来源：Identification of Riluzole derivatives as novel calmodulin inhibitors with neuroprotective activity by a joint synthesis, biosensor, and computational guided strategy（Biomedicine & Pharmacotherapy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
钙调蛋白（CaM）相关的心血管疾病和神经退行性疾病亟需新型治疗分子。本研究提出了一种四步联合策略——化学合成、FRET生物传感器体外筛选、计算模型预测和分子对接——并以力如太（Riluzole）为母核，合成了一系列4-取代衍生物。其中化合物2b对CaM的抑制率高达80%，NIFPTML模型预测准确率超过80%。该策略有望显著降低药物筛选的动物、材料、时间和人力成本。
研究背景
钙调蛋白是一种酸性、耐热的小分子量蛋白，存在于所有真核细胞中。作为典型的钙离子传感器，CaM参与多种细胞信号传导过程，包括突触可塑性、酶活性调控、离子通道活性调节和基因表达调控。细胞内钙离子浓度的变化通过三种方式调节CaM：在细胞水平指导其亚细胞分布；在分子水平促进与靶蛋白的不同结合模式；校正CaM的构象状态以实现特异性靶标激活。与CaM相关的疾病主要包括心脏病、钙调蛋白病和神经退行性疾病。Ca2+-CaM依赖性蛋白激酶II（CaMKII）已被视为心肌病的潜在指标，其活性增加与心律失常和机械功能障碍相关。此外，由CaM基因突变引起的钙调蛋白病对年轻个体构成危及生命的心律失常风险。
本研究提出了一种通用策略，以力如太为基准化合物，通过化学合成、FRET生物传感器开发与体外活性测定、计算模型构建与体内活性预测、分子对接四个步骤，系统筛选新型CaM抑制剂。
研究方法
4.1 力如太衍生物1–3的通用合成
所有商业化学品均为试剂级，除非另有说明，否则不经进一步纯化直接使用。钯催化剂为市售试剂，不经纯化直接使用：Pd(PPh3)4，纯度99%。所有反应溶剂均为无水溶剂，并按标准程序纯化。所有对空气或水分敏感的反应均在氩气保护下进行；玻璃器皿经130°C干燥并用氩气吹扫。薄层色谱采用0.2 mm厚硅胶Merck F254板，通过紫外灯（λ = 254 nm和360 nm）显色。快速柱色谱分离和纯化在硅胶Flash P60（Silicycle）上进行，230–400目ASTM。最终化合物经1H NMR谱和分析型液相色谱评估，纯度≥95%。熔点使用Büchi B-540仪器在未密封毛细管中测定。红外光谱使用JASCO FT/IR 4100衰减全反射（ATR）模式，扫描区间4000–400 cm−1，分辨率4 cm−1，仅给出各化合物的特征吸收带。1H和13C NMR谱在20–25°C下记录，使用Bruker AC-300谱仪（1H 300 MHz，13C 75.5 MHz）或Bruker AC-500谱仪（1H 500 MHz，13C 125.7 MHz）。化学位移以百万分之一（ppm）为单位，相对于内标溶剂峰报告。记录的峰按多重性（s，单峰；d，二重峰；dd，双二重峰；m，多重峰）、耦合常数和质子数顺序列出。必要时通过DEPT实验和二维相关实验（COSY、HSQCed或HMBC）支持单个13C和1H共振的归属。高分辨质谱（HRMS）由巴斯克大学质谱通用服务中心执行，使用超高效液相色谱（Acquity UPLC，Waters Chromatography）串联QTOF质谱仪（SYNAPT G2 HDMS，Waters Chromatography），电喷雾电离源正离子模式。
#### 4.1.1 4-溴-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺（1）的合成
将KSCN（1.27 g，13.07 mmol）和Br2（0.17 mL，3.27 mmol）的HAcO溶液（2 mL）在室温下加入到2-溴-4-(三氟甲氧基)苯胺（0.84 g，3.27 mmol）的HAcO溶液（7 mL）中，混合物搅拌16小时。用饱和NaHCO3（150 mL）淬灭反应，水相用AcOEt（2×50 mL）萃取。合并有机萃取液，用饱和NaCl（2×50 mL）洗涤，无水Na2SO4干燥，真空浓缩。经柱色谱纯化（硅胶，石油醚/AcOEt 7:3），得到淡黄色固体1（368.2 mg，36%）：熔点（石油醚/AcOEt）：196–199°C。IR（ATR）：3434，3060，1633，1531，1443 cm−1。1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ 7.46（s，1H），7.82（s，1H），8.04（br s，2H）。13C{1H} NMR（75.5 MHz，DMSO-d6）：δ 109.9，114.5，120.6（q，J = 256.1 Hz），122.5，132.3，142.0（q，J = 2.2 Hz），150.7，168.7。MS（ESI）m/z（相对强度）：315（MH+ + 2，100），313（MH+，97）。HRMS（ESI-TOF）：C8H5BrF3N2OS [MH+]理论值312.9258；实测值312.9265。
#### 4.1.2 Suzuki-Miyaura反应。4-芳基-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺2a-c的合成
通用操作：向4-溴-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺（1）（1 mmol）的无水二氧六环溶液中，依次加入合适的硼酸（1.2 mmol）、Na2CO3 2 M溶液（6 mmol）和Pd(PPh3)4（0.1 mmol）。反应混合物回流搅拌24小时，然后除去溶剂，将所得混合物溶于AcOEt（10 mL）。有机相用水（2×10 mL）洗涤，无水Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩。经柱色谱纯化（硅胶，石油醚/AcOEt 7:3），得到相应的4-芳基苯并噻唑-2-胺2a-c。
#### 4.1.3 4-(4-硝基苯基)-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺（2a）
按照通用操作，将4-溴-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺（1）（80.1 mg，0.26 mmol）溶于无水二氧六环（10 mL），与(4-硝基苯基)硼酸（51.3 mg，0.31 mmol）、Na2CO3 2 M溶液（0.8 mL，1.56 mmol）和Pd(PPh3)4（29.6 mg，0.025 mmol）反应。后处理后经柱色谱纯化，得到淡黄色固体2a（71.6 mg，79%）：熔点（石油醚/AcOEt）：246–248°C。IR（ATR）：3398，3282，3147，2920，1537，1347 cm−1。1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ 7.42（d，J = 1.8 Hz，1H），7.88–7.91（m，3H），8.10（d，J = 8.2 Hz，2H），8.30（d，J = 8.2 Hz，2H）。13C{1H} NMR（75.5 MHz，DMSO-d6）：δ 115.4，119.6，120.8（q，J = 255.9 Hz），123.6，128.3，130.9，133.8，142.6（q，J = 2.2 Hz），145.1，146.9，149.9，168.8。MS（ESI）m/z（相对强度）：356（MH+，76）。HRMS（ESI-TOF）：C14H9F3N3O3S [MH+]理论值356.031；实测值356.0326。
#### 4.1.4 4-(4-甲氧基苯基)-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺（2b）
按照通用操作，将4-溴-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺（1）（72.4 mg，0.23 mmol）溶于无水二氧六环（10 mL），与(4-甲氧基苯基)硼酸（42.2 mg，0.28 mmol）、Na2CO3 2 M溶液（0.7 mL，1.38 mmol）和Pd(PPh3)4（26.7 mg，0.023 mmol）反应。后处理后经柱色谱纯化，得到淡黄色固体2b（66.9 mg，85%）：熔点（石油醚/AcOEt）：194–195°C。IR（ATR）：3416，3289，3108，2924，1606，1510，1442 cm−1。1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ 3.81（s，3H），6.98–7.03（m，2H），7.23–7.24（m，1H），7.71–7.79（m，5H）。13C{1H} NMR（75.5 MHz，DMSO-d6）：δ 55.6，113.2，114.0，118.8，120.8（q，J = 255.3 Hz），130.7，130.8，130.9，133.3，142.8（q，J = 2.2 Hz），149.5，159.2，167.7。MS（ESI）m/z（相对强度）：341（MH+，100），318（13）。HRMS（ESI-TOF）：C15H12F3N2O2S [MH+]理论值341.0572；实测值341.0574。
#### 4.1.5 4-(4-氟苯基)-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺（2c）
按照通用操作，将4-溴-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺（1）（45.6 mg，0.15 mmol）溶于无水二氧六环（10 mL），与(4-氟苯基)硼酸（24.4 mg，0.17 mmol）、Na2CO3 2 M溶液（0.44 mL，0.87 mmol）和Pd(PPh3)4（16.8 mg，0.015 mmol）反应。后处理后经柱色谱纯化，得到白色固体2c（23.9 mg，50%）：IR（ATR）：3446，3285，2921，2854，1640，1506，1446 cm−1。1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ 7.27–7.28（m，2H），7.76–7.75（m，5H）。13C{1H} NMR（75.5 MHz，DMSO-d6）：δ 114.0，115.3（d，J = 21.1 Hz），119.2，120.8（q，J = 256.7 Hz），129.9，131.7（d，J = 8.3 Hz），133.4，134.9（d，J = 3.0 Hz），142.7（q，J = 2.2 Hz），149.6，161.5（d，J = 245.0 Hz），168.1。MS（ESI）m/z（相对强度）：329（MH+，100）。HRMS（ESI-TOF）：C14H9F4N2OS [MH+]理论值329.0372；实测值329.0379。
#### 4.1.6 2-氨基-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-4-甲醛（3）的合成
将正丁基锂（1.10 mL，1.81 mmol，1.6 M己烷溶液）在−78°C下加入到4-溴-6-(三氟甲氧基)苯并[d]噻唑-2-胺（1）（195.4 mg，0.62 mmol）的THF溶液（3 mL）中，混合物在该温度下搅拌30分钟。然后，在−78°C下缓慢加入N,N-二甲基甲酰胺（0.24 mL，3.12 mmol），混合物在−78°C下搅拌1小时。用饱和NH4Cl水溶液（10 mL）淬灭反应。混合物逐渐升温至室温，用AcOEt（2×10 mL）萃取。合并有机萃取液，用盐水洗涤，无水Na2SO4干燥，真空浓缩。粗产物经快速柱色谱纯化（硅胶，石油醚/AcOEt 1/1），得到黄色固体3（54.4 mg，33%）：IR（ATR）：3378，3123，2970，2924，1739，1680，1527，1209 cm−1。1H NMR（300 MHz，DMSO-d6）：δ 7.50（s，1H），8.13（s，1H），8.30（br s，2H），10.55（s，1H）。13C{1H} NMR（75.5 MHz，DMSO-d6）：δ 115.9，120.7（q，J = 256.0 Hz），120.8，124.1，135.5，142.1（q，J = 2.2 Hz）。
【数据】KSCN用量：1.27 g（13.07 mmol）；Br2用量：0.17 mL（3.27 mmol）；反应时间：16h；2a产率：79%；2b产率：85%；2c产率：50%；3产率：33%；反应温度：−78°C至回流；催化剂：Pd(PPh3)4（0.1 mmol/1 mmol底物）；碱：Na2CO3 2M
研究结果
2.1 新型力如太衍生物的合成
力如太，即6-(三氟甲氧基)苯并噻唑-2-胺，是苯并噻唑的衍生物。其类似物1–3的合成按Scheme 1所示进行。首先制备4-溴衍生物1，因为溴原子的存在为通过过渡金属催化交叉偶联反应构建更复杂结构提供了极佳的平台。苯并[d]噻唑-2-胺骨架的构建采用了与文献报道的力如太制备方法类似的程序。具体而言，以市售2-溴-4-(三氟甲氧基)苯胺为原料，与由硫氰酸钾和溴在乙酸中原位生成的硫氰ogen进行一锅反应，以中等产率得到化合物1。
随后，通过Suzuki-Miyaura反应对苯并噻唑环进行官能化。以Pd(PPh3)4为催化剂、碳酸钠为碱，Pd(0)介导的化合物1的C-4位芳基化反应与不同的硼酸反应，以优异的产率得到4-芳基力如太衍生物2a-c。最后，通过金属化-亲电试剂序列在C-4位引入甲醛基。化合物1经卤素-金属交换反应（n-BuLi，THF，−78°C）进行锂化，随后与N,N-二甲基甲酰胺反应得到醛3。
2.2 力如太衍生物的生物学测定
本节描述了用于监测Ca2+依赖性CaM与肽靶标之间相互作用的生物传感器的制备和使用。该传感器涉及CaM与靶标肽的融合，以及作为生物传感器组成部分的荧光蛋白的掺入。FRET用于监测Ca2+依赖性CaM与肽靶标的相互作用。该测定允许研究CaM响应钙离子浓度变化而与靶标肽的结合。
原始YC-Nano15的FRET指数在不添加Ca2+时为2.7 ± 0.1，在24 nM游离Ca2+存在下为27.0 ± 0.1，EC50为2.1 ± 0.1 nM。力如太（及相关化合物，终浓度100 µM）对Ca2+敏感性或FRET振幅的影响可忽略不计，但化合物2a除外，它使振幅抑制了17%（补充材料表S1）。
相比之下，SK4生物传感器对Ca2+的响应（其FRET指数从2.0 ± 0.5增加到8.7 ± 0.1）在力如太存在下发生了改变。对Ca2+的响应呈现两个可分辨的阶段：阶段I为低Ca2+浓度（0–150 nM），阶段II为较高浓度（图2）。力如太明显影响阶段II，在不存在和存在该药物的情况下，其EC50分别为302.4 ± 22.3 nM和221.3 ± 31.1 nM。这种响应类似于该化合物对SK2通道功能的影响，表明它可能是一种筛选CaM作用化合物的有用工具。
接下来，作者在力如太类似物存在下使用SK4生物传感器进行Ca2+滴定。重点考察对阶段II的影响，因为该部分响应的信噪比降低影响了阶段I效应的评估。与力如太相反，所研究的化合物均未引起阶段I中Ca2+敏感性的明显变化，但在阶段II中存在明显的降低（见表1）。最大的降低（80%）出现在化合物2b中。
2.3 NIFPTML模型的开发与应用
预测性NIFPTML方法用于不同疾病的药物发现。它们处理如ChEMBL等大型数据集，从多样化的化合物结构中提取模式。与传统试错法相比，它们简化了药物发现过程，减少了时间和成本。在本项目中，这些方法用于预测潜在候选药物，考虑了化合物结构、靶标蛋白、蛋白质相互作用网络（PINs）、特定脑区中的蛋白表达以及测定条件。这些模型可以个性化，根据遗传特征和特定疾病特征为患者匹配药物。本质上，NIFPTML提供了一种数据驱动的计算解决方案，以加速神经保护化合物的发现，可能改善CaM相关神经退行性疾病的治疗。
Eq. 1显示了所提出的NIFPTML-LDA模型。如Hill和Lewicki所报道，采用前向逐步变量选择策略来检测不同条件下更重要的扰动。该模型在训练系列中表现出高特异性（Sp = 80.52%）、敏感性（Sn = 80.83%）和总体准确率（Ac = 80.55%）。此外，该模型在外部验证系列中显示出相似的Sn、Sp和Ac值。表2总结了这些参数。卡方值为χ2 = 146346.05，p值< 0.05，表明分类器实现了两类f(vij)obs = 0与f(vij)obs = 1的统计学显著分离。需要指出的是，所获得的值处于药物化学分类模型应用被认为有用的范围内。
(1) f(vij)calc = −3.880183 + 15.366209·f(vij)ref − 17.196505·Sh2(Drugi) + 1.287039·Sh1(Proty) − 2.784924·Sh2(Proty) − 2.140295·Sh4(Proty) − 8.984754·Sh5(Proty) + 48.607304·Sh0(PIN) + 22.6191659·ΔSh2(Drugi,cj) − 2.320339·ΔSh1(Proty,cj) − 21.381213·ΔSh0(PIN,cj)
n = 794108，χ2 = 146346.05，p < 0.05
该IFPTML-LDA分类模型方程中出现的第一个值是截距，此外方程还包含参考函数、根据边界条件（ΔShk, cj）添加的微扰理论算子（PTO），以及具有相应预测系数的结构描述符（Shk）。所有输入变量的详细说明见表3。模型中包含的药物特异性分子描述符是用于测量药物极性表面积特征的min-max缩放Shannon熵。此外，模型还包含4个与靶标蛋白序列描述符相关的变量和1个与PIN分子描述符相关的变量。所有这些变量均以Shannon熵描述，并按材料和方法部分所述确定。此外，模型还包含对应于药物、靶标蛋白和PIN描述的PTOs。模型的输出f(vij)calc是一个评分函数，表示第i个药物与在脑皮层某个与退行性神经疾病相关的区域中表达的蛋白在不同测定条件组合cj下相互作用的生物活性值vij。对于线性判别分析（LDA）模型，f(vij)calc不取0–1值，也不计为概率。然而，对于给定的f(vij)calc值，LDA算法可以分析相应的后验概率p(f(vij)pred = 1)值。LDA算法使用Mahalanobis距离度量来计算这些概率。通过计算p(f(vij)pred = 1)，可以观察化合物是否具有活性（当p(f(vij)pred = 1) > 0.5时，f(vij)pred = 1）。通过计数f(vij)pred = 1 = f(vij)obs = 1或−1（正确分类）与f(vij)pred ≠ f(vij)obs（错误分类）的案例数，确定模型的特异性和敏感性。该模型可用于预测新化合物的活性。
【数据】YC-Nano15 FRET指数：2.7 ± 0.1（无Ca2+）→ 27.0 ± 0.1（24 nM游离Ca2+）；EC50：2.1 ± 0.1 nM；2a抑制率：17%；SK4 FRET指数：2.0 ± 0.5 → 8.7 ± 0.1；Phase II EC50：302.4 ± 22.3 nM（无药）/ 221.3 ± 31.1 nM（有力如太）；2b最大抑制率：80%；Sp = 80.52%；Sn = 80.83%；Ac = 80.55%；χ2 = 146346.05；n = 794108
讨论与解读
本研究提出了一种用于筛选CaM相关疾病（特别是神经退行性疾病）先导化合物的通用策略，包含化学合成、FRET生物传感器体外筛选、计算模型预测和分子对接四个阶段。以力如太为基准化合物，通过钯催化和锂介导反应成功合成了5个新衍生物。体外评估显示化合物2b抑制CaM活性达80%，为最具潜力的候选分子。NIFPTML算法不仅能预测针对CaM的活性，还可预测相关激酶和其他蛋白的多种生物活性参数。这是首次将药物结构、蛋白序列、脑区蛋白相互作用网络、测试条件及特定表达谱整合在一个综合模型中。
编译者解读： 该研究的亮点在于"合成-传感-计算"三位一体的闭环筛选策略。FRET生物传感器提供了接近生理条件的体外评估手段，而NIFPTML模型则显著降低了后续动物实验的盲目性。化合物2b的80%抑制率值得关注，但其体内药代动力学和血脑屏障穿透性尚未见报道。该方法为CaM相关疾病药物发现提供了可推广的范式，尤其适合资源有限的学术实验室——以计算预筛替代大规模动物实验，既符合3R原则，也提高了先导化合物筛选效率。后续若能将此流程扩展到更多母核结构，有望加速神经退行性疾病新药的发现进程。
参考来源
Baltasar-Marchueta M. Identification of Riluzole derivatives as novel calmodulin inhibitors with neuroprotective activity by a joint synthesis, biosensor, and computational guided strategy. Biomedicine & Pharmacotherapy, 2024. DOI: 10.1016/j.biopha.2024.116602
DOI: 10.1016/j.biopha.2024.116602