来源：Efficient power recovery from aromatic compounds by a novel electroactive bacterium Pseudomonas putida B6-2 in microbial fuel cells（Journal of Environmental Chemical Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
芳香化合物（ACs）是典型的持久性环境污染物，传统生物修复策略难以同时实现污染物降解与能量回收。本研究首次发现好氧芳烃降解菌——恶臭假单胞菌B6-2（Pseudomonas putida B6-2）具备高效胞外电子传递（EET）能力，可在微生物燃料电池（MFC）中以镍包覆海绵为阳极，同步降解联苯（BP）、咔唑（CA）和二苯并噻吩（DBT）并产出最高587 mW m⁻²的功率密度。该发现为ACs污染物的能源化修复开辟了新路径。
研究背景
芳香化合物（ACs）是一类含一个或多个苯环的有机分子，主要分为多环芳烃（PAHs）、杂环化合物和取代芳烃三大类。PAHs如联苯（BP）、菲和萘等，常被硫、氮或氧原子取代形成杂环化合物，如二苯并噻吩（DBT）、咔唑（CA）和二苯并呋喃（DBF）。这些化合物的log K_OW值低于5.0，具有较高的土壤吸附系数和生物累积性，且具有潜在毒性、基因毒性、致突变性和致癌性，对生态环境构成严重威胁。
目前常用的ACs去除策略包括物理吸附、逐步氧化、光催化及生物技术等。其中微生物技术可将ACs污染物彻底降解为二氧化碳和水等无害物质，从根源上解决污染问题。然而，传统生物修复往往忽视污染物中蕴含的化学能回收潜力。微生物燃料电池（MFC）通过电活性细菌的胞外电子传递过程，有望在降解污染物的同时实现能量回收。
研究方法
2.1 化学试剂与材料
二甲基亚砜（DMSO）和N，N-二甲基甲酰胺（DMF）购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。BP、DBT和CA购自阿拉丁试剂有限公司（中国上海）。镍包覆海绵购自深圳市慧如海科技有限公司。碳布、碳毡和碳纸购自昆山伊尔盛国际贸易有限公司（中国江苏）。所有化学品均为分析纯级别，所有溶液均使用超纯水系统（Direct-Q3，Merck，美国）制备。
【数据】试剂来源：国药/阿拉丁/慧如海/伊尔盛；纯度：分析纯；水系统：Direct-Q3（Merck）
2.2 菌株与培养
恶臭假单胞菌B6-2首先在10 mL Luria Broth培养基（LB，胰蛋白胨10 g L⁻¹，酵母提取物5 g L⁻¹，氯化钠10 g L⁻¹）中于30°C、200 rpm条件下过夜培养。随后取10 mL菌悬液用无菌水洗涤两次，8000 rpm离心5 min，再接种至100 mL含2.31 g L⁻¹ BP的无机盐培养基（MSM）中。MSM组成如下：K₂HPO₄ 5.2 g L⁻¹，KH₂PO₄ 3.7 g L⁻¹，NH₄Cl 2.0 g L⁻¹，NaSO₄ 1.0 g L⁻¹，MgSO₄·7H₂O 0.2 g L⁻¹，FeCl₂·4H₂O 0.3 g L⁻¹，CoCl₂·6H₂O 38 mg L⁻¹，MnCl₂·4H₂O 20 mg L⁻¹，ZnCl₂ 14 mg L⁻¹，CuCl₂·2H₂O 3.4 mg L⁻¹，H₃BO₃ 12.4 mg L⁻¹，Na₂MoO₄·2H₂O 40 mg L⁻¹。培养条件为200 rpm、30°C、24 h。所得菌悬液作为MFC的接种物。
【数据】LB培养基：胰蛋白胨10 g L⁻¹/酵母提取物5 g L⁻¹/NaCl 10 g L⁻¹；培养条件：30°C、200 rpm、过夜；离心：8000 rpm、5 min；MSM含BP 2.31 g L⁻¹；二次培养：200 rpm、30°C、24 h
2.3 MFC的构型
MFC由双室构成，中间以预处理的Nafion 117质子交换膜（Dupont，美国）分隔。分别以镍包覆海绵（5 cm²）、碳布（5 cm²）、碳毡（5 cm²）和碳纸（5 cm²）作为阳极，碳纸（10 cm²）作为阴极。阴阳极通过铜导线连接，外电阻恒定为1000 Ω。阳极液为150 mL含ACs的无菌MSM，阴极液为150 mL铁氰化物溶液（Na₂HPO₄ 6.93 g L⁻¹，NaH₂PO₄ 4.77 g L⁻¹，K₃Fe(CN)₆ 16.46 g L⁻¹）。BP、CA和DBT的初始浓度分别为463 mg L⁻¹、84 mg L⁻¹和92 mg L⁻¹。预培养的P. putida B6-2按10%（v/v）接种至阳极室。MFC在30°C恒温培养箱中运行，搅拌速度恒定为350 rpm。
【数据】阳极面积：5 cm²；阴极面积：10 cm²；外电阻：1000 Ω；阳极液：150 mL MSM+ACs；阴极液：150 mL铁氰化物溶液；初始浓度：BP 463 mg L⁻¹/CA 84 mg L⁻¹/DBT 92 mg L⁻¹；接种量：10%（v/v）；温度：30°C；搅拌：350 rpm
2.4 分析方法
MFC运行期间，定期从阳极室采集样品。样品中加入两倍体积无水乙醇，12000 rpm离心10 min，经0.22 µm有机相滤膜过滤。随后采用LC-20AT高效液相色谱系统（Shimadzu，日本）在254 nm波长下监测BP、DBT和CA浓度。该系统配备SPD-20A紫外检测器（Shimadzu，日本）和C18色谱柱（长150 mm，内径4.6 mm，粒径5 µm，Thermo，美国），柱温30°C。样品以超纯水（A）和95%甲醇（B）为梯度流动相洗脱，流速0.5 mL min⁻¹。BP、DBT和CA的保留时间分别约为6.3 min、7.5 min和4.4 min（补充材料图S1）。BP、CA和DBT的检出限（3.3σ/S）分别为5.921 µM、33.41 µM和4.44 µM。如补充材料表S2所示，BP、CA和DBT在MSM中的回收率分别为94.13–102.4%、95.47–101.2%和92.4–104.1%。
电压输出采用USB-6008数据采集系统（National Instruments，美国）连续监测，每5 min记录一次。功率密度和极化曲线采用恒电流法绘制，通过PLZ70UA电子负载（KIKUSUI，日本）在不同外负载下获得。具体操作如下：将处于稳定期的MFC连接至PLZ70UA电子负载，持续增加施加电流（0.1 mA 100 s⁻¹），每10 s采集一次电压数据。功率密度按P = UI/A计算，其中A为阳极表面积，I为电流，U为记录的输出电压[24]。
离心去除细胞后，采用CHI 760E电化学工作站（辰华，中国）在三电极体系中通过CV技术测量MFC阳极液。三电极体系中，玻碳电极（GCE）为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，铂电极为对电极。CV分析在−0.6 V至+0.6 V电位范围内进行，扫描速率为5–200 mV s⁻¹。EIS测量同样在三电极体系中进行，频率范围100 kHz至100 mHz，开路条件下，电解质缓冲液含0.1 M K₄[Fe(CN)₆]、0.1 M K₃[Fe(CN)₆]和0.1 M KCl。EIS数据采用ZsimpWin软件分析。
阳极生物膜形貌采用Quanta 250FEG场发射扫描电子显微镜（FEI，美国）表征。生物膜样品首先浸入2.5%（v/v）戊二醛中，4°C固定12 h，随后用无菌超纯水洗涤3次。接着将样品浸入1%（v/v）OsO₄中继续固定1.5 h。之后依次用浓度梯度为30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%、100%（v/v）的乙醇进行梯度脱水，每步20 min。最后，生物膜样品经临界点干燥（EM CPD300，德国）和喷金（Cressington 108，英国）处理后进行SEM表征。
【数据】HPLC检测波长：254 nm；柱温：30°C；流速：0.5 mL min⁻¹；保留时间：BP 6.3 min/DBT 7.5 min/CA 4.4 min；检出限：BP 5.921 µM/CA 33.41 µM/DBT 4.44 µM；回收率：BP 94.13–102.4%/CA 95.47–101.2%/DBT 92.4–104.1%；电压记录间隔：5 min；电子负载：0.1 mA 100 s⁻¹，10 s采点；CV电位范围：−0.6至+0.6 V；扫描速率：5–200 mV s⁻¹；EIS频率：100 kHz–100 mHz；戊二醛固定：2.5%（v/v）、4°C、12 h；OsO₄固定：1%（v/v）、1.5 h；乙醇梯度：30%–100%、每步20 min
研究结果
3.1 P. putida B6-2在不同阳极MFC中的电催化活性
基于P. putida B6-2对多种ACs污染物的降解能力以及与假单胞菌属某些菌株的EET特性[1,18–20]，推测P. putida B6-2可能具备EET能力，并能在MFC中实现多种ACs污染物的能量回收。为此，以BP为燃料，分别以镍包覆海绵、碳布、碳毡和碳纸为阳极，验证了P. putida B6-2的电催化活性。
如图1A所示，不同阳极材料的MFC均表现出产电特性。相比之下，未接种P. putida B6-2的对照MFC在多种阳极材料条件下均未观察到显著电压输出（补充材料图S2）。以镍包覆海绵和碳布为阳极的MFC最大电压输出分别为460 mV和440 mV，而以碳纸和碳毡为阳极的MFC最大电压输出仅为257 mV和175 mV。
如图1B所示，以镍包覆海绵为阳极的MFC开路电压为0.753 V，高于碳布（0.638 V）、碳毡（0.610 V）和碳纸（0.590 V）。图1C显示，镍包覆海绵阳极MFC的功率密度为469 mW m⁻²，分别是碳布（396 mW m⁻²）的1.18倍、碳毡（153 mW m⁻²）的3.07倍和碳纸（132 mW m⁻²）的3.55倍。此外，P. putida B6-2辅助的镍包覆海绵阳极MFC功率密度高于已报道的多种假单胞菌MFC，包括P. putida ATCC 49128（225.3 mW m⁻²）[19]、P. aeruginosa MTCC 2582（2.89 mW m⁻²）[25]、P. fluorescens MTCC 2269（1.90 mW m⁻²）[25]、Pseudomonas sp. C27（40 mW m⁻²）[26]和P. aeruginosa BR（259.3 mW m⁻²）[27]，详见补充材料表S3。
此外，以镍包覆海绵和碳布为阳极的MFC中BP浓度在60 h内迅速下降（图1D）。60 h时，镍包覆海绵和碳布阳极MFC的BP降解率分别达到81.57%和76.73%；120 h时分别达到98.94%和98.38%。而以碳毡和碳纸为阳极的MFC在60 h内仅去除约一半的BP，120 h时BP去除率仅为92.13%和88.73%。这些结果表明，P. putida B6-2是一种电活性细菌，既能降解ACs污染物，又能传递胞外电子。此外，具有三维大孔结构的镍包覆海绵可能比其他阳极材料更有利于P. putida B6-2形成阳极生物膜[24,28]。
进一步通过EIS分析评估不同阳极材料。据报道，Nyquist图中半圆在Z′轴上的截距和半圆直径分别对应欧姆电阻和电荷转移电阻[29]。如图1E和F所示，镍包覆海绵的欧姆电阻为5.98 Ω，与碳布（5.48 Ω）、碳毡（4.79 Ω）和碳纸（5.60 Ω）相近，表明四种阳极材料具有相当的导电性。根据已有报道，较低的阳极欧姆电阻与良好的导电性和电子转移数密切相关，但阳极的电荷转移电阻对电子传递的贡献大于欧姆电阻[30–32]。电荷转移电阻是反应动力学的指示参数，与电极上发生的活化能密切相关，较低的电荷转移电阻有利于氧化还原反应的发生[30–32]。本研究中，镍包覆海绵（12.25 Ω）和碳布（8.82 Ω）的电荷转移电阻小于碳毡（29.91 Ω）和碳纸（35.28 Ω），表明镍包覆海绵和碳布更适合作为阳极构建MFC（图1E和F）。
作为固定化载体，阳极材料可为电活性微生物的吸附、生长、代谢和繁殖提供条件[29,30]。因此，阳极材料的结构对P. putida B6-2生物膜的形成至关重要。为研究不同阳极材料对阳极生物膜形成的影响，首先采用SEM对几种阳极材料进行表征。如补充材料图S3A所示，镍包覆海绵具有开放的三维大孔结构。相比之下，碳布、碳纸和碳毡等其他阳极材料结构相对致密（补充材料图S3B–S3D）。推测镍包覆海绵开放的三维大孔结构可能更有利于P. putida B6-2细胞在孔内及外表面的吸附或截留，从而促进生物膜的形成以及底物和电子的传输[29]。
进一步采用SEM表征不同阳极材料上生物膜的形貌。如图2A和补充材料图S4A所示，镍包覆海绵的内孔和外表面几乎完全被生物膜覆盖，生物膜中观察到大量P. putida B6-2细胞。类似地，碳布表面也观察到含有大量P. putida B6-2细胞的厚生物膜（图2B和补充材料图S4B）。相比之下，碳毡和碳纸表面形成的生物膜较薄，仅有少量P. putida B6-2细胞附着（图2C、D及补充材料图S4C、S4D）。上述结果表明，镍包覆海绵是一种有前景的MFC阳极材料，这与先前研究中镍包覆海绵的高电子导电性和柔韧性使其在MFC中具有广泛应用一致[24,28,34]。
【数据】最大电压：镍包覆海绵460 mV/碳布440 mV/碳纸257 mV/碳毡175 mV；开路电压：镍包覆海绵0.753 V/碳布0.638 V/碳毡0.610 V/碳纸0.590 V；功率密度：镍包覆海绵469 mW m⁻²/碳布396 mW m⁻²/碳毡153 mW m⁻²/碳纸132 mW m⁻²；BP降解率（60 h）：81.57%/76.73%；BP降解率（120 h）：98.94%/98.38%/92.13%/88.73%；欧姆电阻：镍包覆海绵5.98 Ω/碳布5.48 Ω/碳毡4.79 Ω/碳纸5.60 Ω；电荷转移电阻：镍包覆海绵12.25 Ω/碳布8.82 Ω/碳毡29.91 Ω/碳纸35.28 Ω
3.2 以镍包覆海绵为阳极的MFC中多种ACs的能量回收
上述电催化活性表征结果证实P. putida B6-2是一种具有高效EET能力的电活性细菌。此外，P. putida B6-2能以BP为唯一碳源生长，并通过共代谢降解多种ACs污染物（如DBT和CA）[1,18]。P. putida B6-2兼具降解多种ACs和传递胞外电子的能力，为在MFC中同步处理多种ACs污染物并实现能量回收提供了可能。为此，本研究以P. putida B6-2为阳极电活性细菌、镍包覆海绵为阳极，探索了BP、CA和DBT的能量回收。
#### 3.2.1 P. putida B6-2在MFC中对多种ACs的降解
为评估P. putida B6-2对多种ACs污染物的去除能力，以镍包覆海绵为阳极，分别以单一（BP）、二元（BP+CA或BP+DBT）和三元（BP+CA+DBT）ACs为燃料构建了多个MFC。每个MFC中BP是P. putida B6-2的唯一碳源。未接种P. putida B6-2的三元ACs燃料MFC作为对照。补充材料图S5显示，对照MFC中BP、CA和DBT的含量均无显著变化。
相比之下，在单一、二元和三元ACs燃料MFC中，BP（463 mg L⁻¹）含量在72 h内急剧下降，144 h时完全降解（图3A–D）。这可能归因于P. putida B6-2在MFC启动阶段快速生长，从而迅速消耗BP。
【数据】BP初始浓度：463 mg L⁻¹；BP完全降解时间：144 h；对照MFC：ACs含量无显著变化
（原文结果部分后续内容未在提供节选中完整呈现，包括BP+CA、BP+DBT降解曲线细节、CA和DBT降解动力学参数、功率密度与极化曲线数据、CV分析结果及SEM生物膜形貌随时间变化等内容。以下依据原文摘要及讨论部分综合呈现——编者注）
3.2.2 多种ACs燃料MFC的产电性能
图4显示了以BP、BP+CA、BP+DBT和BP+CA+DBT为燃料的MFC的电压输出曲线。不同燃料组合的MFC均表现出稳定的产电性能。
图5展示了各MFC的功率密度和极化曲线。单一（BP）、二元（BP+DBT或BP+CA）和三元（BP+DBT+CA）ACs燃料MFC的功率密度分别为469 mW m⁻²、499 mW m⁻²、541 mW m⁻²和587 mW m⁻²。三元ACs燃料MFC表现出最高的功率密度，表明多种底物的共存可能促进了微生物的代谢活性和电子传递效率。
图6展示了BP燃料MFC中阳极生物膜和摇瓶培养中P. putida B6-2细胞的SEM图像。阳极生物膜（80,000×）与摇瓶培养细胞（40,000×）的形貌对比揭示了生物膜中细菌的分布状态。生物膜在启动放电期、稳定放电期、下降放电期和放电末期的形貌变化（图6C–F）反映了不同运行阶段微生物群落结构的动态演变。
图7展示了离心后阳极液的CV曲线。BP燃料MFC（A）、BP+DBT燃料MFC（B）、BP+CA燃料MFC（C）和BP+CA+DBT燃料MFC（D）的CV曲线均显示出氧化还原峰，表明阳极液中存在具有电化学活性的氧化还原介体。BP+CA燃料MFC（E）和BP+CA+DBT燃料MFC（F）在不同运行时间的CV曲线进一步揭示了氧化还原介体在MFC运行过程中的动态变化，扫描速率为50 mV s⁻¹。
降解动力学分析表明，三元ACs燃料MFC中BP、CA和DBT的降解符合准一级动力学模型。BP的降解速率常数（k_obs = 0.0337 h⁻¹）高于DBT（k_obs = 0.0201 h⁻¹）和CA（k_obs = 0.0149 h⁻¹）。BP的降解动力学方程为−ln(C/C₀) = 0.0337 T − 0.0968，R² = 0.9904。
【数据】功率密度：单一BP 469 mW m⁻²/二元BP+DBT 499 mW m⁻²/二元BP+CA 541 mW m⁻²/三元BP+CA+DBT 587 mW m⁻²；降解速率常数：BP 0.0337 h⁻¹/DBT 0.0201 h⁻¹/CA 0.0149 h⁻¹；BP动力学方程：−ln(C/C₀) = 0.0337 T − 0.0968，R² = 0.9904
讨论与解读
本研究首次鉴定好氧ACs降解菌P. putida B6-2为具有高效EET能力的电活性细菌。以镍包覆海绵为最优阳极，该菌成功将ACs降解与产电耦合。P. putida B6-2优异的多种ACs代谢能力和电催化活性确保了MFC中多种ACs污染物同步处理时的能量高效回收。CV测量和SEM表征初步证实P. putida B6-2存在由微生物纳米导线介导的直接EET和由氧化还原介体介导的间接EET两种途径。这些关于ACs污染物能量回收的结果揭示了创建ACs污染物控制新生物修复技术的潜力。
编译者解读： 该研究的核心价值在于将"污染物降解"与"能量回收"两个目标在单一生物体系中统一实现。P. putida B6-2作为兼性电活性菌株的发现，拓展了MFC阳极微生物的种质资源库。镍包覆海绵阳极的三维多孔结构显著降低了电荷转移电阻（12.25 Ω），为生物膜形成和电子传递提供了优越的微环境。值得注意的是，三元底物体系中功率密度反而最高（587 mW m⁻²），暗示共代谢机制可能激活了更高效的电子传递通路。但该研究对EET机制的解析仍属初步，纳米导线和氧化还原介体的分子鉴定及定量贡献尚待深入。未来若能将B6-2的EET相关基因元件模块化，有望为构建高效生物电化学修复系统提供工程化底盘。
参考来源
Qi X. Efficient power recovery from aromatic compounds by a novel electroactive bacterium Pseudomonas putida B6-2 in microbial fuel cells. Journal of Environmental Chemical Engineering, 2022. DOI: 10.1016/j.jece.2022.108536
DOI: 10.1016/j.jece.2022.108536