来源：A dual-color whole-cell biosensor for differential visual detection of As(III) and Hg(II) at drinking water limits（Microchemical Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
砷与汞是两种典型的高毒重金属，常伴随采矿与制造业活动共同污染环境。现有仪器检测方法虽灵敏，却受限于设备成本与操作门槛。本研究在单个大肠杆菌TOP10宿主内整合了As(III)响应的ArsR模块（驱动靛蓝合成）与Hg(II)响应的MerR模块（驱动脱氧紫色杆菌素合成），构建出双色输出全细胞生物传感器pAs-indigo-Hg-DV。该系统对As(III)检出限达0.39 μM，对Hg(II)检出限达0.49 nM，肉眼即可在96孔板中完成半定量初筛，为共暴露场景下的重金属快速评估提供了低成本平台。
研究背景
汞是挥发性强、可远距离迁移、持久且具有生物累积性的全球污染物，在微生物作用下会转化为毒性更高的甲基汞。砷具有高毒性与致癌性，易在水生生物体内富集。采矿与制造业常造成砷和汞共存的复合污染，通过饮用水和食物链显著增加人体暴露风险。因此，对水体中砷和汞含量的监测具有重要的污染预警与风险防控意义。
传统检测依赖原子荧光光谱（AFS）、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）和原子吸收光谱（AAS）等仪器手段。这些方法灵敏度高、准确性好，但设备昂贵、样品前处理复杂且需要专业人员操作，限制了其在常规日常筛查——尤其是砷汞同步检测——中的应用。现有微生物传感器大多只能检测单一金属且输出单色信号，在多种污染物共存时信息量有限。本研究提出一个假设：能否在单个细胞宿主内通过差异显色实现两种重金属的同步检测？围绕这一目标，研究团队构建并系统评估了一种双靶标双色全细胞生物传感器。
研究方法
本研究使用的所有化学品和试剂均为分析纯。实验流程包括质粒构建、生物传感器性能表征和环境验证三个部分。
菌株、质粒与试剂
携带重组质粒的大肠杆菌TOP10在Luria–Bertani（LB）肉汤中常规培养，LB培养基组成为5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L氯化钠，另含50 μg/mL氨苄青霉素。细菌在有氧条件下培养于15 mL带透气盖的生物反应管中（Jet，广州），温度37°C，持续振荡150 rpm。
NaAsO₂（≥99.0%）、HgCl₂（≥99.5%）、CaCl₂（≥96.0%）、MgCl₂（≥98.0%）、MnSO₄（≥99.0%）、NiSO₄（≥98.0%）、CuSO₄（≥99.0%）、ZnSO₄（≥99.0%）、CdCl₂（≥99.0%）、Pb(NO₃)₂（≥99.0%）及C₈H₄K₂O₁₂Sb₂·3H₂O（≥99.0%）均为分析纯试剂（阿拉丁，中国）。L-色氨酸（≥99.0%）购自同一供应商。所有金属储备液新鲜配制至终浓度1 mM。寡核苷酸引物和合成DNA片段由上海生工生物技术有限公司合成。
仪器参数
吸光度测量使用BioTek Epoch酶标仪（Winooski, VT, USA），由Gen5软件控制。采用终点吸光度读取模式，每孔固定积分时间0.1 s，每次测量平均8次灯闪。使用透明平底96孔聚苯乙烯微孔板，启用内置自动光程校正功能，将吸光度归一化为1 cm光程。空白扣除方面，在同一块板上设置含无菌LB培养基但不含金属离子的空白孔，仪器软件在数据导出前自动从所有样品信号中减去空白复孔的平均吸光度。细菌密度在600 nm处定量；脱氧紫色杆菌素（DV）吸光度在570 nm处检测；靛蓝吸光度在620 nm处记录。
质粒构建
双靶标感应质粒分两步组装。第一步，构建As(III)感应响应元件，采用天然偶联遗传电路。为降低本底表达，在As(III)响应启动子Pars下游引入了额外的ArsR结合位点（ABS）。执行元件由本课题组前期优化的靛蓝合酶TrxA-bFMO组成。第二步，构建Hg(II)感应响应元件，采用解偶联遗传电路。执行元件由本课题组前期建立的DV合酶基因簇vioABCE组成。两个感应模块分别通过BglII–SacI和SacI–HindIII限制性酶切位点插入pET-21a骨架载体，得到双靶标感应质粒pAs-indigo-Hg-DV。详细DNA序列见附表S1。所得质粒转化至大肠杆菌TOP10，获得双靶标全细胞生物传感器。
Hg(II)与As(III)感应性能测定
TOP10/pAs-indigo-Hg-DV过夜培养物以1:100比例稀释至新鲜LB肉汤中（37°C，250 rpm，13 h）。采用二倍梯度稀释法设置不同浓度的暴露组。Hg(II)检测的最终浓度范围为0至2000 nM，诱导持续4 h。As(III)检测的最终浓度范围为0至200 μM，培养基中补充1 mM L-色氨酸作为靛蓝生物合成的前体，诱导持续11 h。所有培养物均在37°C、150 rpm振荡条件下培养。
时间-过程响应实验
挑取双通道全细胞生物传感器单菌落，接种至2 mL含适量抗生素的LB液体培养基中，37°C、250 rpm过夜培养活化。随后建立两个独立的时间-过程响应体系，每组设三个生物学重复。
Hg(II)响应时间-过程：设置空白对照、10 nM Hg(II)和50 nM Hg(II)三组。培养物在37°C、150 rpm下孵育，诱导后2 h至12 h每小时取样一次。每管取100 μL测定细胞密度，剩余900 μL用正丁醇萃取回收DV，随后在570 nm处测量吸光度。
As(III)响应时间-过程：设置空白对照、0.5 μM As(III)和1.5 μM As(III)三组。培养物在37°C、150 rpm下孵育，诱导后3 h至12 h每小时取样一次。每管取100 μL测定细胞密度，剩余900 μL用DMSO萃取回收靛蓝产物，随后在620 nm处测量吸光度。详细萃取步骤见2.9节。萃取后，每份样品的上层有机相转移至96孔板进行吸光度读取，并在每个时间点拍摄彩色照片记录颜色变化。
选择性测定
挑取TOP10/As-indigo-Hg-DV单菌落，接种至2 mL含50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C、250 rpm振荡培养12 h。过夜培养物以1:100比例稀释至补充了1 mM L-色氨酸的LB肉汤中。添加不同金属离子进行诱导。
Hg-DV感应系统方面，鉴于Hg(II)对大肠杆菌的高细胞毒性，Hg(II)测试浓度为25 nM和50 nM。Zn(II)、Mn(II)、Mg(II)、Pb(II)、Cu(II)、Ca(II)和Cr(III)分别制备为5 μM和10 μM。As-indigo感应系统方面，As(III)、Sb(III)、Pb(II)、Mg(II)、Mn(II)、Ca(II)、Cu(II)、Cr(III)和Cd(II)均以5 μM补充添加。
金属添加后，所有培养物在37°C、150 rpm振荡下培养11 h。孵育结束后，每份培养物取100 μL通过OD₆₀₀测量定量细菌密度。剩余900 μL培养物进行色素萃取：DV用正丁醇，靛蓝用DMSO。有机相转移至96孔微孔板中。DV和靛蓝的吸光度分别使用酶标仪在570 nm和620 nm处测量。详细萃取步骤见2.9节。所有测定均进行三次生物学重复，结果以平均值±标准差表示（n = 3）。
抗干扰测定
为评估双通道生物传感器在复杂基质中的稳健性，设计了两类抗干扰实验：评估多种共存金属离子对Hg(II)和As(III)检测的干扰效应，以及验证As(III)与Hg(II)之间的交叉干扰。具体实验步骤如下。
多种共存金属离子对砷(III)和汞(II)检测的干扰程度评估
挑取双通道生物传感器菌株TOP10/pAs-indigo-Hg-DV单菌落，接种至含适量抗生素的LB肉汤中过夜培养（37°C，250 rpm，13 h）。活化后的生物传感器细胞以1:100比例稀释至新鲜LB肉汤中。进行两组抗干扰实验。
Hg-DV系统方面，Hg(II)以25 nM终浓度添加，同时加入Pb(II)、Mg(II)、Mn(II)、Ca(II)、Cu(II)、Zn(II)、Cr(III)和Cd(II)各5 μM。对照组不添加金属。在37°C、150 rpm振荡培养4 h后，测量细菌密度和紫色DV信号。
As-indigo系统方面，As(III)以5 μM浓度分别与以下各金属离子（均为5 μM）配对添加：Sb(III)、Pb(II)、Mg(II)、Mn(II)、Ca(II)、Cu(II)、Cr(III)和Cd(II)。对照组不添加金属。培养条件同上，培养11 h后测量细菌密度和靛蓝信号。
【数据】培养基：LB（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）；抗生素：50 μg/mL氨苄青霉素；培养温度：37°C；振荡：150 rpm；Hg(II)诱导时间：4 h；As(III)诱导时间：11 h；Hg(II)浓度范围：0–2000 nM；As(III)浓度范围：0–200 μM；L-色氨酸：1 mM；Hg(II)选择性测试浓度：25/50 nM；其他金属选择性测试浓度：5/10 μM；As(III)抗干扰浓度：5 μM；共存离子浓度：5 μM；检测波长：OD₆₀₀、570 nm（DV）、620 nm（靛蓝）；积分时间：0.1 s/孔；灯闪次数：8次
研究结果
感应性能评估
采用色素报告基因的全细胞生物传感器因设备需求极低和直观的可视化读出，在环境监测中具有显著优势。靛蓝和DV等色素型输出可实现无需精密仪器的裸眼直接检测，大幅降低了常规筛查的技术门槛。然而，现有生物传感器主要集中于单金属检测和单色信号输出，在多种污染物共存时信息量有限。本研究假设：通过差异显色，可在单个细胞宿主内同时检测两种不同重金属。
工程化的TOP10/pAs-indigo-Hg-DV生物传感器对Hg(II)和As(III)均表现出清晰的剂量-响应关系。两种金属的吸光度曲线均呈现先升后降的趋势——峰值响应后随浓度升高而下降。Hg(II)的峰值响应出现在约500 nM处（图2A），As(III)的信号峰值出现在约25 μM处（图2C）。这种抛物线趋势与重金属对宿主细胞活力的毒性效应一致：一旦Hg(II)或As(III)浓度超过耐受阈值，细菌生长受到抑制，报告基因表达下降，色素积累随之减少。
在优化检测条件下，生物传感器在4 h内完成Hg(II)检测，线性响应范围为7.8至125 nM（R² = 0.9855，图2B）。单因素方差分析显示，从第三个稀释管起，响应与对照组相比具有统计学显著性（P < 0.05），Hg(II)检出限（LOD）为0.49 nM。As(III)检测在补充1 mM L-色氨酸的LB培养基中进行，培养11 h，线性范围为0.39至6.25 μM，R² = 0.9845（图2D），LOD为0.39 μM。值得注意的是，裸眼观察确定的LOD值与仪器测量一致——Hg(II)为0.49 nM，As(III)为0.39 μM，展示了免仪器初步筛查的潜力。
传统仪器方法如ICP-MS和AAS虽然灵敏度优异，但设备昂贵、样品前处理复杂且需要专业人员操作，限制了其现场实时监测的实用性。本研究开发的微生物生物传感器通过简单目视观察即可实现定性和定量检测。Hg(II)的LOD为0.49 nM（约0.098 μg/L），As(III)的LOD为0.39 μM（约29 μg/L），与已有微生物传感器的报道值相当。更重要的是，双色输出在接近监管限值的浓度范围内即可裸眼判读，使该平台特别适合大批量样品的高通量筛查和应急现场部署。
根据中国饮用水质量标准（GB 5749–2022），砷的允许限值为10 μg/L，汞为1 μg/L。全球主要监管框架（WHO、美国EPA、欧盟和中国）对砷和汞的允许限值大体一致。本生物传感器的Hg(II)检出限远低于标准阈值，可在安全范围内实现可靠的痕量检测；As(III)检出限略高于监管值，但仍适用于砷污染水的快速筛查和污染事件应急响应。此外，生物传感器的定量上限分别达到Hg(II) 50.15 μg/L（250 nM）和As(III) 468.25 μg/L（6.25 μM），覆盖了常规水质监测所需的浓度范围。
双通道生物传感器对As(III)和Hg(II)表现出时间和剂量依赖性响应
为确定Hg(II)和As(III)检测系统的最佳诱导时间，在不同金属离子浓度下测量了双通道生物传感器在特征波长处的时间-过程吸光度响应（图2）。
Hg(II)系统中，10 nM和50 nM处理组的吸光度均在4–6 h达到峰值，随后出现波动性下降或平台期。50 nM组在6 h达峰后于7 h出现明显下降，之后逐渐恢复。综合考虑响应速度和信号稳定性，4 h时两组的吸光度已显著高于对照组且仍处于上升阶段——此时检测既能保证足够的灵敏度，又能避免峰后信号波动对定量重复性的影响。此外，多数已发表研究采用4 h作为检测终点，便于结果交叉比较。因此，4 h被确定为Hg(II)系统的最佳检测时间。
As(III)系统中，0.5 μM组在9 h后进入平台期，而1.5 μM组吸光度随时间持续上升，12 h达峰。虽然7 h时已能观察到可检测的响应，但7–10 h窗口内靛蓝信号仍不稳定。11 h时，空白对照与所有金属添加组之间的吸光度差异在整个时间过程中达到最大，即使低浓度As(III)污染也能产生清晰可辨的比色信号——充分利用了生物传感器的低检出限。同时，该时间点靛蓝信号波动极小，保证了数据的可靠性和可重复性。据此，11 h被确定为As(III)系统的标准检测终点。
选择性与抗干扰评估
为确保观察到的信号差异完全由目标金属离子的特异性激活引起，并客观反映感应通路的内在识别能力，所有选择性测定中统一补充1 mM L-色氨酸，并在恒温下培养11 h。
如图3A所示，色氨酸的添加提高了Hg(II)通道的背景泄漏表达。这是因为色氨酸不仅是DV和靛蓝生物合成的必需前体，还能促进细菌增殖、增加最终生物量并刺激整体代谢活性，从而导致Hg(II)通道出现相对较高的空白背景。此外，Zn(II)、Mn(II)、Mg(II)、Pb(II)、Cu(II)、Ca(II)和Cr(III)处理组在570 nm处的吸光度均低于空白组。虽然这些金属离子不能特异性激活Hg(II)感应通路，但可能通过抑制细菌生长或干扰代谢活性间接影响了DV的背景表达水平。
【数据】Hg(II)峰值响应浓度：约500 nM；As(III)峰值响应浓度：约25 μM；Hg(II)线性范围：7.8–125 nM（R² = 0.9855）；As(III)线性范围：0.39–6.25 μM（R² = 0.9845）；Hg(II) LOD：0.49 nM（约0.098 μg/L）；As(III) LOD：0.39 μM（约29 μg/L）；Hg(II)定量上限：250 nM（50.15 μg/L）；As(III)定量上限：6.25 μM（468.25 μg/L）；Hg(II)最佳检测时间：4 h；As(III)最佳检测时间：11 h；Hg(II)时间-过程浓度：10/50 nM；As(III)时间-过程浓度：0.5/1.5 μM；统计学：单因素方差分析 P < 0.05（第三个稀释管起）
讨论与解读
本研究成功构建了双靶标全细胞生物传感器TOP10/pAs-indigo-Hg-DV，在单细胞宿主内实现了As(III)和Hg(II)的同时显色检测。该系统通过整合As(III)响应的ArsR模块（驱动靛蓝合成）与Hg(II)响应的MerR模块（驱动脱氧紫色杆菌素合成），分别在620 nm和570 nm产生蓝色与紫色信号。Hg(II)检出限为0.49 nM（0.098 μg/L），远低于最严格的国际阈值（1 μg/L）；As(III)检出限为0.39 μM（29 μg/L），较已报道的多重微生物传感器（通常>1 μM）有显著改善，接近10 μg/L的饮用水限值。MerR-based Hg(II)通道对常见共存金属离子表现出优异特异性；ArsR-based As(III)通道因该调控家族固有的第15族类金属识别谱，对As(III)和Sb(III)均有响应。传感器在地表水和海水基质中保持稳健性能，校准线性R² > 0.93。双色感应范式证明，在单个生物传感器细胞中将多种金属靶标编码为真正独立的色素输出是可行的。
编译者解读
该研究最值得借鉴之处在于"一个细胞、两种颜色"的设计哲学——利用天然调控元件的正交性，将两种重金属检测通道物理分隔在同一质粒上，避免了多菌株混合体系中的种群比例漂移问题。色素输出策略的实用价值在于彻底摆脱了荧光蛋白所需的激发光源，使检测成本降至肉眼可判读的水平。不过，As(III)检出限（29 μg/L）仍高于中国饮用水标准（10 μg/L），距离实际监管应用尚有差距；Sb(III)的交叉响应也提示该平台更适合作为污染预警初筛工具而非精确执法依据。未来若能在调控元件灵敏度上进一步进化，或将推动此类比色传感器从实验室走向现场应急监测。
参考来源
Wei K. A dual-color whole-cell biosensor for differential visual detection of As(III) and Hg(II) at drinking water limits. Microchemical Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.microc.2026.119306
DOI: 10.1016/j.microc.2026.119306