来源：Genome engineering of the Corynebacterium glutamicum chromosome by the Extended Dual-In/Out strategy（Journal of Microbiological Methods）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
谷氨酸棒杆菌是工业生物技术的重要模式菌株，但现有基因组编辑方法在重复插入和较大DNA片段整合方面存在局限。本研究将原用于大肠杆菌的Dual-In/Out策略成功改造并应用于谷氨酸棒杆菌，实现了染色体预定位点的重复外来DNA插入。该方法整合了RecE564T介导的重组工程、corynephage ϕ16和P1噬菌体位点特异性重组系统，以及染色体DNA电转化技术。研究还发现不同染色体位点的电转化效率差异显著，并提出了利用Mu噬菌体转座预选整合位点的解决策略。
研究背景
谷氨酸棒杆菌是一种革兰氏阳性土壤细菌，最初因其天然分泌L-谷氨酸的能力而被分离，现已成为大规模工业生物技术的重要宿主。该微生物被普遍认为是安全的，广泛用于从生物燃料、聚合物、大宗和精细化学品到饲料添加剂及营养和医药用高价值化合物的发酵生产。
早期谷氨酸棒杆菌生产菌株通过反复随机诱变和筛选获得。后来的生产菌株主要基于同源重组的定点诱变构建，可实现缺失、替换和较短插入等染色体修饰。该方法利用不能在棒杆菌宿主中复制的各种整合质粒，通过含有延伸同源区的单交换整合入基因组。为获得无痕遗传修饰，需在另一同源位点发生第二次单交换以去除载体骨架并保留修饰区域。然而，这种基于同源重组的方法在重复和较大片段插入方面存在明显局限。因此，开发一种能够实现重复、延伸插入的新型基因组编辑策略，对于拓宽谷氨酸棒杆菌的遗传工具具有重要意义。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用全部菌株和质粒信息见表1。谷氨酸棒杆菌菌株在BHI液体培养基（37 g L⁻¹脑心浸液，Sigma–Aldrich，St. Louis, MO, USA）中、30°C条件下培养。需要时添加相应抗生素，终浓度如下：卡那霉素25 mg L⁻¹（Km25）、氯霉素7.5 mg L⁻¹（Cm7.5）、链霉素10 mg L⁻¹（Sm10）、安普霉素30 mg L⁻¹（Am30）和庆大霉素1 mg L⁻¹（Gm1）。大肠杆菌TG1和LE392菌株作为质粒操作的克隆宿主，在Luria-Bertani（LB）培养基（10 g L⁻¹蛋白胨、5 g L⁻¹酵母提取物和10 g L⁻¹ NaCl）中、37°C条件下培养（Sambrook and Russell, 2001）。需要时向大肠杆菌菌株添加相应抗生素，终浓度如下：Km50、Cm30、Sm25、Am30、Gm10和氨苄青霉素100 mg L⁻¹（Ap100）。
【数据】培养基：BHI（谷氨酸棒杆菌）/LB（大肠杆菌）；温度：30°C（谷氨酸棒杆菌）/37°C（大肠杆菌）；抗生素浓度：Km25、Cm7.5、Sm10、Am30、Gm1（谷氨酸棒杆菌）；Km50、Cm30、Sm25、Am30、Gm10、Ap100（大肠杆菌）
2.2 重组DNA技术
本工作所用寡核苷酸列于表S1。限制性酶切、连接和电泳按照标准方案进行（Sambrook and Russell, 2001）。所有重组CRIM载体、自主复制载体、质粒和“辅助质粒”的构建详见补充材料。限制性内切酶、T4 DNA连接酶和High Fidelity PCR Enzyme Mix购自Thermo Fisher Scientific（Waltham, MA, USA）。Taq DNA聚合酶购自Sileks-M（Moscow, Russia），Gibson Assembly Master Mix购自New England BioLabs（Ipswich, MA, USA）。这些酶按照制造商说明使用。DNA测序由Evrogen（Moscow, Russia）商业完成。DNA合成由Integrated DNA Technologies商业完成（https://eu.idtdna.com/pages/products/genes-and-gene-fragments/custom gene synthesis）。质粒DNA使用Plasmid Miniprep kit（Evrogen）分离。对于染色体DNA向谷氨酸棒杆菌菌株的电转化，基因组DNA使用Wizard® Genomic DNA Purification Kit（Promega, Madison, USA）分离，随后用酚–氯仿抽提法进行必要纯化（Sambrook and Russell, 2001）。
【数据】试剂来源：Thermo Fisher Scientific、Sileks-M、New England BioLabs；DNA测序：Evrogen；DNA合成：Integrated DNA Technologies；基因组DNA纯化：Wizard® Kit + 酚–氯仿抽提
2.3 谷氨酸棒杆菌电穿孔方案
将谷氨酸棒杆菌过夜培养物（OD600 ≈ 12）加入含5 mL BHI液体培养基的试管中，补加1 mL 10%甘氨酸和0.5 mL 1% Tween 80，至OD600 = 0.5。细胞在30°C、 agitation（250 rpm）条件下培养至OD600 ≈ 1.5–2，约需2小时。随后，将来自一支试管的细胞培养物收集为一份制备物，离心（0.5 min，13,000 rpm），在室温下用1 mL无菌水洗涤三次，并浓缩至总体积（计入添加的DNA样品体积）为100 μL。将这些电感受态细胞与DNA混合，立即转移至0.1-cm无菌冷电极杯中进行电穿孔，电压1.6 kV，使用MicroPulser™（Bio–Rad, Hercules, CA, USA）。细胞立即用1 mL BHI培养基稀释，在30°C下振荡恢复培养，随后接种于1.6%琼脂BHI选择性培养基平板，在30°C生长1–2天后筛选所需转化子。典型质粒电转化添加约100 ng质粒DNA。所有测试谷氨酸棒杆菌菌株的质粒转化恢复时间均为2小时，但p06-KmR-P dapA-Cre质粒转化除外，其恢复时间为1小时。为获得高转化效率，ATCC 13032菌株的细胞在电穿孔后立即在1 mL BHI培养基中进行热激处理（46°C，6 min）。对于使用PCR来源线性dsDNA片段（扩增子）进行重组工程，携带辅助质粒pVC-AmR-LacI-P trc-id2-RecE564T的谷氨酸棒杆菌过夜培养物按上述方法在BHI + 甘氨酸 + Tween 80培养基中稀释，并补加Am30和2 mM IPTG以诱导RecE564T编码基因的表达。通常将2微克扩增子电穿孔进入感受态细胞。电穿孔后，细胞立即用1 mL含2 mM IPTG的BHI培养基稀释，在30°C下振荡培养3.5小时。通过20 μg纯化基因组DNA进行染色体电穿孔的程序对所有菌株相同，恢复时间为2小时。
【数据】甘氨酸浓度：10%（1 mL）；Tween 80浓度：1%（0.5 mL）；培养温度：30°C；转速：250 rpm；培养时间：约2 h；离心：0.5 min，13,000 rpm；电穿孔电压：1.6 kV；质粒DNA量：约100 ng；恢复时间：2 h（p06-KmR-P dapA-Cre为1 h）；热激：46°C，6 min；IPTG浓度：2 mM；扩增子量：2 μg；恢复培养：30°C，3.5 h；基因组DNA量：20 μg
2.4 lox侧翼载体部分的切除
将质粒p06-KmR-P dapA-Cre转化入谷氨酸棒杆菌菌株，用于切除已整合至细菌染色体中的重组CRIM质粒上由lox66/71侧翼、带有CmR标记的载体部分。细胞在恢复1小时后接种于含Km25的固体BHI培养基平板，在30°C下孵育2天。选出的KmR克隆在固体BHI培养基上划线至单菌落，在30°C下培养以同时进行Cre介导的CmR标记切除和辅助质粒消除。所得菌落在固体BHI、BHI + Km25和BHI + Cm7.5平板上进行影印培养，以筛选CmS KmS克隆用于后续PCR确认。
【数据】抗生素：Km25、Cm7.5；恢复时间：1 h；培养温度：30°C；培养时间：2天
2.5 质粒消除（标准技术）
为从棒杆菌菌株中消除任何辅助质粒，将少量培养物接种于含5 mL无抗生素液体BHI培养基的试管中，30°C过夜培养。然后，将10 μL过夜培养物加入5 mL新鲜培养基中，再次过夜培养。随后，将第二次过夜培养物稀释（10⁻⁵、10⁻⁴）并接种于固体BHI培养基平板。所得克隆在含或不含选择性抗生素的固体BHI培养基上影印培养。结果约90%的克隆失去了辅助质粒。
【数据】稀释倍数：10⁻⁵、10⁻⁴；质粒丢失率：约90%
2.6 pVC-AmR-Intϕ16-SceI质粒消除
为消除辅助质粒pVC-AmR-Int ϕ16-SceI，培养物在含2 mM IPTG的液体BHI培养基中过夜生长，以表达I-SceI大范围核酸酶基因，该酶识别并切割位于同一质粒上的同源位点。随后，细胞按上述标准质粒消除方法稀释接种于固体培养基平板并进行影印培养。超过50%的克隆失去了pVC-AmR-Int ϕ16-SceI质粒。
【数据】IPTG浓度：2 mM；质粒丢失率：>50%
2.7 荧光强度测定
首先，将携带TurboRFP和/或yEGFP编码基因的测试菌株以及不含其中一个或两个基因的对照细胞的过夜培养物各取0.1 mL等分试样，用水洗涤并稀释10倍，取200 μL细胞悬液转移至黑色96孔板（GBO, Kremsmunster, Austria）。使用Tecan Infinity M200酶标仪（Tecan, Austria）测量600 nm处光密度（OD600）和荧光强度（F）。TurboRFP和yEGFP的激发/发射波长分别选为540/574 nm和490/522 nm。以水为空白样品的荧光强度作为背景荧光（Fbackground）。相对荧光强度（RF）按公式RF = [(Ftarget – Fbackground)/(ODtarget – ODbackground)]计算，以任意单位表示。
【数据】激发/发射波长：TurboRFP 540/574 nm；yEGFP 490/522 nm；稀释倍数：10倍；样品体积：200 μL
研究结果
3.1 染色体电穿孔介导的遗传修饰转移
目前尚未见谷氨酸棒杆菌中成功应用普遍性转导（如大肠杆菌的P1转导）的报道。因此，开发扩展Dual-In/Out策略的关键在于测试染色体电转化作为突变组合替代途径的可能性——这种方法不仅已在大肠杆菌中有所描述（Kilbane and Bielaga, 1991; Sheng et al., 1995），在其他几种细菌中也有报道（Choi et al., 2006; Katashkina et al., 2009）。已知电穿孔使DNA穿透细胞并不保证引入的dsDNA随后能通过HR介导整合入细菌染色体，即使在天然感受态细菌中也是如此。整合需要加工穿透的DNA，这要求宿主重组酶全套主动协同参与（Lefrançois et al., 1998）。
此前，通过已开发的双组分Mu转座系统——包括整合载体pAH-mini-Mu(LER)-YS（GenBank MG014200）和辅助质粒pVK-lacI Q-P tac-MuAB（GenBank MG014199）（表1；Gorshkova et al., 2018）——已将一组带标记的mini-Mu(LER)单元整合到谷氨酸棒杆菌染色体的不同位点。这些mini-Mu单元携带SmR作为可被Cre切除的抗生素抗性标记。10个插入位点沿谷氨酸棒杆菌ATCC 13869全基因组随机分布，其精确位置根据先前开发的基于“反向PCR”（Ochman et al., 1988）的策略（Zimenkov et al., 2004）确定，并根据已发表的染色体图谱以近似坐标命名（表2）。
为测试电穿孔介导的染色体转移可能性，以基因组中带有mini-Mu插入的ATCC 13869衍生突变株（命名为69 x::[mini-Mu(LER)]，其中x代表任一相应整合位点（表1））作为染色体DNA供体，而以另一个在细菌染色体天然attB ϕ16位点（2,483,498-2,483,526位置）携带CmR标记的ATCC 13869衍生菌株（命名为69 B::Cm（表1；69 B::Cm菌株的构建见结果第3.3节））作为受体。在供体菌株纯化染色体DNA的所有独立电转化实验中，均可轻松检测到CmR SmR谷氨酸棒杆菌克隆；不同mini-Mu整合位点菌株的DNA制备物转化效率各不相同（平均为16至676 cfu/20 μg基因组DNA/10⁸存活细胞（表2）），而相同受体69 B::Cm用不含染色体DNA的空样品电穿孔仅出现1–3个CmR、SmR谷氨酸棒杆菌克隆。专门设计的基于PCR的实验（寡核苷酸列表见补充材料（表S1））证实，所得重组菌株（命名为69 B::Cm x::[mini-Mu(LER)]）在相同染色体位点x携带了全长mini-Mu单元，与电转化实验中作为供体的相应祖代菌株69 x::[mini-Mu(LER)]一致。
此外，以类似方式，为广泛使用的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032（GenBank NC003450.3）和MB001（GenBank CP005959.1）菌株分别获得了SmR标记的mini-Mu整合文库32 y::[mini-Mu(LER)]和MB001 z::[mini-Mu(LER)]（表1）。对谷氨酸棒杆菌CmR菌株ATCC 13032和MB001（分别命名为32 B::Cm和MB001 B::Cm（表1；32 B::Cm和MB001 B::Cm菌株的构建见结果第3.3节）），通过染色体电转化成功实现了每个Mu衍生SmR标记位点的转移。所得转移效率见表2。标记单元的正确转移及其在受体染色体相同位点的正确定位通过适当寡核苷酸的PCR分析验证（表S1）。因此，将位于谷氨酸棒杆菌基因组不同染色体位点、可用于Mu驱动整合的不同突变进行组合是可行的。考虑到通常提出的（Akhverdyan et al., 2011）Mu驱动整合位点沿细菌染色体随机分布，最初预期通过调整后的电转化程序可转移谷氨酸棒杆菌DNA的任意靶向DNA片段。
【数据】转化效率：16至676 cfu/20 μg基因组DNA/10⁸存活细胞（不同位点变异）；空样品对照：1–3个克隆；mini-Mu插入位点：10个（ATCC 13869）；attB ϕ16位点：2,483,498-2,483,526
3.2 Dual-In/Out质粒组的设计
为在谷氨酸棒杆菌中应用Dual-In/Out策略（图1 I(A–D)），根据标准基因工程程序设计并获得了一套自主复制和条件复制质粒；这些质粒与为大肠杆菌系统开发的结构类似（Haldimann and Wanner, 2001; Minaeva et al., 2008）。
#### 3.2.1 重组工程辅助质粒的描述
迄今为止，在谷氨酸棒杆菌中提供RecET介导重组工程实验的可能性已被成功证实，这得益于靶向染色体位点与带有同源臂（最优长度约800–1000 bp）的线性DNA之间的高效HR等位基因交换（Huang et al., 2017; Luo et al., 2021; Li et al., 2021）。值得注意的是，所有这些实验均使用编码866 aa全长蛋白的全长Rac原噬菌体recE基因以及recT基因。在本研究中，截短变体RecE蛋白首次用于棒杆菌中的重组工程实验。
选择RecE564是因为它是早期测试的截短RecE衍生物（如RecE588、RecE595、RecE602、RecE606（Zhang et al., 1998; Muyrers et al., 2000; Fu et al., 2012））中“最长”的，保留了与RecE C端最后260个氨基酸的外切酶结构域相关的外切酶VIII活性（Chu et al., 1989; Zhang et al., 2009）。决定使用最长的截短RecE衍生物主要基于消除Rac原噬菌体recE基因中“异源”于棒杆菌的部分——该区域在367–433 a.a.编码区存在非最优（根据%MinMax工具（Rodriguez et al., 2018））的氨基酸密码子翻译，但希望保留不仅对截短型、也对全长RecE特有的重组工程活性（Fu et al., 2012）。
因此，构建了双复制子质粒pVC-AmR-LacI-P trc-id2-RecE564T（GenBank OK651221，图2A）以在谷氨酸棒杆菌中提供重组工程。该质粒以pVC7N穿梭载体（Hashiro et al., 2019）骨架为基础，携带来自pUC样质粒pHSG399的高拷贝数（HCN）大肠杆菌复制子和来自谷氨酸棒杆菌ATCC 13869隐蔽质粒pAM330的中等拷贝数（MCN）棒杆菌复制子。质粒pVC-AmR-LacI-P trc-id2-RecE564T用于诱导表达编码截短变体RecE（从额外Met密码子起始，从Asp564密码子延续至RecE编码部分末端）和来自大肠杆菌Rac原噬菌体的全长RecT的基因。紧密LacI调控的杂合启动子P trc-id2 = P trc/O lac-id-O lac（在众所周知的（Brosius et al., 1985）P trc-O lac-启动子/操纵基因杂合调控区的“-35”和“-10”之间额外插入“对称的”20-bp O lac-ideal（Lehming et al., 1987; Oehler et al., 1994）（Skorokhodova et al., 2006））与带天然启动子的大肠杆菌lacI基因组合，提供高度抑制且IPTG诱导的受控基因表达。
【数据】同源臂长度：约800–1000 bp；RecE564截短位置：Asp564至C端；RecE蛋白长度：866 aa（全长）；截短RecE变体：RecE588、RecE595、RecE602、RecE606；质粒GenBank号：OK651221
#### 3.2.2 基于corynephage ϕ16 Xis/Int驱动SSR系统的“辅助”质粒描述
迄今为止，corynephage ϕ16（Moreau et al., 1995）Xis/Int驱动SSR系统的所有基本遗传元件和蛋白产物——包括attP ϕ16位点、attB ϕ16位点以及Int和Xis蛋白——均已成功用于谷氨酸棒杆菌染色体中标记DNA片段的整合和切除。在本研究中，构建了基于ϕ16 Int/Xis SSR系统的“辅助”质粒pVC-AmR-Int ϕ16-SceI（GenBank OK651222，图2B）和pVC-KmR-(Xis/Int) ϕ16（GenBank OK651223，图2C），以及整合质粒pCRIM-CmR-lox-attP ϕ16（GenBank OK651220，图2D）和切除辅助质粒p06-KmR-P dapA-Cre（图2E）。这些质粒的构建细节见补充材料。
【数据】质粒GenBank号：OK651222、OK651223、OK651220；抗生素标记：AmR、KmR、CmR
3.3 荧光蛋白基因在attB ϕ16位点的整合与组合
（注：原文结果3.3节完整内容——包括69 B::Cm、32 B::Cm和MB001 B::Cm菌株的构建过程，以及yEGFP和TurboRFP基因在attB ϕ16位点的整合与组合实验——在提供的原文节选中未完整呈现，此处根据摘要和图表信息概括如下：）
通过所建立的Dual-In/Out策略，将yEGFP和TurboRFP荧光蛋白基因整合至谷氨酸棒杆菌染色体的预设计位点。图3显示了亲本菌株ATCC 13869（1）及其衍生菌株——69 ΔB 400::G（2）、69 ΔB 2370::G（3）、69 ΔB 668::R（4）、69 ΔB 400::G 668::R（5）和69 ΔB 400::G 668::R 2370::G（6）——中yEGFP和TurboRFP的相对荧光强度。
【数据】菌株：ATCC 13869及5个衍生菌株；荧光蛋白：yEGFP、TurboRFP；整合位点：ΔB 400、ΔB 668、ΔB 2370
讨论与解读
本研究的主要目标是将先前为大肠杆菌开发的Dual-In/Out策略适应于谷氨酸棒杆菌，其优势在于可引入重复和延伸插入，从而拓宽谷氨酸棒杆菌的遗传工具。应用温带corynephage ϕ16的SSR遗传元件，与来自大肠杆菌Rac原噬菌体和P1噬菌体的HR和SSR催化异源元件相结合，帮助开发了在谷氨酸棒杆菌染色体预设计位点进行染色体编辑的新策略。基于自主复制和条件复制载体，成功构建了一套特异性“辅助”和CRIM质粒，其实验特性得到确认。
研究发现，不同染色体位点的电转化效率波动显著（最高达两个数量级），这可能与细菌染色体相应位点的重组可及性有关。为此，研究提出将Mu噬菌体驱动的转座作为预选单插入便利染色体区域的有力方法，并进一步在同一菌株中组合这些插入。此外，受体菌株中RecE564/RecT编码基因的表达促进了穿透DNA的遗传。
编译者解读
该研究的技术亮点在于将大肠杆菌成熟的Dual-In/Out策略系统性地迁移至谷氨酸棒杆菌，并针对宿主差异进行了多项创新性调整：首次使用截短RecE564变体、整合ϕ16 SSR系统、开发染色体电转化方法。Mu转座预选策略的提出巧妙规避了染色体位点可及性差异带来的效率瓶颈，为工业菌株的多基因叠加改造提供了可行路径。然而，电转化效率高达两个数量级的波动提示该方法在不同菌株和位点间的可预测性仍有待提升。从合成生物学应用角度看，该策略为谷氨酸棒杆菌的基因组规模工程化改造——如多基因代谢途径的染色体整合——奠定了基础性工具平台。
参考来源
Lobanova, J. S. (2022). Genome engineering of the Corynebacterium glutamicum chromosome by the Extended Dual-In/Out strategy. Journal of Microbiological Methods, 2022. DOI: 10.1016/j.mimet.2022.106555
DOI: 10.1016/j.mimet.2022.106555