来源：Evaluating the toxicity of methanol, formaldehyde and formate on the growth fitness of Yarrowia lipolytica（Results in Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是合成生物学中重要的非模式酵母底盘，天然具备利用多种疏水性底物的能力。将甲醇、甲醛和甲酸盐等液态C1原料——这些可由温室气体CO₂和CH₄直接制造的化合物——与该酵母的代谢网络对接，有望大幅降低生物制造原料成本。本研究利用高通量生长分析仪系统测定了解脂耶氏酵母对三种C1底物的耐受阈值，发现其对甲醇（IC50 871 mM）和甲酸盐（IC50 42.6 mM）具有显著耐受性，但对甲醛高度敏感（IC50 3.8 mM）。更值得关注的是，葡萄糖与甲酸盐共底物策略可同时提升细胞生长与脂质产量，为C1原料在油脂酵母中的实际应用提供了量化依据。
研究背景
代谢工程通过定向改造细胞代谢来合成高值产品，常用的工业底盘酵母和细菌依赖葡萄糖、果糖、戊糖等可发酵糖类作为主要底物，这天然推高了生产成本。C1底物——甲醇、甲醛和甲酸盐——因可通过水煤气变换反应结合CO₂电化学还原等简单高效的工业过程从温室气体合成，近年来受到代谢工程领域的广泛关注。甲烷和CO₂也可通过选择性氧化转化为这些C1化合物。
解脂耶氏酵母分离自海洋生态系统，是一种能够同化醇类、脂质、烃类和挥发性脂肪酸等多种疏水性化合物的非模式酵母。该酵母已被广泛工程改造为生产脂质、白藜芦醇、类胡萝卜素、角鲨烯等天然产物的基准底盘。将C1底物途径与这些重要代谢产物的合成相连接，有望进一步降低成本并提升可持续性。然而，C1底物对解脂耶氏酵母的毒性效应尚未被系统量化，这构成了本研究要回答的核心问题。
研究方法
2.1 酵母菌株与培养基
选用Po1g菌株作为后续C1底物测试和脂质生产的基础菌株。将NotI线性化的pYLXP'和pYLXP'-ACC1-DGA1[16]质粒整合至解脂耶氏酵母的PBR322对接平台[13]，构建了不含亮氨酸营养缺陷标记的对照菌株Po1g-pYLXP'和脂质生产菌株Po1g-ACC1-DGA1。
酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基作为酵母菌株的基础培养基，其组成为：酵母提取物（10 g/L；OXOID）、蛋白胨（20 g/L；生工生物）和葡萄糖（20 g/L；阿拉丁）。质粒pYLXP'-ACC1-DGA1[16]为先前构建，保存于−80 °C冰箱中，保存液含50%甘油和50% YPD培养基。
在生物安全柜中，将3 ml预先配制的YPD溶液转移至10 ml塑料管中；用无菌接种环刮取少量冷冻酵母混合物并转移至管中。随后将试管置于30 °C、250 rpm的振荡培养箱中培养48小时。含有活酵母细胞的该生长培养基随后用作接种物。
【数据】培养基：YPD（酵母提取物10 g/L + 蛋白胨20 g/L + 葡萄糖20 g/L）；温度：30°C；转速：250 rpm；时间：48h；保存条件：−80°C（50%甘油+50% YPD）
2.2 自动生长分析仪与OD测量
在接种Po1g-pYLXP'之前，将甲醇（24.47 M、5 M、1 M；CAS 67–56–1）、甲酸盐（25.97 M、0.1 M、0.05 M；CAS 64–18–16）、甲醛（14.16 M、0.05 M；CAS 50–00–0）的标准溶液用无菌水稀释。
培养2天后，接种物的OD600在2.4至3.3之间（Thermo Scientific Genesys 150）。使用预热至30 °C的YPD培养基进一步稀释接种物，使48深孔板每个孔位的最终OD600约为0.1。孔板中预加有液态C1底物（甲醇、甲酸盐、甲醛），浓度梯度设置如下：甲醇（0、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512、768、1024、2048、4096 mM）、甲醛（0、0.5、1、2、4、8 mM）、甲酸盐（0、1、2、4、8、16、32、64 mM）。浓度梯度的选择通过数轮预实验确定。每孔最终体积为1 mL。
随后将孔板置于带自动生长记录功能的振荡培养箱（30 °C；800 rpm）中（MicroScreen高通量微生物生长曲线分析系统，格瑞仪器制造（天津）有限公司，中国），每10分钟监测各孔的OD600。每种浓度的C1底物设置三份重复，以最小化随机变异和单点异常。培养96–120小时后，所有OD600数据点汇总至原始数据表用于动力学分析。
【数据】接种OD600：0.1（终值）；培养温度：30°C；转速：800 rpm；检测间隔：10 min；培养时长：96–120h；甲醇浓度梯度：0–4096 mM（16个梯度）；甲醛浓度梯度：0–8 mM（6个梯度）；甲酸盐浓度梯度：0–64 mM（8个梯度）；每孔体积：1 mL；重复数：3
2.3 酵母生长的S形拟合曲线
获取数据点后，首先使用Excel软件（https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel）计算各浓度C1底物的期望值和标准误差。随后将预处理后的数据导入OriginPro软件（https://www.originlab.com）。为将OD建模为时间的函数，选用非线性四参数剂量-响应生长曲线，表达式如下：
(1) OD(t) = ODi + (ODf − ODi) / [1 + 10^((tip − t) × μOD)]
其中OD指OD600值，t为时间。ODi和ODf分别为拟合曲线的下渐近线和上渐近线，对应初始和最终OD值。μOD是与OD值相关的最大比生长速率μmax，tip为拟合曲线拐点处的时间。
实际操作中，每个样品的初始OD测量值在0.22至0.32之间，有一个离群值高于0.3，主要集中于0.23至0.25之间。该变异主要源于各孔接种与仪器光学测量读数延迟之间的时间差，以及人工操作的影响，可能导致初始测量值出现20至30分钟（从OD值0.1起算）的偏差。
【数据】拟合模型：四参数剂量-响应生长曲线；初始OD范围：0.22–0.32（主要集中于0.23–0.25）；时间偏差：20–30 min
2.4 最大比生长速率的测定
酵母的最大比生物量积累速率（μmax；时间倒数1/h）可反映特定生物在固定条件下的生长适应性。比生长速率（μ）定义为：
(2) μ = (1/X)(dX/dt)
其中X为生物量浓度（g/L）。根据Monod方程：
(3) μ = (1/X)(dX/dt) = μmax × S / (Ks + S)
其中S为限制性底物浓度（g/L），Ks为半饱和常数。产量系数（YX/S）定义为：
(4) YX/S = −(dX/dt)/(dS/dt) = −ΔX/ΔS = −(X − X0)/(S − S0)
将其转换得到S关于X和YX/S的函数：
(5) S − S0 = −(X − X0)/YX/S → S = S0 − (X − X0)/YX/S
Monod方程可修正为：
(6) (1/X)(dX/dt) = μmax × S/(Ks + S) = μmax(S0 − (X − X0)/YX/S) / [Ks + (S0 − (X − X0)/YX/S)]
生物量积累速率（g/L/h）的最终形式为[27]：
(7) dX/dt = μmax × XS/(Ks + S) = μmax X(S0 − (X − X0)/YX/S) / [Ks + (S0 − (X − X0)/YX/S)]
其中S0和X0分别为初始底物浓度和初始生物量浓度。dX/dt可近似为ΔX/Δt，其中Δt为两次测量之间的固定时间间隔（10分钟）。
光密度OD600可视为生物量浓度的有效参数。一般而言，OD与生物量之间呈线性关系：X = λ × OD，其中X为生物量浓度（mg/L），OD为无量纲的OD600值。λ为生物量与OD值之间的转换因子，通常范围为每OD单位0.3 g/L至0.5 g/L。本研究中选择OD不会影响C1底物的耐受性分析，因为两个变量之间呈线性关系。因此，选取任意转换因子λ = 0.3。
至于初始生物量浓度X0，尽管每个样品的首次OD测量值在0.22至0.32之间，考虑到接种与首次测量之间的时间差，估算接种后培养物的OD应在0.15至0.2范围内（对应0.045 g/L至0.06 g/L）。因此，合理选取X0 = 0.05 g/L。
将生物量浓度换算为g/L后，样本数据进一步在Matlab（http://www.mathworks.com/downloads/）中处理，通过将OD∼时间原始数据反向拟合至上述Monod模型，使用非线性最小二乘回归数值求解三个参数（μmax、Ks和YX/S）。
【数据】OD-生物量转换因子λ：0.3 g/L/OD；初始生物量X0：0.05 g/L；初始OD估算范围：0.15–0.2；时间间隔Δt：10 min；拟合方法：非线性最小二乘回归（Matlab）
2.5 相对生长适应性（μmax百分比）、半时间（t50）和延迟时间（t20）建模
时间t50表示酵母培养物达到最大细胞密度一半所需的时间。针对每种底物，将t50对C1抑制剂浓度作图并建模以找到最佳拟合曲线。使用的模型[28]为：
(8) t50(C) = τ0 × e^(Tc × C)
其中τ0为无任何C1抑制剂时达到最大细胞密度一半所需的时间。参数Tc衡量相应C1底物的毒性水平。
相同的拟合模型也用于展示延迟时间t20与浓度之间的关系，其中t20表示达到最大细胞密度20%所需的时间。
μmax代表在特定C1抑制剂浓度下的最大比生长速率，与无抑制时相比。为绘制μmax百分比对浓度的曲线，使用S形剂量-响应模型[29]来展示最大比生长速率与抑制剂浓度之间的关系：
(9) μmax = μ′ + (μ0 − μ′) × Cⁿ / (kⁿ + Cⁿ)
在该剂量-响应曲线中，μ′为高浓度抑制剂下的最大比生长速率，μ0为无任何抑制剂时的基础最大比生长速率，k代表半抑制浓度（IC50），n为Hill系数。
图1 不同浓度甲醇下解脂耶氏酵母的生长曲线
图2 不同浓度甲醛下解脂耶氏酵母的生长曲线
图3 不同浓度甲酸盐下解脂耶氏酵母的生长曲线
图4 解脂耶氏酵母在不同浓度C1底物下的相对生长适应性剂量响应
图5 三种C1抑制剂（甲醇A、甲醛B、甲酸盐C）的毒性与延迟期时长的指数相关性
【数据】t50模型：t50(C) = τ0·e^(Tc·C)；t20定义：达到最大细胞密度20%的时间；剂量-响应模型：μmax = μ′ + (μ0 − μ′)·Cⁿ/(kⁿ + Cⁿ)；IC50定义：k（半抑制浓度）；Hill系数：n
研究结果
3.1 解脂耶氏酵母对C1底物的适应性实验室进化失败
出于探索目的，本研究首先尝试将解脂耶氏酵母Po1f菌株逐步驯化，使其适应并在甲醇、甲醛和甲酸盐培养基中生长。Po1f菌株分离自含有4.0 g/L YNB-AA+AS、1 g/L酵母提取物和10 g/L葡萄糖的培养物，培养48小时后获得。
随后进行了适应性实验室进化（ALE）过程：每48小时将菌株转移至连续升高的甲醇和甲酸盐浓度（以及降低的葡萄糖浓度）的培养基中。值得注意的是，除最初几轮添加葡萄糖以确保收获浓密且存活的菌株外，在后续适应步骤中，仅使用甲醇、甲醛和甲酸钠作为Po1f菌株生长的唯一碳源。
每次转移前测量光密度（OD）以监测菌株生长。然而，平均而言，甲醇和甲酸盐经过数轮、甲醛经过第一轮后，细胞停止生长，实验以失败告终：观察到当甲醇、甲醛或甲酸钠作为主要碳源时，细胞经历了显著延长的延迟期而不生长。
事后分析推测，解脂耶氏酵母每次转移后延迟时间延长可能归因于所测试C1碳源的毒性。延迟期是酵母或细菌细胞适应新环境的复杂准备阶段[31]。影响该阶段时长的因素包括营养可利用性、环境毒性和接种菌株的历史。延迟期对酵母细胞至关重要，因为细胞在启动细胞分裂之前需要调整其转录组和蛋白质组。根据文献[32]，由于环境挑战，细胞数量甚至可能在初期减少。
在之前的试验中，推测48小时的延迟时间不足以让酵母细胞恢复和增殖。因此，建立了新的研究方向：研究C1底物的毒性以及解脂耶氏酵母在葡萄糖与各种C1底物共培养接种时的延迟期，这将帮助确定不同量的C1底物（甲醇、甲酸盐和甲醛）如何影响解脂耶氏酵母的延迟时间和生长适应性。
【数据】ALE培养基初始组成：4.0 g/L YNB-AA+AS + 1 g/L酵母提取物 + 10 g/L葡萄糖；转移间隔：48h；结果：甲醇/甲酸盐数轮后、甲醛1轮后细胞停止生长
3.2 以甲醇为辅底物时解脂耶氏酵母的生长适应性
以甲醇为辅底物的生长曲线分析突显了解脂耶氏酵母对甲醇的显著耐受性。在512 mM（约16.4 g/L）浓度下，解脂耶氏酵母的增殖不受影响，未显示明显抑制作用。然而，随着甲醇浓度的增加，抑制作用变得明显，主要表现为延迟期延长。
重复实验确认，解脂耶氏酵母即使在最高2048 mM（65.6 g/L）浓度下仍能增殖，约80小时后出现显著生长。图1清楚地显示，超过768 mM（约24.6 g/L）后数据点的变异性变得更加明显。这种变异表明，不同的酵母群体在进入增殖阶段前适应甲醇诱导的应激时，可能表现出不同的延迟期[11]。一般而言，环境毒性越大，酵母菌株调整其细胞机制（如转录组和蛋白质组）所需的时间越长，如图中生长轨迹所示。
有趣的是，甲醇对解脂耶氏酵母的毒性似乎比先前认为的要低。该菌株在低于768 mM（24.6 g/L）的甲醇浓度下表现出稳健生长。对甲醇的耐受性可能归因于该酵母的产油特性，这可能有助于其在甲醇存在下维持膜完整性[33]。这一发现表明，解脂耶氏酵母可能具有高效的解毒机制，能够减轻甲醇的毒性效应并维持正常的细胞呼吸，在低于15 g/L的浓度下影响可忽略不计。
【数据】甲醇无抑制浓度：512 mM（约16.4 g/L）；甲醇最大生长浓度：2048 mM（65.6 g/L）；生长出现时间：约80h；数据变异性增加阈值：768 mM（约24.6 g/L）；无显著影响浓度：<15 g/L
3.3 以甲醛为辅底物时解脂耶氏酵母的生长适应性
与甲醇形成鲜明对比的是，甲醛对解脂耶氏酵母的增殖表现出强烈的抑制作用，如图2所示。该酵母菌株对甲醛的耐受性显著较低，在低至0.5 mM的浓度下即出现生长抑制。酵母能够维持一定程度生长的最大浓度为4 mM（约0.12 g/L），超过该浓度生长受到严重抑制，甚至完全停止——在8 mM浓度下，80小时内未观察到显著生长。
这一结果表明，解脂耶氏酵母高效利用甲醛/甲醇的瓶颈在于缺乏强效的甲醛汇途径（例如甲醛脱氢酶或木酮糖单磷酸途径XuMP途径）[11]。
与甲醇耐受性的鲜明对比可归因于甲醛的高反应活性。作为一种强亲电试剂，甲醛容易与细胞大分子（如蛋白质、核酸和脂质）中的亲核位点反应[34]。这种反应性破坏了必需的细胞过程，包括DNA复制、转录和蛋白质功能，导致细胞应激并最终抑制生长。甲醛在大分子内部及之间形成交联的能力加剧了毒性效应，进一步阻碍细胞功能和活力[35]。
此外，如图2所示，低浓度甲醛下的延迟生长表明解脂耶氏酵母试图通过各种应激响应机制适应甲醛的存在，尽管在更高浓度下成效有限。例如，当培养基中添加低浓度甲醛（低于4 mM）时，减少的（并非完全停止的）生长可能源于解脂耶氏酵母内在的抗氧化防御机制；然而，超过阈值后该机制失效，酵母无法维持其生长适应性。
在高于4 mM浓度下无法增殖，凸显了甲醛细胞毒性的严重性，即使在低浓度下也可能造成实质性细胞损伤。这使得甲醛成为解脂耶氏酵母特别具有挑战性的底物，并提示任何利用或耐受甲醛的代谢工程努力都需要对该酵母的天然解毒途径进行重大改造。
【数据】甲醛最低抑制浓度：0.5 mM；最大生长浓度：4 mM（约0.12 g/L）；完全抑制浓度：8 mM（80h无生长）；抗氧化防御失效阈值：4 mM
3.4 以甲酸盐为辅底物时解脂耶氏酵母的生长适应性
使用解脂耶氏酵母同步进行的甲酸盐耐受性测试产生了值得注意的结果[24]，证明解脂耶氏酵母可耐受高达32 mM（约1.5 g/L）的甲酸盐且抑制作用极小。这种耐受性表明解脂耶氏酵母具有稳健的适应机制，可能与内源甲酸脱氢酶的活性有关[36]，该酶催化甲酸盐氧化为二氧化碳，从而减轻甲酸盐的毒性效应。
然而，当甲酸盐浓度升至32 mM以上时，酵母的生长急剧下降。在48 mM时，生长受到严重抑制；在64 mM时，酵母菌株完全停止生长，如图3所示。对甲酸盐的耐受性可能归因于解脂耶氏酵母中的六个内源甲酸脱氢酶[37]，它们可将甲酸盐氧化脱羧生成CO₂和NADH。
从正常生长到完全抑制的这种突然转变可能表明存在一个临界阈值，超过该阈值酵母的解毒能力被饱和或压倒。甲酸盐在低浓度下的耐受性与高浓度下的完全抑制之间的鲜明对比，为解脂耶氏酵母中甲酸盐代谢的饱和动力学提供了证据，并强调了在利用甲酸盐作为底物时需要仔细优化浓度。
图6 葡萄糖与甲酸盐共底物条件下解脂耶氏酵母的脂质产量。A：葡萄糖与0 mM甲酸盐共投喂；B：葡萄糖与20 mM甲酸盐共投喂；C：葡萄糖与50 mM甲酸盐共投喂
【数据】甲酸盐最大耐受浓度：32 mM（约1.5 g/L）；严重抑制浓度：48 mM；完全抑制浓度：64 mM；内源甲酸脱氢酶数量：6个
讨论与解读
本研究系统量化了解脂耶氏酵母对三种液态C1底物的生长适应性响应。通过高通量生长分析仪自动记录不同浓度C1底物下的酵母生长，将生长数据拟合至Monod模型获得比生长速率，这些速率进一步回归至剂量-响应曲线得到半抑制浓度（IC50）。同时建立了延迟期延长与C1底物毒性之间的指数相关性。此外，将甲酸盐与葡萄糖共投喂至工程脂质菌株后发现，共投喂策略显著改善了细胞生长和脂质产量。
解脂耶氏酵母作为代谢工程中的模式生物，在生物制造和环境修复领域展现出多面性。利用廉价且广泛可得的C1化合物作为维持细胞活性和积累细胞量的主要底物，可显著推进更可持续和环保的生产方式。该酵母已被广泛工程改造为生产脂质、白藜芦醇、类胡萝卜素、角鲨烯等天然产物的基准底盘，将C1底物途径与这些重要代谢产物的合成相连接，有望进一步降低成本并提升可持续性。
编译者解读：本研究最值得称道之处在于用定量毒理学方法为C1底物的菌株工程提供了"设计准则"——甲醇和甲酸盐的高耐受阈值为直接利用这些底物扫清了障碍，而甲醛的极低IC50则精准指出了必须引入甲醛脱氢酶或XuMP途径等强汇途径的改造方向。葡萄糖-甲酸盐共投喂显著提升脂质产量的结果尤其具有工业参考价值，它展示了一条不依赖菌株复杂改造即可利用C1底物的务实路径。局限在于研究仍停留在摇瓶尺度，且甲醛的毒性瓶颈尚未通过工程手段突破——这恰恰为后续工作留下了明确的靶点。
参考来源
Kuang W. Evaluating the toxicity of methanol, formaldehyde and formate on the growth fitness of Yarrowia lipolytica. Results in Engineering, 2025. DOI: 10.1016/j.rineng.2025.105016
DOI: 10.1016/j.rineng.2025.105016