来源：Characterizing isoprene production in cyanobacteria – Insights into the effects of light, temperature, and isoprene on Synechocystis sp. PCC 6803（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
异戊二烯是植物热胁迫响应的关键挥发性萜类，兼具工业原料价值。本研究利用改良膜入口质谱（MIMS）与通量平衡分析（FBA），系统考察了光质、光强及温度对集胞藻PCC 6803异戊二烯合成的影响。结果显示：紫光与升温促进异戊二烯产量，且异戊二烯的物理存在本身可增强蓝藻耐热性——这一保护机制首次在蓝藻中得到证实，为异戊二烯及其他萜类的可持续生物制造开辟了新路径。
研究背景
异戊二烯是分子量最小的萜烯，植物在热胁迫下大量释放，全球年排放量估计超过500 Tg碳。在植物叶片中，异戊二烯扮演抗氧化剂角色，清除活性氧（ROS），同时增强类囊体膜的热稳定性。工业上，异戊二烯是合成橡胶等化学品的关键前体，年需求量超过75万吨，目前完全依赖石化来源。其挥发性使异戊二烯可从培养细胞的气相中收集，简化下游处理流程，因此被锁定为可持续生物技术生产的理想靶标。尽管蓝藻工程化生产异戊二烯已有多项酶与代谢途径优化的研究，但培养条件的系统优化鲜有关注。本研究以产异戊二烯集胞藻菌株及两个对照菌株为对象，在多种培养条件下考察异戊二烯合成与细胞生理的耦合关系。
研究方法
2.1 菌株构建与培养
#### 2.1.1 质粒组装
产异戊二烯菌株（下文简称IspS）源自前期研究（Rana et al., 2022）。该菌株设计用于表达密码子优化的来自彩叶草（Coleus forskohlii）的1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（DXS）、天然异戊烯基二磷酸异构酶（IDI）以及来自蓝桉（Eucalyptus globulus）的异戊二烯合酶（EgIspS），上述基因整合于蓝藻染色体的slr0168位点（Kunert et al., 2000）。为构建过表达DXS和IDI但缺乏EgIspS表达的对照菌株，以p6EgIspS质粒（Englund et al., 2018）为模板，通过PCR扩增CfDxs-SynIdi操纵子，使用EcoRI和XbaI限制性内切酶克隆至pEERM3质粒，所得质粒命名为pEERM3_2MEP。
【数据】基因来源：彩叶草DXS、天然IDI、蓝桉EgIspS；整合位点：slr0168；限制性内切酶：EcoRI、XbaI；质粒：pEERM3_2MEP
#### 2.1.2 菌株构建
对照菌株按前期描述的方法（Heidorn et al., 2011）通过自然转化实现染色体整合，合成装置整合至slr0168中性位点（Kunert et al., 2000），同时携带卡那霉素抗性 cassette。所得菌株分别命名为"2MEP"（整合pEERM3_2MEP）和"NS1"（仅整合pEERM3内的卡那霉素cassette）。菌株构建的更多细节见补充材料。2MEP和NS1菌落的培养在含50 µg mL⁻¹卡那霉素的BG-11琼脂平板上进行，阳性转化子通过菌落PCR确认。构建体在slr0168位点的整合通过对菌株在含50 µg mL⁻¹卡那霉素的BG-11（Stanier et al., 1971）液体培养基中进行多轮培养实现。提取基因组DNA（GeneJET基因组DNA纯化试剂盒，Thermo Fischer Scientific，美国）并作为PCR模板，确认菌株完全分离。
【数据】抗生素：卡那霉素50 µg mL⁻¹；培养基：BG-11琼脂/液体；验证方法：菌落PCR、基因组DNA PCR
#### 2.1.3 菌株培养
接种菌株在Erlenmeyer烧瓶中培养，使用补充50 µg mL⁻¹卡那霉素的BG-11培养基，置于轨道摇床（100 rpm）上，连续光照20 µmol photons m⁻² s⁻¹暖白光，温度30°C，大气含2% CO₂。接种培养物每2周更换新鲜培养基。
【数据】培养基：BG-11 + 50 µg mL⁻¹卡那霉素；转速：100 rpm；光强：20 µmol photons m⁻² s⁻¹暖白光；温度：30°C；CO₂：2%；传代周期：每2周
2.2 实验装置
#### 2.2.1 Multi-cultivator中评估异戊二烯生产
菌株在Multi-cultivator MC-1000-MIX（Photon System Instruments, PSI, 捷克）中培养，培养基为补充17 mM HEPES缓冲液（pH调至8.0）和50 µg mL⁻¹卡那霉素的BG-11，光照条件为50和100 µmol photons m⁻² s⁻¹的紫、蓝、绿、橙/红光。单色LED光源的峰值波长及半带宽如下：紫光405 ± 20 nm、蓝光450 ± 25 nm、绿光537 ± 40 nm、红光630 ± 25 nm（光谱见图1a）。培养以恒化器（turbidostat）模式运行，密度范围设定为720 nm处光密度（OD720）0.52–0.56（约10⁷细胞mL⁻¹）。温度维持在30°C或35°C。鼓泡气体中CO₂通过气体混合系统（PSI，捷克）设定为2%（v/v）。每个80 mL培养管的鼓泡速率设为60 mL min⁻¹。接种至MC-1000-MIX后，培养物生长3–5天以达到所需恒化器密度，随后至少培养18小时再取样，以确保完全代谢适应特定培养条件（Zavřel et al., 2015b）。完全适应通过比生长速率稳定性评估确认——比生长速率由OD720和信号计算，同时监测反映培养物叶绿素a浓度的OD680-720信号稳定性（图1a）。适应期结束后，取样测定第2.3节所述参数。样品在4000 × g离心5 min，细胞沉淀保存于−80°C直至后续处理；异戊二烯产量和光合效率分别使用开放入口质谱仪和动力学荧光计在新鲜培养物上测定（详见第2.3节）。
【数据】光质峰值：紫405±20 nm、蓝450±25 nm、绿537±40 nm、红630±25 nm；光强：50/100 µmol photons m⁻² s⁻¹；OD720范围：0.52–0.56；温度：30/35°C；CO₂：2% v/v；管体积：80 mL；鼓泡速率：60 mL min⁻¹；适应时间：≥18 h；离心：4000 × g、5 min
#### 2.2.2 25–45°C温度范围内评估异戊二烯生产
IspS菌株在250 mL Erlenmeyer烧瓶中培养，培养基为补充50 mM碳酸氢钠、50 mM TES缓冲液（pH调至8.0）和50 µg mL⁻¹卡那霉素的BG-11，光照为50 µmol photons m⁻² s⁻¹恒定白光。初始培养3天后，细胞离心（4000 × g，10 min），重悬于新鲜培养基至OD750为0.5，取5 mL培养物分装至8 mL螺口管（Chromacol 10-SV，Thermo Fisher Scientific）。试管在25–45°C、持续振荡、50 µmol photons m⁻² s⁻¹恒定白光下孵育3–24 h。每次培养结束时，取150 µL顶空气体，通过气相色谱（GC）分析异戊二烯含量（Englund et al., 2018）。生长通过750 nm处培养物光密度测量评估。
【数据】培养基：BG-11 + 50 mM NaHCO₃ + 50 mM TES + 50 µg mL⁻¹卡那霉素；光强：50 µmol photons m⁻² s⁻¹白光；离心：4000 × g、10 min；OD750：0.5；培养体积：5 mL/8 mL管；温度范围：25–45°C；时间：3–24 h；GC取样：150 µL顶空
#### 2.2.3 测试异戊二烯存在对集胞藻WT的影响
为评估异戊二烯对集胞藻生理的影响，细胞首先按第2.1.3节所述在250 mL Erlenmeyer烧瓶中培养。在活跃生长期（OD720 < 0.3），取5 mL培养物分装至40 mL玻璃瓶，以PTFE涂层硅胶隔垫密封。向顶空加入不同体积（最多100 µL）的液态异戊二烯分析标准品（≥99.5%，Merck，德国），三重复。玻璃瓶置于培养箱（ZWYR 240，Labwit，澳大利亚）中，温度30或40°C，光照30 µmol photons m⁻² s⁻¹恒定照明，由定制RGB LED面板（PSI，捷克；R:G:B比例设为1:1:1）提供。孵育24 h后，取样分析细胞数量、细胞大小、色素组成和光合性能的变化。
【数据】异戊二烯标准品：≥99.5%，Merck；添加量：≤100 µL；温度：30/40°C；光强：30 µmol photons m⁻² s⁻¹；RGB比例：1:1:1；孵育时间：24 h
2.3 分析方法
#### 2.3.1 改良MIMS用于异戊二烯检测
为定量恒化器实验（第2.2.1节）中的异戊二烯产量，取5 mL培养物分装至40 mL玻璃瓶，以PTFE涂层硅胶隔垫密封。玻璃瓶置于恒温培养箱（ZWYR 240，Labwit）中，温度预设与恒化器培养温度一致（30°C或35°C）。为模拟MC-1000-MIX光照，培养箱由定制RGB LED面板（PSI，捷克）照明，LED光强和光谱与MC-1000-MIX光匹配。顶空异戊二烯含量通过改良膜入口质谱仪（MIMS；Hiden，英国）在4 h孵育期间的离散时间点分析。MIMS改良方式为：将膜入口替换为开放入口，具体做法是将0.45 mm注射器针头连接至1/16″不锈钢管，通过1/16″不锈钢接头（Swagelok，美国）连接至加热的石英惰性毛细管（Hiden，英国）。由于入口开放，质谱仪样品消耗显著，仅允许离散测量。更多细节见图1a和补充材料。
【数据】样品体积：5 mL/40 mL瓶；温度：30/35°C；孵育时间：4 h；针头：0.45 mm；管路：1/16″不锈钢；接头：Swagelok 1/16″
#### 2.3.2 色素分析
叶绿素a、总类胡萝卜素和藻胆体含量按前期建立的方案定量（Zavřel et al., 2015a）。各类胡萝卜素含量通过丙酮提取可溶性色素，并用Shimadzu Prominence HPLC系统（Shimadzu，日本）定量。HPLC配备Phenomenex Synergi Hydro-RP 250 × 4.6 mm色谱柱，粒径4 µm，孔径80 Å。洗脱采用从溶剂A（乙腈:水:三乙胺 = 9:1:0.01）到溶剂B（乙酸乙酯）的线性梯度，持续25 min，流速1 mL min⁻¹，温度25°C。
【数据】HPLC柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP 250×4.6 mm；粒径：4 µm；孔径：80 Å；梯度：A（乙腈:水:三乙胺 9:1:0.01）→B（乙酸乙酯）；时间：25 min；流速：1 mL min⁻¹；温度：25°C
#### 2.3.3 光合效率探测
光合性能使用Mul…
【数据】原文未详述该节后续内容
研究结果
3.1 培养与异戊二烯检测
为定量异戊二烯产量并评估集胞藻胞内代谢变化，IspS、2MEP和NS1三株菌在不同光质、光强和温度下进行培养。培养装置示意总结于图1a。菌株在MC-1000-MIX Multi-cultivator中恒化器模式下培养，达到代谢稳态。这是对所有菌株在所有测试培养条件下进行比较评估的必要前提（Zavřel et al., 2015b）。鉴于异戊二烯的挥发性（沸点约34°C），其产量测定在密闭瓶中最为适宜。MIMS是检测低浓度挥发性产物的合适工具。然而，由于异戊二烯分子极强的疏水性，常规使用的硅胶MIMS入口（Zavřel et al., 2016）无法实现异戊二烯的渗透蒸发——异戊二烯与硅胶膜结合过于紧密，即使MIMS内部10⁻⁶ Torr的真空也不足以提供足够的渗透蒸发驱动力。因此，MIMS检测异戊二烯的唯一选择是通过改良的开放入口从密封瓶中在离散时间点取样。开放入口不影响系统灵敏度或线性（详见补充材料）。
【数据】异戊二烯沸点：约34°C；MIMS真空度：10⁻⁶ Torr
3.2 光质对异戊二烯生产的影响
在单色紫、蓝、绿、红光下定量异戊二烯产量，以匹配叶绿素a（蓝光）和藻胆体（红光）的吸收峰，同时测试对含藻蓝蛋白蓝藻生长有利的其他波长（紫光、绿光（Bernát et al., 2021））。所有菌株的生长速率取决于入射光波长。蓝光下生长最慢，绿光和紫光下加快，红光下最快（图1b），反映了与PQ池氧化还原状态、ATP:NADPH或PSII:PSI比例变化相关的波长特异性改变（Bernát et al., 2021; Singh et al., 2009）。异戊二烯生产者IspS的生长速率在除蓝光外的所有测试光质下均低于NS1对照菌株（图1b，表1），表明ATP、NADPH和还原型铁氧还蛋白（Fdred）从与生长相关的途径（细胞分裂、生物量形成）重新分配至与异戊二烯生产相关的途径。这与2MEP菌株在绿光和红光下生长速率相比NS1对照仅略有降低的结果一致（图1b）。蓝光的情况有所不同——蓝光优先被PSI而非PSII吸收（Singh et al., 2009）。仅向集胞藻提供蓝光会导致严重的代谢和氧化还原失衡，表现为线性电子流减少、PSI周围循环电子流增加，并导致ATP:NADPH比例升高（Singh et al., 2009）。其结果是碳固定和生长速率降低，主要原因是还原当量缺乏（Bernát et al., 2021; Singh et al., 2009）。IspS菌株在红光、绿光和蓝光下的异戊二烯产量相近（图1b）。仅紫光使异戊二烯产量增加，表明碳向异戊二烯生物合成的重定向增加（表1）。向MEP途径更高的碳分配也反映在紫光下IspS菌株类胡萝卜素（myxoxanthophyll、玉米黄质）合成增加（详见补充材料）。无论使用何种单色光，IspS菌株的藻胆体和叶绿素a含量均低于对照菌株（图2b）。另一方面，类胡萝卜素在IspS和2MEP菌株中普遍上调，两者均过表达DXS和IDI（图2b）。由于DXS催化丙酮酸和3-磷酸甘油醛（G3P）不可逆转化为脱氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP），其过表达被假设将更多碳重新分配至MEP途径。类胡萝卜素含量增加证实了这种再分配。进一步添加非天然萜烯合酶则将部分通量导向异戊二烯合成。蓝藻类胡萝卜素主要包括β-胡萝卜素、玉米黄质、echinenone及其3′-羟基化形式、synechoxanthin和myxol糖苷（又称myxoxanthophyll），每种在细胞生理中具有略有不同的作用（Takaichi & Mochimaru, 2007）。与NS1对照相比，IspS菌株中β-胡萝卜素减少，而2MEP菌株中增加。另一方面，叶黄素在IspS和2MEP菌株中普遍上调（详见补充材料）。如第3.6节进一步讨论的，IspS菌株中β-胡萝卜素向叶黄素生物合成消耗增加，可能归因于异戊二烯本身的存在及其类囊体膜的改变（详见补充材料）。类似地，IspS菌株中细胞尺寸减小和更高的非光化学淬灭（NPQ，图2）可能是细胞内异戊二烯存在的结果（图3c）。IspS菌株生长速率的降低可部分归因于线性电子传递速率（ETR）的下降，这可能与光捕获天线下调以及通过状态转换微调光捕获能力降低有关（图2c）。异戊二烯的生产对总细胞蛋白库无影响，但诱导了糖原和部分脂质含量的变化（图2a；详见补充材料）。与前期研究一致（Bernát et al., 2021），紫光和蓝光下PQ池普遍减少。在绿光和红光下（较低的PQH₂/PQ），MEP途径的过表达影响细胞氧化还原状态，IspS和2MEP菌株的PQ池相比对照菌株NS1显著更还原（详见补充材料）。
【数据】光质：紫、蓝、绿、红单色光；生长速率排序：蓝<绿≈紫<红；IspS异戊二烯产量：红≈绿≈蓝，紫光下增加；β-胡萝卜素：IspS↓、2MEP↑（vs NS1）；PQ池：紫/蓝光下减少，绿/红光下IspS和2MEP更还原
3.3 光强对异戊二烯生产的影响
进一步测试了增加光强对异戊二烯生产的影响。IspS和NS1菌株在100 µmol photons m⁻² s⁻¹的红、绿和紫光下培养（下文称高光），培养适应和取样程序与第2.2.1和3.1节所述相同。蓝光未纳入高光处理，因为它最不利于集胞藻生长且对异戊二烯生产无正面效应。IspS和NS1菌株在所有测试高光条件下比生长速率均增加（图1b）。然而，高绿光和高红光下异戊二烯产量仅略有增加，而高紫光下异戊二烯产量甚至下降（图1b）。这表明异戊二烯合成与细胞生长并非直接偶联，与本研究蓝光下生长和异戊二烯产量的结果（图1b）以及早期关于分批培养后期异戊二烯产量更高的报道（Gao et al., 2016）一致。正如最近对另一种代谢产物（乳酸）的研究所示，生长和生产阶段分离可以成为实现高产率的策略（Shabestary et al., 2021）。IspS菌株在细胞体积、细胞组成和光合性能方面与NS1对照的趋势，与50 µmol photons m⁻² s⁻¹下观察到的趋势一致（图2，详见补充材料）。考虑到100 µmol photons m⁻² s⁻¹下碳和光向异戊二烯分配的效率降低（表1），未进行更高光强的进一步测试，光强增加对…
【数据】高光：100 µmol photons m⁻² s⁻¹；比生长速率：高光下IspS和NS1均增加；异戊二烯产量：高绿/红光↑微增，高紫光↓下降
3.4 温度对异戊二烯生产的影响（原文节选未完整呈现，以下根据可获取内容编译）
IspS菌株在25–45°C温度范围内的异戊二烯体内生产特征如图3a所示。温度升高至40°C时异戊二烯产量显著增加。将NS1、2MEP和IspS菌株从30°C转移至40°C（图3b），IspS菌株表现出更强的耐热性。外源添加异戊二烯对集胞藻WT生理的影响如图3c所示。
【数据】温度范围：25–45°C；升温响应：30°C→40°C
3.5 代谢通量分析（基于原文节选）
在100 µmol photons m⁻² s⁻¹红光（630 nm）条件下，通过最小化光子吸收速率并给定实测异戊二烯产量和生长速率，获得预测代谢通量图（图4a）。通量预测可解释为异戊二烯生产所需代谢通量的下界。
【数据】光条件：100 µmol photons m⁻² s⁻¹红光（630 nm）
3.6 异戊二烯对耐热性的影响
异戊二烯的物理存在提高了IspS菌株的耐热性。外源添加异戊二烯的实验证实，这种保护效应可以在不同生物体间转移。与植物中异戊二烯保护机制类似，异戊二烯的存在增强了细胞在高温下的存活能力。IspS菌株中β-胡萝卜素向叶黄素生物合成的消耗增加，可能归因于异戊二烯本身的存在及其对类囊体膜的改变。
【数据】温度：30°C vs 40°C；异戊二烯添加：≤100 µL
讨论与解读
本研究通过改良MIMS系统在多种光质、光强和温度条件下定量了集胞藻的异戊二烯产量，并结合通量平衡分析获得了完整的代谢通量分布。研究证实了异戊二烯的物理存在可提高蓝藻的耐热性，且这种改善可在生物体间转移。紫光促进异戊二烯合成，而升温条件下的产量增加与细胞生长解偶联，提示生长与生产阶段分离可能是实现高产率的策略。该综合方法有望引领异戊二烯及其他萜烯类生物技术产品的可行性生产。
编译者解读：本研究最值得称道之处在于方法学创新——针对异戊二烯强疏水性导致常规MIMS膜入口失效的问题，巧妙改造为开放入口实现离散检测，为其他挥发性萜烯的在线监测提供了可复用的技术方案。发现异戊二烯自身即是一种耐热保护因子，这一结论将植物生理学知识成功迁移至蓝藻体系，暗示"产物保护宿主"的工程策略可能具有普适性。局限在于：高光强下异戊二烯产量下降的机制尚未完全阐明，且恒化器模式与工业分批补料工艺存在差距。未来若能将生长-生产阶段分离策略与光暗循环调控结合，有望进一步提升碳向异戊二烯的分配效率。
参考来源
Rodrigues JS. Characterizing isoprene production in cyanobacteria – Insights into the effects of light, temperature, and isoprene on Synechocystis sp. PCC 6803. Bioresource Technology, 2023. DOI: 10.1016/j.biortech.2023.129068
DOI: 10.1016/j.biortech.2023.129068