解脂耶氏酵母细胞质-过氧化物酶体双区室工程与脂质代谢

📅 2026-08-24 📰 Bioresource Technology 2024-03-31 📂 研究进展 👁 16

来源：Efficient synthesis of squalene by cytoplasmic-peroxisomal engineering and regulating lipid metabolism in Yarrowia lipolytica（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

📎 相关工具：蛋白可溶性优化分析

导读

角鲨烯是一种高价值无环三萜类化合物，广泛应用于食品和医药行业。本研究以解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为宿主，通过两轮关键酶基因多拷贝整合增强细胞质中角鲨烯合成通量，并利用区室化策略将甲羟戊酸（MVA）途径导入过氧化物酶体，同时强化β-氧化途径与辅因子供给。最终在5-L生物反应器中通过补料分批发酵实现角鲨烯产量51.2 g/L，为目前微生物发酵生产角鲨烯的最高报道水平。

研究背景

角鲨烯作为无环三萜化合物，在食品、医疗和化妆品行业应用广泛，可用作疫苗佐剂、营养补充剂、抗氧化剂和抗肿瘤剂。此外，角鲨烯还是麦角固醇、7-脱氢胆固醇等甾体化合物合成的前体。传统上角鲨烯主要从鲨鱼肝油、橄榄和苋菜中提取，但受动物保护法规和复杂提取纯化工艺的限制，植物源和动物源生产难以满足市场需求。据MarketsandMarkets预测，全球角鲨烯市场规模到2028年将增长至2.02亿美元。近年来，随着代谢模型和基因编辑工具的发展，构建微生物细胞工厂实现角鲨烯的持续、高效、安全生产成为研究热点。在真核生物中，角鲨烯由甲羟戊酸（MVA）途径合成，前体乙酰辅酶A经九步酶催化反应缩合产生五碳化合物，进而形成各类萜类化合物的基本碳链骨架。解脂耶氏酵母具有较大的乙酰辅酶A库和疏水空间，适合角鲨烯积累，但目前产量尚不足以支撑工业化生产。

研究方法

2.1 菌株与培养基

Y. lipolytica PO1f为起始宿主菌株。PO1f在YPD培养基中进行富集培养和小规模发酵。营养缺陷型菌株在添加0.47 g/L亮氨酸或尿嘧啶的YNB培养基中培养。Escherichia coli JM109用于质粒构建和扩增，大肠杆菌菌株在Luria-Bertani培养基中培养。培养基配方参照先前报道。

【数据】菌株：Y. lipolytica PO1f、E. coli JM109；培养基：YPD、YNB（添加0.47 g/L亮氨酸或尿嘧啶）、LB；原文未详述培养温度与时间

2.2 质粒与酵母菌株构建

所有外源基因的密码子优化和合成由上海生工完成。所有序列使用上海生工的高保真PCR酶进行扩增。质粒组装使用Gibson一步克隆酶（ABclonal，武汉，中国）。使用大肠杆菌感受态试剂盒（Takara，大阪，日本）制备大肠杆菌感受态细胞。多拷贝整合工具和酵母菌株构建方法参照先前报道。转化后的酵母在营养选择性培养基上划线，30°C培养3–4天进行菌落验证。本研究使用或构建的基因、质粒和菌株见补充材料。

【数据】温度：30°C；时间：3–4天；试剂：Gibson一步克隆酶（ABclonal）、高保真PCR酶（上海生工）、大肠杆菌感受态试剂盒（Takara）

2.3 工程酵母的培养

小规模发酵在24孔板中进行。首先，挑取平板培养基上生长良好的菌落，在YPD培养基中培养20 h制备种子液。随后，将200 μL种子液转移至含4 mL YPD的24孔板中，在220 rpm、30°C条件下发酵4天。补料分批发酵时，先挑取菌落接种于10 mL YPD中，220 rpm、30°C培养24 h，作为一级种子液。取4 mL一级种子液接种于200 mL YNB中培养24 h，作为二级种子液。补料分批发酵在5-L生物反应器中进行。将二级种子液加入2.5 L YPD培养基中，使初始OD₆₀₀为0.5。发酵过程中，添加12.5%（v/v）氨水控制pH为5.5。培养温度设为28°C。空气流量为3.0 vvm，通过搅拌级联（300至900 rpm）控制溶解氧在20%以上。初始D-葡萄糖浓度为40 g/L，初始葡萄糖耗尽后通过添加800 g/L D-葡萄糖维持葡萄糖水平低于1 g/L。

【数据】小规模发酵：24孔板，220 rpm，30°C，4天，种子液20 h，200 μL接种至4 mL YPD；一级种子：10 mL YPD，220 rpm，30°C，24 h；二级种子：4 mL接种至200 mL YNB，24 h；5-L反应器：2.5 L YPD，初始OD₆₀₀=0.5，pH 5.5（12.5%氨水），28°C，空气流量3.0 vvm，溶解氧>20%，搅拌300–900 rpm，初始葡萄糖40 g/L，补糖800 g/L，葡萄糖<1 g/L

2.4 角鲨烯含量测定及OD₆₀₀与细胞干重测量

检测发酵液中的角鲨烯时，取250 μL发酵液在12,000 g离心3 min，保留沉淀细胞。向裂解基质管中加入等量直径为0.5 mm的氧化锆珠和1.25 mL丙酮。在FastPrep 24™ 5G（MP Biomedicals，加利福尼亚，美国）中振荡裂解五个循环。裂解基质管以10,000 g离心5 min，取上层有机相过滤后进行HPLC分析。角鲨烯通过HPLC检测，使用C18色谱柱（Thermo Fisher Scientific，250 nm × 4.6 mm，5 μm），柱温40°C，流动相为含0.1%三氟乙酸的乙腈，流速1.6 mL/min，检测波长195 nm。OD₆₀₀使用分光光度计（Eppendorf，汉堡，德国）测量。细胞干重（DCW）测定时，取5 mL发酵样品，10,000 g离心5 min后弃去上层培养基，细胞在70°C烘箱中干燥3天至恒重。

【数据】离心：12,000 g，3 min；裂解：0.5 mm氧化锆珠，1.25 mL丙酮，FastPrep 24™ 5G，5个循环；离心：10,000 g，5 min；HPLC条件：C18柱（250 nm × 4.6 mm，5 μm），40°C，0.1%三氟乙酸乙腈，1.6 mL/min，195 nm；DCW：5 mL样品，10,000 g，5 min，70°C，3天

2.5 激光扫描共聚焦显微镜观察荧光蛋白与角鲨烯分布

为观察不同连接肽连接的过氧化物酶体信号肽的靶向能力，将表达mCherry和mCherry-linker-PTS1的Y. lipolytica在添加亮氨酸的YNB培养基中培养3天，用PBS缓冲液（上海生工）洗涤。为观察菌株中角鲨烯的分布，将YPD中培养4天的培养物用PBS缓冲液洗涤并重悬至OD₆₀₀=1。含1 μg/mL尼罗红的细胞悬液在室温避光孵育30 min。染色后，样品用PBS缓冲液洗涤两次并重悬。取5 μL样品置于载玻片上，用Nikon AX-SIM S激光扫描共聚焦显微镜在516 nm波长下观察。

【数据】培养：YNB（含亮氨酸），3天；染色：1 μg/mL尼罗红，室温避光30 min；观察：Nikon AX-SIM S，516 nm；OD₆₀₀=1

研究结果

3.1 细胞质中角鲨烯合成的强化

为提高角鲨烯合成效率，需要过表达关键限速酶。首先筛选角鲨烯生物合成途径中的关键限速酶。将参与代谢途径的九个基因分别整合到基因组中进行过表达。非限速酶的过表达导致角鲨烯产量降低（图2A）。过表达tHMG1、ERG12、IDI1、ERG20和ERG9使角鲨烯产量提高1.2–9.3倍（图2A）。将这些基因整合到ZETA多拷贝位点后获得菌株YS01，产角鲨烯905.8 mg/L（95.7 mg/g DCW）（图2B）。此外，为验证角鲨烯合成途径中前体的供应，将tHMG1、IDI1和ERG9再进行一轮整合获得菌株YS02，产角鲨烯1251.9 mg/L（123.5 mg/g DCW）。这些结果表明tHMG1、IDI1和ERG9是角鲨烯合成的关键限速酶。先前研究中，提高MVA途径关键基因拷贝数在构建产萜类化合物细胞工厂中已显示出良好效果，如α-法尼烯、齐墩果酸和原人参二醇。羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG1）可催化HMG-CoA还原为MVA。删除HMG1的N端跨膜结构域（tHMG1）被认为可提高酶的可溶性。过表达tHMG1正向调控大多数萜类化合物的生物合成。本研究中，单独过表达tHMG1使角鲨烯产量从5.6 mg/L提高至51.9 mg/L，证实tHMG1是角鲨烯生物合成的重要节点。此外，与先前研究一致，过表达IDI1和ERG9促进了角鲨烯的合成。结合多拷贝整合工具在Y. lipolytica中的应用，菌株的转化潜力大大提高。

▲ Schematic diagram of the construction of an engineered strain for efficient squalene production. FFA, free fatty acid; TAG, triacylglycerol; DAG, diacylglycerol; ERG10, acetyl-CoA thiolase; ERG13, HMG-CoA synthase; tHMG1, truncated 3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase; ERG12, mevalonate

▲ Overexpression of key genes for increasing metabolic flux of the MVA pathway. (A) Genes involved in the biosynthetic pathway were individually integrated into the genome to enhance the expression of the key rate-limiting enzymes for squalene synthesis. (B) Two rounds of multicopy integration of key

【数据】产量：YS01为905.8 mg/L（95.7 mg/g DCW）；YS02为1251.9 mg/L（123.5 mg/g DCW）；tHMG1过表达：5.6→51.9 mg/L；提高倍数：1.2–9.3倍

3.2 构建过氧化物酶体区室促进角鲨烯合成

过氧化物酶体中的疏水环境和代谢条件适合萜类化合物的合成（Dusseaux et al., 2020）。对于过氧化物酶体靶向信号1型（PTS1），SKL是典型结构，其靶向效率与其上游连接肽有关（Meinecke et al., 2010）。为筛选具有靶向效果的信号肽，将七种过氧化物酶体信号肽连接至mCherry的C端（图3A）。信号肽SRARAGSKL、IFVGIFSKL和GSGSKL与未连接信号肽的对照效果相同，mCherry未在细胞中聚集（见补充材料）。将mCherry的C端连接SKL、CRMVGKSKL、TYWIRFSKL或GGGSSKL后，明显观察到红色荧光在细胞中聚集，形成1至8个强荧光信号的"斑点"（见补充材料）。这些结果表明上述四种信号肽可将红色荧光蛋白靶向至过氧化物酶体。将参与角鲨烯合成的乙酰辅酶A下游九种酶分为三组，在信号肽作用下依次导入过氧化物酶体。同时，为验证不同信号肽对九种酶的靶向效率，每组酶使用四种不同信号肽。当生物合成途径部分导入过氧化物酶体时，角鲨烯产量略有增加（菌株YS03）。完整生物合成途径导入后，角鲨烯滴度显著提高。信号肽CRMVGKSKL介导的过氧化物酶体工程使角鲨烯积累量提高至1938.8 mg/L（190.6 mg/g DCW），比菌株YS02高63%（图3B）。这些数据证明过氧化物酶体区室化确实可为增强角鲨烯合成提供有利条件。不同PTS1过氧化物酶体靶向信号被导入受体Pex5p识别，这与蛋白在过氧化物酶体膜上的转运有关（Hagen et al., 2015）。先前研究表明，PTS1的上游序列可能影响Pex5p的识别效率（Meinecke et al., 2010）。通过在S. cerevisiae中引入过氧化物酶体信号肽SKL，已实现(R)-(+)-柠檬烯滴度2.58 g/L和香叶醇滴度5.52 g/L（Poorinmohammad & Kerkhoven, 2021）。Guo等人使用信号肽GGGSSKL在Y. lipolytica中最终实现了α-蛇麻烯的高效生产（Guo et al., 2021）。本研究中，信号肽CRMVGKSKL比经典过氧化物酶体信号肽SKL的角鲨烯滴度提高了12.3%。含碱性氨基酸的信号肽可能能实现多种蛋白更高效地导入过氧化物酶体（DeLoache et al., 2016）。

▲ Screening of peroxisomal signal peptides. (A) Schematic diagram of the experimental design. The signal peptide was ligated to the C-terminus of the red fluorescent protein mCherry to construct the plasmid pYLXP’2-mCherry, which was expressed in Y. lipolytica. (B) Peroxisomal engineering to enhance t

【数据】信号肽筛选：7种PTS1信号肽；CRMVGKSKL介导产量：1938.8 mg/L（190.6 mg/g DCW），比YS02高63%；CRMVGKSKL比SKL高12.3%；荧光斑点：1–8个

3.3 通过调控脂质代谢增加过氧化物酶体的乙酰辅酶A供应

作为典型的产油酵母，高产菌株中需要避免过量脂质合成消耗MVA途径的碳通量。在Y. lipolytica中，长链脂肪酸的降解需要转运蛋白PXA1/2、酰基辅酶A氧化酶POX1/2和3-酮脂酰辅酶A硫解酶POT1的协同催化，将(Cn)-酰基辅酶A缩短为(Cn−2)-酰基辅酶A并产生一分子乙酰辅酶A（图4A）。对POT1、PXA1/2和POX1/2进行了单独和组合过表达（图4B）。过表达POT1时，角鲨烯滴度达到2204.7 mg/L。菌株YS10中单独过表达POX1，角鲨烯产量增加约9%。单独过表达POX2、PXA1和PXA2未促进角鲨烯合成。共过表达POT1和POX1后，获得的菌株YS14产角鲨烯2308.0 mg/L（211.7 mg/g DCW）。这表明增强β-氧化可为过氧化物酶体中新建的角鲨烯生物合成途径提供直接前体供应。乙酰辅酶A在脂质和萜类合成中均发挥关键作用（Wang et al., 2022）。过量脂质生产会消耗本可用于MVA途径的碳。先前研究已采取工程策略，例如通过过表达MFE1和POX2增强脂质代谢，以及向培养基中添加浅蓝菌素限制脂肪酸合成（Jin et al., 2019; Marsafari & Xu, 2020; Zhang et al., 2017）。本研究中，敲除了三酰甘油合成的关键基因以限制脂质合成，但角鲨烯产量并未增加（图4B）。推测由于Y. lipolytica中脂质合成的复杂性和多样性，敲除DGA1严重影响脂质合成（Bao et al., 2021; Wang et al., 2020）。通过增强参与过氧化物酶体β-氧化的POT1和POX1的表达，角鲨烯产量增加了19%。因此，增强脂肪酸代谢以产生更多乙酰辅酶A是一种有效策略。

▲ Intensifying β-oxidation to accelerate squalene biosynthesis in peroxisomes. (A) Biochemical reactions and substance transport involved in the β-oxidation pathway in peroxisomes. (B) Enhanced lipid metabolism. Enhancing acetyl-CoA generation link in the β-oxidation process and energizing additional

【数据】POT1过表达：2204.7 mg/L；POX1单独过表达：增加约9%；POT1+POX1共过表达（YS14）：2308.0 mg/L（211.7 mg/g DCW）；β-氧化增强后产量增加19%；POX2、PXA1、PXA2单独过表达：无促进作用

3.4 优化Y. lipolytica中乙酰辅酶A、ATP和NADPH供应

ATP和NADPH是角鲨烯合成的重要辅因子。每合成一分子角鲨烯，需要消耗12分子NADPH和18分子ATP（Luo et al., 2020）。来自S. cerevisiae的异柠檬酸脱氢酶IDP2和IDP3可在细胞质和过氧化物酶体之间将NADP⁺转化为NADPH（图1）。然而，在菌株YS15至YS20中过表达与ATP和NADPH合成相关的基因并未增加角鲨烯产量（图5）。

▲ Enhancing acetyl-CoA, ATP, and NADPH synthesis in Y. lipolytica. YlACL1 and EcAAD were overexpressed to enhance cytosolic acetyl-CoA supply. ATP transport efficiency was improved by overexpressing ANT1. Overexpression of YlIDP2, ScIDP2, and ScIDP3 enhanced the NADPH conversion efficiency between the

【数据】ATP/NADPH消耗：每分子角鲨烯消耗12分子NADPH和18分子ATP；YS15–YS20过表达ATP/NADPH相关基因：角鲨烯产量未增加

3.5 5-L生物反应器中角鲨烯的补料分批发酵

在摇瓶水平实现角鲨烯高效合成后，进一步在5-L生物反应器中进行了补料分批发酵。在未添加抑制剂条件下，菌株YS14的角鲨烯产量达到18.0 g/L（图6A）。为将代谢通量从甾醇合成转向角鲨烯积累，在发酵40 h时添加1 g/L特比萘芬——一种角鲨烯环氧酶抑制剂。添加抑制剂后，角鲨烯产量进一步提升至51.2 g/L，葡萄糖得率为60.5 mg/g（图6B）。

▲ Squalene was produced in a 5-L fermenter. (A) Production of squalene without the addition of inhibitors. (B) Terbinafine (1 g/L) was added at 40 h in the fermentation process. Red arrows represent the time point at which glucose addition into the medium was started. Green arrows represent the time o

【数据】未加抑制剂：18.0 g/L；添加1 g/L特比萘芬（40 h）：51.2 g/L；葡萄糖得率：60.5 mg/g

讨论与解读

本研究在解脂耶氏酵母中通过多层面的代谢工程策略实现了角鲨烯的高效合成。首先在细胞质中通过两轮关键基因多拷贝整合，确定了tHMG1、IDI1和ERG9为角鲨烯合成的关键限速酶。随后利用过氧化物酶体区室化策略，将完整的MVA途径导入过氧化物酶体，使角鲨烯产量较细胞质工程菌株提高63%。通过强化β-氧化途径（POT1和POX1共过表达）为过氧化物酶体中的合成途径提供乙酰辅酶A前体，产量进一步提升。最终在5-L反应器中通过添加特比萘芬抑制甾醇分支途径，实现51.2 g/L的角鲨烯产量，为目前微生物发酵生产角鲨烯的最高报道水平。

编译者解读：该研究展现了典型的"区室化+多层级代谢调控"策略在萜类合成中的应用价值。将MVA途径导入过氧化物酶体利用了该细胞器的疏水环境和代谢隔离优势，而强化β-氧化则巧妙地将产油酵母的脂质代谢劣势转化为乙酰辅酶A供给优势。从合成生物学角度看，该方法为其他萜类化合物（如甾醇前体）的微生物合成提供了可借鉴的通用平台。值得注意的是，ATP/NADPH相关基因过表达未产生正向效果，提示辅因子工程在解脂耶氏酵母中可能受更复杂的调控网络制约，这一点值得后续深入研究。

参考来源

Yang Ning. Efficient synthesis of squalene by cytoplasmic-peroxisomal engineering and regulating lipid metabolism in Yarrowia lipolytica. Bioresource Technology, 2024. DOI: 10.1016/j.biortech.2024.130379

DOI: 10.1016/j.biortech.2024.130379

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