组策略，将aroG、asbF和adc基因通过Gibson Assembly克隆至pK19mobsacB载体，并组装在各目标基因的上下游片段之间用于染色体整合。所得质粒通过电穿孔导入恶臭假单胞菌KT2440，采用相同的抗生素筛选和蔗糖反筛选程序获得基因组整合菌株。
【数据】同源臂长度：约500 bp；筛选：卡那霉素50 μg/mL、25%蔗糖；转化方法：电穿孔；组装方法：Gibson Assembly；验证：菌落PCR+测序
2.5 LA和TPA分析方法
培养上清液通过离心收集，转移至玻璃小瓶并冷冻干燥。甲醇解步骤：向瓶中加入等体积氯仿和15%（v/v）H₂SO₄甲醇溶液，于100°C反应2 h。随后将样品冷却至室温（约22–25°C）。向甲酯溶液中加入1 mL去离子水，涡旋5 s。将氯仿层转移至洁净的硼硅酸盐玻璃瓶以去除残余水分。LA和TPA浓度采用配备熔融石英毛细管柱（DB-FFAP；长度30 mm、内径0.320 mm、膜厚0.25 μm；Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）的GC-FID系统（Young In Chromass 6500；韩国首尔）以分流模式（1/20）测定。氦气为载气，流速3.0 mL/min。柱温箱初始温度80°C保持5 min，以20°C/min升至220°C并保持5 min。进样口和FID温度分别为210°C和230°C。采用HPLC-RID分析恶臭假单胞菌KT2440对己二酸和1,4-丁二醇的消耗。己二酸和1,4-丁二醇经离心收集，使用配备示差折光检测器（RID）和Aminex HPX-87H离子柱（Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）的高效液相色谱系统（Shimadzu，日本京都）进行分析。流动相为0.008 N硫酸，恒定流速0.6 mL/min，柱温箱温度60°C。己二酸和1,4-丁二醇的保留时间分别为14.57 min和20.02 min。
【数据】甲醇解：100°C、2 h；GC-FID：分流比1/20、氦气3.0 mL/min、柱温80°C→220°C（20°C/min）；进样口210°C、检测器230°C；HPLC-RID：0.008 N H₂SO₄、0.6 mL/min、60°C；保留时间：己二酸14.57 min、1,4-丁二醇20.02 min
研究结果
3.1 对苯二甲酸代谢基因对恶臭假单胞菌KT2440利用己二酸、1,4-丁二醇和TPA的影响
TPA是PBAT、PBT和PET等多种聚合物生产中的关键芳香族单体。其中，PBAT是含TPA的代表性脂肪族-芳香族共聚酯，解聚时TPA与脂肪族单体己二酸（AA）和1,4-丁二醇（1,4-BDO）一同释放。因此，将这些单体高效生物转化为增值化合物对实现塑料废弃物循环经济至关重要。恶臭假单胞菌具有利用AA和1,4-BDO等脂肪族单体的天然代谢途径，但野生型菌株因缺乏TPA特异性代谢基因，TPA降解效率有限。TPA转运蛋白（TpaK）通过增强细胞膜通透性促进TPA摄取。随后，TPA双加氧酶（TphA）将TPA氧化为DCD，再经DCD脱氢酶（TphB）转化为PCA。为增强恶臭假单胞菌KT2440的TPA利用能力，利用质粒pGE_KBA引入了异源TPA代谢基因，包括来源于红球菌Jostii RHA1的tpaK以及来源于丛毛单胞菌E6的tphA₁ₗₐbc和tphB。为评估TPA特异性分解基因的引入是否在不影响天然脂肪族单体代谢的前提下选择性提升TPA利用率，在添加5 mM各单体后监测2天内TPA、AA和1,4-BDO的消耗情况。野生型菌株与携带TPA代谢基因的菌株在AA和1,4-BDO消耗速率上相当（图1A、B）。相比之下，野生型菌株未能完全消耗所供TPA，而携带TPA代谢基因的菌株在12 h内利用了全部TPA（图1C）。这些结果表明，tpaK、tphA和tphB的引入有效增强了恶臭假单胞菌KT2440的TPA分解代谢能力。
【数据】单体浓度：5 mM；检测时间：2天；TPA消耗：携带基因菌株12 h内完全消耗，野生型未完全消耗；AA/1,4-BDO消耗：两菌株相当
3.2 通过基因过表达和敲除构建以TPA生产LA的菌株
前期研究发现，以甘油为碳源且同时敲除pcaIJ和lvaR时，恶臭假单胞菌KT2440的微生物LA产量最高。此外，过表达大肠杆菌K12的aroG(D146N)、蜡样芽孢杆菌ATCC 14579的asbF——二者增强糖代谢——以及丙酮丁醇梭菌的adc——催化β-酮己二酸转化为LA——可进一步提升LA产量。为构建稳定高效的TPA至LA生产途径，评估了所引入生物合成基因的基因组位置是否影响LA产量。将aroG、asbF和adc基因整合至多个位点，包括乙酰丙酸操纵子（lvaAB）以及Tn7转座系统的tnsC和tnsD位点（分别编码中央调节因子和靶位点选择蛋白），但这些位点均不支持LA生产（数据未显示）。相比之下，整合至pcaIJ位点可稳定实现LA生产，表明该位点为连接TPA降解与LA生物合成提供了适当的转录和代谢环境。这确认了pcaIJ是建立TPA至LA转化途径的功能性有效基因组位点，并凸显恶臭假单胞菌KT2440作为能将TPA转化为脂肪族增值化合物LA的平台菌株的潜力。微生物以TPA生产LA的途径如图2所示。
为构建该途径，在pcaIJ和lvaR双缺陷的恶臭假单胞菌KT2440菌株中引入pGE_KBA，并将aroG、asbF和adc整合至pcaIJ位点。基于对不同表达策略的评估（补充图1），双质粒系统存在不稳定性，因此将aroG、asbF和adc整合至基因组pcaIJ位点以确保TPA代谢基因的稳定表达，而非采用质粒表达。该工程菌株命名为恶臭假单胞菌KT2440 GP102。为评估TPA代谢基因对LA生产的影响，将GP102和HP301在以10 mM TPA为底物的M9基本培养基中培养，并添加0.5%酵母提取物支持生长。恶臭假单胞菌KT2440 HP301为对照菌株，其中pcaIJ和lvaR被敲除，aroG、asbF和adc基因已整合至基因组pcaIJ位点。额外携带TPA代谢基因的GP102相较于HP301表现出生长减缓（图3A）。GP102生长速率降低可能归因于异源TPA代谢途径带来的额外代谢负担。相反，GP102在24 h内完全消耗了所供10 mM TPA，而HP301消耗量很低（图3B）。由于TPA的利用，GP102在120 h后产生了9.02 mM LA，而HP301仅产生1.53 mM LA，后者似乎来源于酵母提取物（图3C）。这表明通过引入TPA代谢基因，可以TPA为唯一碳源合成LA。
【数据】TPA浓度：10 mM；酵母提取物：0.5%；GP102：24 h内完全消耗10 mM TPA，120 h产LA 9.02 mM；HP301：TPA消耗低，产LA仅1.53 mM
3.3 以TPA生产LA的培养条件优化
为确认以TPA为唯一碳源的LA生产，对M9基本培养基中的LA生产培养参数进行了优化。首先优化温度。一般而言，温度影响细胞生长和酶活性——高温导致蛋白质变性，低温损害膜完整性。通过在含5 mM TPA的M9基本培养基中于20、25、30和37°C培养GP102 3天来确定LA生产的最适温度（图4A）。虽然25°C和30°C下LA合成量相当，但30°C时产量最高，达4.07 mM，被确定为LA生产的最适温度，反映了整体细胞生理状态。接下来优化TPA浓度：在含0、1、3、4、5、6、7和8 mM TPA的M9基本培养基中培养GP102 3天（图4B），并添加0.1%酵母提取物支持生长。LA产量随TPA浓度从0增至6 mM而增加，6 mM TPA时产量最高，达4.90 mM LA。由于氮源对细胞生长至关重要，且最适氮源因碳源而异，测试了多种氮源以确定最适合LA生产的氮源。将九种氮源——NH₄NO₃、CO(NH₂)₂、(NH₄)₂SO₄、KNO₃、NaNO₃、NH₄Cl、(NH₄)₂HPO₄、蛋白胨和酵母提取物——以0.1%浓度添加至含6 mM TPA的M9基本培养基中（图4C）。培养3天后，以酵母提取物为氮源的培养基中LA产量最高，达3.85 mM。酵母提取物含有多种氮化合物、碳源以及氨基酸和维生素等生长因子，可显著增强细胞生长，这可能刺激了LA生产。在含6 mM TPA的M9基本培养基中，以0至0.6%范围内不同酵母提取物浓度培养3天优化酵母提取物浓度（图4D），LA产量随酵母提取物浓度增加而增加，0.5%酵母提取物时产量最高（6.04 mM）。0.1%酵母提取物时LA产量为4.61 mM。然而，为尽量减少……
【数据】温度优化：5 mM TPA、3天，最适30°C（4.07 mM LA）；TPA浓度优化：0.1%酵母提取物、3天，最适6 mM TPA（4.90 mM LA）；氮源筛选：0.1%浓度、6 mM TPA、3天，酵母提取物最佳（3.85 mM LA）；酵母提取物浓度：6 mM TPA、3天，0.5%最佳（6.04 mM LA），0.1%时4.61 mM
3.4 以TPA为唯一底物的补料策略
【数据】补料方案：5 mM TPA于24、48、72 h补充；结果：连续补料下最高8.75 mM LA，96 h为7.44 mM LA；原因：底物积累抑制细胞生长并降低LA产率
3.5 葡萄糖和甘油对LA生产的影响
【数据】共底物：2%葡萄糖或2%甘油+6 mM TPA；甘油共底物策略：96 h产LA 25.40 mM；对比：比甘油为唯一碳源高4倍，比无甘油连续TPA补料高3.4倍
3.6 TPA补料策略与底物组合优化
【数据】2%甘油为唯一碳源：LA产量原文未详述；2%甘油+24 h间隔TPA补料（5 mM TPA于24、48 h添加）：96 h产LA 25.40 mM；TPA完全消耗
讨论与解读
本研究成功构建了恶臭假单胞菌KT2440 GP102菌株，通过将TPA分解代谢基因tpaK、tphA和tphB引入pcaIJ、lvaR双敲除菌株——该菌株已在pcaIJ位点基因组整合了aroG、asbF和adc基因——建立了从TPA到LA的直接生物合成途径。工程菌株GP102在24 h内完全消耗10 mM TPA并产生9.02 mM LA，而缺乏TPA分解代谢基因的HP301对照菌株仅产生1.53 mM LA。以连续补料方式（5 mM）供应TPA作为唯一底物可进一步提升LA产量，但该策略下底物积累导致细胞生长和代谢受抑，LA产率降低。通过添加甘油作为共底物解决了这一问题，该策略增强了细菌活性和代谢，实现了TPA的完全消耗，最终LA最高滴度达25.40 mM——比甘油为唯一碳源时高4倍，比无甘油连续TPA补料时高3.4倍。这种新型升级循环方法将传统糖基LA生产途径与TPA降解相结合，实现了芳香族化合物向脂肪族工业增值化合物的转化。
编译者解读：本研究的技术亮点在于将塑料解聚单体（TPA）与高值化学品（LA）生产直接偶联，体现了"塑料废弃物→平台化学品"的升级循环理念。方法上，基因组整合策略（pcaIJ位点）比质粒表达更稳定，规避了双质粒系统的不稳定性问题——这对工业菌株开发具有参考价值。然而，25.40 mM（约3 g/L）的产量距离工业化仍有距离，且依赖酵母提取物和甘油共底物增加了成本。后续若能强化TPA转运效率或解除底物抑制，有望进一步提升产量。该研究为芳香族塑料单体的生物转化提供了可借鉴的代谢工程范式。
参考来源
Lim, G. (2026). Metabolic engineering of Pseudomonas putida KT2440 for upcycling of terephthalic acid into levulinic acid. Journal of Biotechnology. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.03.019
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2026.03.019