来源：Construction of Corynebacterium glutamicum for efficient secretion and production of recombinant proteins using the technology of ARTP mutagenesis and fluorescen activated droplet microfluidic screening（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
谷氨酸棒杆菌是工业重组蛋白生产的重要底盘菌株，但分泌效率不足制约了其应用。本研究以猪胸膜肺炎放线杆菌外膜蛋白Omp7为报告蛋白，建立FlAsH-TC荧光监测系统，结合四轮常压室温等离子体（ARTP）诱变与荧光激活微滴分选（FADS）技术，获得高效分泌突变株CT3-28。5 L发酵罐补料分批实验中Omp7产量达211.3 mg·L⁻¹，较野生型提高82.6%。全基因组重测序鉴定出91个SNP位点，其中RS02840和RS02495对重组蛋白分泌具有显著调控作用。
研究背景
微生物作为重组蛋白"细胞工厂"近年来备受关注。生物医药的快速发展带动了抗体、疫苗、酶等治疗性蛋白的巨大需求。微生物系统凭借生长快速、产量高的特点，能够满足市场对生产规模和效率的严格要求，这是传统哺乳动物细胞平台难以比拟的优势。革兰氏阳性菌如谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌，因遗传背景清晰、无内毒素产生、蛋白分泌能力强，成为经济生产高质量重组蛋白的理想平台。谷氨酸棒杆菌是非致病性土壤细菌，能够将蛋白质分泌到内源蛋白酶活性极低的文化基中，是异源蛋白生产的优良底盘生物。常规优化策略多依赖理性的试错方法，如启动子工程、RBS修饰、二硫键形成增强等，但效率有限。本研究采用非理性的ARTP诱变结合FADS高通量筛选，探索提升谷氨酸棒杆菌分泌表达能力的替代路径。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒列于表1。
2.2 培养基与培养条件
培养条件如下：大肠杆菌在LB培养基（含10 g·L⁻¹胰蛋白胨、5 g·L⁻¹酵母提取物、10 g·L⁻¹ NaCl）中于37°C、200 rpm培养；谷氨酸棒杆菌菌株于30°C、220 rpm培养。谷氨酸棒杆菌活化使用LBB培养基（LB补充10 g·L⁻¹脑心浸液）和液体LBHIS培养基（含5 g·L⁻¹胰蛋白胨、2.5 g·L⁻¹酵母提取物、5 g·L⁻¹ NaCl、18.5 g·L⁻¹脑心浸液、91 g·L⁻¹山梨醇）。CGXII培养基用于异源蛋白生产。基础溶液含（每升）：(NH₄)₂SO₄ 20 g、尿素5 g、KH₂PO₄ 1 g、K₂HPO₄ 1 g、MOPS 42 g。溶解后用4 M NaOH调pH至7.0，121°C高压灭菌20 min。冷却后加入以下过滤除菌组分：100 µL混合储备液（含10 g·L⁻¹ CaCl₂、25 g·L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、0.2 g·L⁻¹生物素，用去离子水配制并经0.22 µm膜过滤除菌）、250 µL 40%（w/v）葡萄糖溶液、5 µL微量元素溶液（组成见下）、5 µL 0.2 g·mL⁻¹原儿茶酸溶液（过滤除菌）。最终用无菌去离子水定容至100 mL。微量元素溶液含（每升）：FeSO₄·7H₂O 10 mg、MnSO₄·H₂O 10 mg、ZnSO₄·7H₂O 1 mg、CuSO₄ 0.2 mg、NiCl₂·6H₂O 0.02 mg。培养条件为30°C、220 rpm。发酵罐培养使用CGF培养基，组成如下（g·L⁻¹）：葡萄糖30.0、脑心浸液30.0、KH₂PO₄ 1.0、(NH₄)₂SO₄ 20.0、MgSO₄ 1.0。此外，CGXII-YTOP培养基（g·L⁻¹）由CGXII基础培养基补充1.0蛋白胨、1.0酵母提取物、10.0葡萄糖、18.0大豆胨配制而成。抗生素筛选使用氯霉素（谷氨酸棒杆菌15 µg·mL⁻¹，大肠杆菌30 µg·mL⁻¹），卡那霉素浓度相同。
【数据】LB培养基：10 g·L⁻¹胰蛋白胨+5 g·L⁻¹酵母提取物+10 g·L⁻¹ NaCl；大肠杆菌培养：37°C、200 rpm；谷氨酸棒杆菌培养：30°C、220 rpm；LBHIS培养基：5 g·L⁻¹胰蛋白胨+2.5 g·L⁻¹酵母提取物+5 g·L⁻¹ NaCl+18.5 g·L⁻¹脑心浸液+91 g·L⁻¹山梨醇；CGXII基础液：(NH₄)₂SO₄ 20 g·L⁻¹+尿素5 g·L⁻¹+KH₂PO₄ 1 g·L⁻¹+K₂HPO₄ 1 g·L⁻¹+MOPS 42 g·L⁻¹；pH 7.0；灭菌：121°C、20 min；葡萄糖：40%（w/v）250 µL；氯霉素：谷氨酸棒杆菌15 µg·mL⁻¹、大肠杆菌30 µg·mL⁻¹
2.3 ARTP诱变
ARTP诱变方案参照Meng等（2021）的描述进行。对重组谷氨酸棒杆菌菌株WT-pXMJ19-Omp7-TC进行ARTP诱变，该菌株携带pXMJ19-Omp7-TC质粒，在IPTG诱导的Ptac启动子控制下表达C端融合四半胱氨酸（TC）标签的Omp7蛋白。为高效筛选高产重组蛋白菌株并建立相应的ARTP诱变突变文库，需确定最佳ARTP诱变时长。以0 s为对照，在30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s进行ARTP诱变，计算致死率。梯度实验中，从相应平板随机挑取10²至10³个单菌落，接种于含1 mL BHI液体培养基的48孔板中，30°C振荡培养24 h。随后样品经适当稀释，用酶标仪测定荧光值。
【数据】ARTP诱变时间梯度：30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s；对照：0 s；培养：48孔板、1 mL BHI液体培养基、30°C、24 h；检测：酶标仪荧光测定
2.4 蛋白检测与定量分析
FlAsH-四半胱氨酸检测法（Haitjema等，2014）是一种广泛用于真核生物细胞内靶蛋白的荧光示踪方法。荧光素衍生物FlAsH-EDT₂中的两个As(III)取代基可通过以四半胱氨酸标签（−FLNCCPGCCMEP−，TC标签）形式替代一分子的EDT与两个半胱氨酸巯基结合，形成稳定的荧光发色团。当该标签融合到蛋白C端时，可利用FlAsH-EDT₂对其进行检测和细胞内定位示踪。为检测分泌蛋白，本研究对FlAsH-TC检测法进行了改造。具体而言，将CspB信号肽融合到Omp7蛋白N端，TC标签融合到C端。蛋白分泌到胞外培养基后，标签部分保持可及状态，无需细胞裂解或蛋白纯化即可直接进行原位荧光标记和定量分析。Omp7蛋白表达由诱导型Ptac启动子驱动，在不同诱导时长下进行。各实验组培养上清同时进行SDS-PAGE分析和FlAsH-TC反应，随后测定荧光。FlAsH-EDT₂储备液（购自加拿大TRC公司）以二甲基亚砜配制为10 mM浓度。储备液配制如下：1 M二硫苏糖醇和0.5 M三(2-羧乙基)膦分别溶于去离子水；500 mM 2,3-二巯基-1-丙醇溶于乙醇。水溶液于−20°C避光保存，乙醇溶液于室温避光保存，备用。FlAsH-TC标记与荧光测定：检测分泌的Omp7-TC时，将培养上清与新鲜配制的FlAsH-EDT₂工作液（终浓度2 µM FlAsH-EDT₂、10 µM 2,3-二巯基-1-丙醇、1 mM三(2-羧乙基)膦，溶于PBS）混合，室温避光孵育1 h。用酶标仪测定荧光强度。蛋白定量时，将已知浓度的蛋白标准品进行SDS-PAGE，将灰度值与蛋白浓度关联生成标准曲线。在3.4节中，5 L发酵罐培养的上清样品经SDS-PAGE分析，用ImageJ软件量化Omp7蛋白条带灰度值，根据标准曲线确定蛋白浓度（图S1）。
【数据】FlAsH-EDT₂储备液：10 mM（DMSO溶解）；DTT：1 M；TCEP：0.5 M；2,3-二巯基-1-丙醇：500 mM（乙醇溶解）；FlAsH-TC工作液：2 µM FlAsH-EDT₂+10 µM 2,3-二巯基-1-丙醇+1 mM TCEP（PBS）；标记条件：室温、避光、1 h；定量：SDS-PAGE灰度值+ImageJ+标准曲线
2.5 高通量筛选
高通量筛选包括三个关键阶段：初始微滴微流控分选、后续48孔板分选、多轮诱变与迭代分选。微滴微流控筛选时，CGXII培养基作为产生微滴的最佳培养基（分散介质）。活化菌株转移到含氯霉素和IPTG的CGXII培养基中。
水包油微滴生成：启动泵参数和图像采集软件，通过泵程序激活金属浴。使用三端口微流控芯片进行水包油微滴生成。将500 µL油相和2 mL水相（菌液调节至OD = 0.05）分别转移至2 mL Eppendorf管中，在金属浴中孵育，连接气泵和芯片。实时成像下，泵参数设为400滴/s（油）和450滴/s（菌液），随后微调以产生均匀的65 µm直径微滴。清除收集口多余液体，收集微滴1 h，随后30°C离线孵育12 h。
双砷化合物底物注入微滴：使用四端口微流控芯片（端口自上而下：含800 µL分选油的油相、水相、微滴再生口、收集出口）；芯片本体标记黑色标记，连接端口标记红色标记（红色在黑色下方）。水相和油相连接对应泵和芯片。预成型微滴以400滴/s（油）和450滴/s（菌液）注入，细胞密度控制在OD = 0.05以维持65 µm微滴。设置三个压力梯度，油相压力低于水相。双砷化合物底物泵调至1000次注射/s，10 V激活微量注射。收集2 h后，取下管子，两端密封，停止泵，底物负载微滴于4°C离线孵育3 h。
高产Omp7蛋白的Cg-pXMJ-omp7-TC菌株分选：使用直通道芯片……
【数据】微滴直径：65 µm；油相：500 µL；水相：2 mL（OD = 0.05）；泵速：400滴/s（油）、450滴/s（菌液）；收集：1 h；孵育：30°C、12 h；四端口芯片油相：800 µL分选油；注射速度：1000次/s；电压：10 V；收集：2 h；孵育：4°C、3 h
研究结果
3.1 基于FlAsH-TC的分泌Omp7监测系统建立
FlAsH-TC检测法依赖于FlAsH-EDT₂试剂与TC标签的高亲和力结合。在本研究优化的标记条件下（低微摩尔试剂浓度、含还原剂、受控孵育时间），该反应对TC标签具有高度特异性，不会产生来自内源蛋白的可检测背景荧光，此前已在真核和细菌系统中得到验证（Haitjema等，2014；Yu等，2023）。FlAsH-TC监测的可靠性通过将FlAsH-TC反应的荧光读数与发酵上清的SDS-PAGE结果进行比较来验证，如图1(a)和(b)所示。图1(c)的结果表明，在发酵20 h之前，Omp7蛋白表达水平和相应的FlAsH-TC荧光强度均随诱导时间延长而增加。FlAsH-TC荧光值与蛋白强度之间的相关性分析显示强正相关关系，如图1(d)所示。拟合曲线验证了两种检测方法的整体一致性和可靠性。值得注意的是，FlAsH-TC荧光系统适用于同一培养时间点不同菌株分泌能力的相对定量比较，这正是本研究的核心筛选场景。该发现证实了FlAsH-EDT₂在监测菌株分泌蛋白表达水平方面的有效性，为进一步开发和优化高通量筛选平台奠定了基础。
【数据】发酵时间：20 h前荧光随诱导时间增加；相关性：FlAsH-TC荧光值与蛋白强度呈强正相关；检测条件：低微摩尔试剂浓度+还原剂+受控孵育时间
3.2 通过迭代ARTP诱变和FADS筛选分离高产突变株
ARTP诱变的最佳时长如图2(a)所示。当照射时间为90 s、120 s、150 s和180 s时，菌株致死率分别达到约79%、84.1%、85.7%和95.5%。从平板挑选的菌落在48孔板中培养，测定荧光以确定正突变率。120 s的ARTP诱变处理获得最高正突变率49%。因此，确定谷氨酸棒杆菌的最佳诱变参数为功率100 W、气流量10 SLM、照射时间120 s。高通量筛选方法能够快速高效地鉴定重组蛋白产量显著增加的突变菌株。以荧光强度为筛选信号，采用FADS技术对ARTP诱变菌株进行高通量筛选（图S2）。ARTP诱变后，FADS筛选的菌液涂布于LBHIS培养基。为选择下一轮诱变的候选菌株，将单菌落转移至48孔板。经酶标仪荧光测定后，表现最佳的突变株被选为新的亲本菌株。共进行四轮ARTP诱变和FADS筛选，获得四株Omp7蛋白高分泌突变株，命名为CT1-109、CT2-9、CT3-28和CT4-42。对WT和突变株进行Omp7蛋白分泌表达验证和FlAsH-TC反应荧光测定，如图2(c)所示。连续三轮ARTP诱变后荧光值逐步增加，其中CT3-28菌株在三轮后呈现最高荧光。然而，第四轮诱变后荧光强度显著下降，表明突变已达到饱和（图2(b)）。三轮诱变中荧光的逐步增加证明了迭代筛选策略的有效性，而第四轮后的下降表明突变饱和——这是该方法未来应用的关键见解。
【数据】ARTP致死率：90 s约79%、120 s约84.1%、150 s约85.7%、180 s约95.5%；正突变率：120 s时最高49%；最佳参数：功率100 W、气流量10 SLM、时间120 s；诱变轮次：4轮；获得菌株：CT1-109、CT2-9、CT3-28、CT4-42；第四轮后荧光显著下降（突变饱和）
3.3 突变株的表型特征：生长、稳定性及增强分泌的基因组基础
为研究ARTP突变是否影响菌株生长，对对照WT菌株和四株突变株的OD₆₀₀值和荧光水平进行了测定和分析。如图3(a)和(b)所示，突变株表现出不同的最大生长密度，且生长速率普遍高于WT菌株。这表明ARTP诱变可以增强菌株的生长速率。然而，突变株的生长趋势与WT菌株大致相当。到达稳定期后，突变株的生物量没有出现突然增加或减少，表明生长稳定性良好。考虑到遗传稳定性在工业应用中的关键重要性，且CT3-28突变株表现出最快的生长速率和最高的单位时间荧光值，进行了连续传代培养以验证其遗传稳定性。连续传代十次后（图3(c)），CT3-28突变株的荧光强度保持接近初始值，表明该菌株中Omp7蛋白的表达水平基本保持不变。这证明了突变株的遗传稳定性。因此，经ARTP诱变处理的菌株不仅保留了原有的生长特性，还表现出重组蛋白表达的显著增加，证明了ARTP技术作为菌株改良方法的有效性。
从CT3-28菌株中提取突变质粒pCT3-TC，以研究其高荧光表型是质粒携带还是染色体编码。通过电转化，将pCT3-TC质粒和pXMJ19-TC分别导入WT菌株，获得WT-pCT3-TC和WT-pXMJ19-TC菌株。通过比较两株菌的荧光值，确定增强的荧光是否源于质粒突变。如图3(d)所示，WT-pCT3-TC菌株与WT-pXMJ19-TC菌株的荧光值相似。因此推断突变株中增强的荧光并非由质粒突变引起。经过17轮连续传代，获得CT3-28的质粒消除衍生株，命名为CT3。随后将pXMJ19-TC质粒电转入CT3，生成CT3-pXMJ19-TC菌株。将该重组菌株的荧光强度与WT-pXMJ19-TC对照进行比较。结果显示，CT3-pXMJ19-TC的荧光比WT-pXMJ19-TC高51.6%，与原始突变株CT3-28相当。这一发现表明突变株中增强的荧光源于基因组突变。因此，CT3菌株具有遗传稳定性和增强的重组蛋白分泌能力。
为验证突变株对不同蛋白表达和分泌能力的影响，将编码四种不同蛋白（VHH、PINP、Rhv3、ApxII）的质粒导入CT3。将这些突变株与携带相同四种质粒的野生型重组菌株进行比较，以评估突变株对各种重组蛋白分泌和表达影响的普遍性。24 h摇瓶发酵后，收集上清制备蛋白样品。SDS-PAGE结果如图3(e)所示。为定量评估蛋白分泌的增强效果，使用ImageJ软件对SDS-PAGE条带进行光密度分析。CT3菌株中VHH、PINP、Rhv3和ApxII的条带强度较WT菌株分别增加了136.2%、30%、41.3%和110%。结果表明，四种重组蛋白均成功在CT3中分泌表达。此外，突变株对多种重组蛋白的分泌表达均表现出增强效果。
【数据】传代次数：10次（荧光保持稳定）；质粒消除传代：17轮；CT3-pXMJ19-TC荧光比WT-pXMJ19-TC高51.6%；蛋白条带增强：VHH +136.2%、PINP +30%、Rhv3 +41.3%、ApxII +110%（CT3 vs WT）；发酵时间：24 h
3.4 5 L发酵罐规模下WT与CT3-28菌株Omp7表达分析
（此部分对应原文3.4节内容）
【数据】发酵规模：5 L发酵罐；补料分批模式；Omp7产量：约211.3 mg·L⁻¹；较WT提高82.6%
3.5 SNP位点功能分析
对谷氨酸棒杆菌CGMCC1.15647及诱变菌株CT1、CT2、CT3进行基因组重测序，共鉴定出91个单核苷酸多态性（SNP）位点，其中最优菌株CT3包含四个相关基因。
【数据】SNP总数：91个；CT3相关基因：4个
3.6 SNP基因过表达或敲除对菌株的影响
对SNP基因进行过表达或敲除实验，分析其对菌株的影响。生长曲线和单位面积荧光强度测定结果显示，RS02840基因的过表达和RS02495基因的敲除对重组蛋白的分泌表达具有显著影响。
【数据】RS02840：过表达显著影响分泌表达；RS02495：敲除显著影响分泌表达
讨论与解读
本研究通过四轮ARTP诱变和FADS筛选，获得了一株表达Omp7蛋白的谷氨酸棒杆菌高产突变株CT3-28，在5 L补料分批发酵中Omp7蛋白表达量较野生型提高了82.6%。连续传代培养证明ARTP诱变菌株具有优异的生长和遗传稳定性，且ARTP诱变还增强了谷氨酸棒杆菌的生长性能。此外，突变株对多种重组蛋白（VHH、PINP、Rhv3、ApxII）均表现出普遍的高效分泌能力，为亚单位疫苗抗原生产建立了高效的底盘菌株。值得注意的是，所测试的四种蛋白来源和功能各异，但仅代表有限范围的重组蛋白类型。因此，需要更多种类的蛋白（包括膜蛋白、高分子量酶、具有复杂二硫键或不同折叠/信号肽特征的蛋白）进一步验证CT3菌株的普遍适用性。全基因组测序和生物信息学分析鉴定了与高效重组蛋白分泌相关的关键SNP，RS02840的过表达和RS02495的敲除与蛋白分泌增强相关，为未来谷氨酸棒杆菌底盘细胞工程提供了潜在的遗传靶点。
编译者解读：本研究巧妙地将ARTP非理性诱变与FADS超高通量筛选相结合，以FlAsH-TC荧光系统作为分泌检测桥梁，打通了"诱变-筛选-验证"的完整技术链条。RS02840和RS02495的鉴定为理性改造底盘细胞提供了直接靶点。然而，突变饱和现象提示该策略的增益上限可能有限，未来或可探索与其他诱变方式联用。5 L发酵罐的验证规模也表明该技术已具备中试转化潜力。
参考来源
Liu X. Construction of Corynebacterium glutamicum for efficient secretion and production of recombinant proteins using the technology of ARTP mutagenesis and fluorescen activated droplet microfluidic screening. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134538
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134538