来源：Production of redox-active organic electrolyte candidates using the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica as a heterologous cell factory（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
真菌醌类聚酮化合物是水性有机氧化还原液流电池（AORFBs）的理想生物电解质候选物，但天然丝状真菌中难以高效规模化生产。本研究以解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为异源宿主，重构了来自Aspergillus hancockii的龙胆醇生物合成基因簇，通过正向工程策略——包括CYP450单加氧酶的直系同源替换与序列截断——实现了龙胆醇最高1.8 g/L、甲苯氢醌1.1 g/L的摇瓶产量。循环伏安法证实了异源产物的电化学氧化还原活性。该平台为真菌醌类化合物的规模化生产与AORFBs电解质系统评估铺平了道路。
研究背景
生物醌主要由真菌、细菌和开花植物作为次级代谢产物合成。醌部分作为一种芳香二酮体系，能够实现可逆的双电子氧化还原反应，从而保护细胞免受有害氧化剂和自由基的损伤。基于这些氧化还原特性，聚酮来源的真菌醌被认为是水性有机氧化还原液流电池（AORFBs）的理想电解质候选物。然而，在规模化生产中，利用天然丝状真菌宿主进行聚酮生物合成受到复杂调控、低产量以及深层培养中真菌形态等多重限制。异源生物合成是克服这些瓶颈的有效策略。非常规产油酵母解脂耶氏酵母作为异源宿主正受到越来越多的关注——其野生型菌株脂质储存能力可达干重的40%，工程菌株经脂质积累优化后可达90%。该酵母合成脂肪酸的能力伴随着天然丰富的乙酰-CoA和丙二酰-CoA前体库，而这些前体恰好也是真菌聚酮化合物的构建模块。
研究方法
2.1 质粒与菌株构建
来自Aspergillus hancockii的生物合成基因GQ1、GQ3–5和AhCPR通过antiSMASH（Blin et al., 2023）鉴定。BlastP分析使用来自Aspergillus clavatus的已知直系同源物完成（登录号见附表S1）。GQ3–5、AhCPR和PatH基因针对Y. lipolytica进行了密码子优化（所有密码子优化基因序列见补充信息），并由GenScript（GenScript Biotech, NJ, USA）合成。由GQ4编码的CYP450单加氧酶比PatH编码的酶多出20个额外氨基酸。因此，通过PCR生成了一个去除这20个氨基酸的截短版本GQ4，下文简称GQ4Δ20。用于质粒构建的所有寡核苷酸列于附表S2。
携带Y. lipolytica中AXP和XPR2位点（Addgene #84608, #84609（Schwartz et al., 2017; Schwartz and Wheeldon, 2018））上下游各1000 bp同源区的供体质粒被用作骨架，生成pAXP::GQ5和pXPR2:GQ3质粒。基因组整合由同源配对质粒pCRISPRyl_AXP和pCRISPRyl_XPR2（Addgene #84608, #84609）辅助完成。针对B3和F17位点（X. Liu et al., 2022）生成了新的供体与CRISPRyl质粒对。携带Cas9的质粒使用pCRISPRyl（Addgene #70007）和编码设计sgRNA的寡核苷酸（列于附表S3）组装，方法同Schwartz等人（2018）先前描述（Schwartz and Wheeldon, 2018）。pB3:AhCPR和pF17:GQ4供体质粒通过连续PCR和组装生成。首先，从Y. lipolytica基因组DNA扩增完整的B3和F17整合位点，分别插入pA08:hrGFP（Addgene #84615）供体质粒中，用同源区替换供体 cassette。随后，将TEFin-hrGFP-CYC1 cassette插入B3和F17位点的上下游各1000 bp HR区之间，再将hrGFP分别替换为合成的AhCPR和GQ4。以pF17:GQ4为模板，将GQ4替换为GQ4Δ20和PatH，获得pF17:GQ4Δ20和pF17:PatH。新构建的质粒使用Gibson组装试剂盒（New England BioLabs, Ipswich, MA, USA）生成。Escherichia coli NEB5α高效感受态细胞（New England BioLabs, Ipswich, MA, USA）用于质粒构建、扩增和保存。
野生型解脂耶氏酵母PO1f（ATCC #MYA-2613），即ylWT，此前已通过质粒pD17:FsPPT1和pA08:6MSAS工程化表达FsPPT1和6MSAS（GQ1），产生菌株ylFsPPT1_6MSAS（Bejenari et al., 2024）。该菌株作为本研究中后续转化的亲本菌株，并转化了pAXP::GQ5、pXPR2:GQ3、pB3:AhCPR和pF17:GQ4（或替代性地pF17:GQ4Δ20或pF17:PatH）。GQ途径的部分或完全异源重构产生了以下菌株：ylTQ、ylPatH、ylGQ4、ylGQ4Δ20。本研究生成的所有菌株及相应修饰位点概览见表1。菌株按照先前描述的方法（Bejenari et al., 2024）使用附表S4所列引物进行筛选和验证。所有克隆和筛选寡核苷酸购自Eurofins Genomics（Ebersberg, Germany）。
【数据】菌株：Y. lipolytica PO1f (ylWT)；质粒骨架：Addgene #84608, #84609, #70007, #84615；同源臂长度：1000 bp；宿主：E. coli NEB5α；基因合成：GenScript；引物来源：Eurofins Genomics
2.2 培养基与培养条件
Y. lipolytica在YPD培养基中培养（1% Bacto酵母提取物，2% Bacto蛋白胨，2%或10%葡萄糖，按指定条件）。转化子筛选使用合成限定（SD）培养基（0.67%不含氨基酸的酵母氮源碱，0.139%不含组氨酸、亮氨酸、色氨酸和尿嘧啶的酵母合成 dropout 培养基，补充组氨酸和色氨酸（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA），2%葡萄糖）。Y. lipolytica菌株使用含1 mg/mL 5-FOA（Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA）的YPD肉汤从URA3供体质粒中剔除。培养在平底摇瓶中进行，30°C，200 rpm，使用生物学三重复。对于种子培养，甘油储备液在YPD平板上划线，30°C培养24 h，然后单菌落接种到5 ml YPD培养基（2%葡萄糖）中，30°C、200 rpm培养24 h。随后，50 mL YPD（10%葡萄糖）培养基接种至起始OD为0.1，培养7天。
【数据】培养基：YPD（1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%或10%葡萄糖）；SD培养基：0.67% YNB，0.139% dropout，2%葡萄糖；5-FOA浓度：1 mg/mL；温度：30°C；转速：200 rpm；起始OD：0.1；培养时间：7天；培养体积：50 mL
2.3 聚酮产物、葡萄糖、柠檬酸和生物量的定量
生物合成途径的产物，即6-MSA、间甲酚、甲苯氢醌、3-羟基苄醇（3-HBA）和龙胆醇，通过直接分析每日样品的上清液进行定量。样品通过12,100 × g离心5 min制备，400 μL上清液与100 μL甲醇混合，使用Agilent Technologies 1260 Infinity II HPLC-DAD系统配备Phenyl-Hexyl色谱柱（Kinetex, 150 mm × 3 mm × 2.6 μm, 100 Å孔径, Phenomenex, Torrance, CA, USA）进行分析。通过90%（v/v）A（水）和10%（v/v）B（乙腈）的梯度洗脱12 min，两者均含0.1%乙酸。流速设为0.4 mL/min，进样体积8 μL，UV吸光度270 nm，柱温箱操作温度设为40°C。校准使用6-MSA（CAS: 567-61-3, Thermo Scientific Chemicals）、间甲酚（CAS: 108-39-4, VWR Chemicals）、甲苯氢醌（CAS: 95-71-6, Merck Life Science A/S）、3-羟基苄醇（CAS: 620-24-6, VWR Chemicals）和龙胆醇（CAS: 495-08-9, ABCR GmbH），溶于甲醇，浓度范围5–100 mg/L。所有次级代谢物的基线使用ylWT样品建立。葡萄糖和柠檬酸也在每日样品中通过HPLC-RID系统定量评估，详见我们先前的研究（Bejenari et al., 2024）。对于干细胞重量（DCW）测量，样品以12,100 × g离心5 min，用0.9% NaCl洗涤2次，70°C干燥24 h。
【数据】离心：12,100 × g，5 min；进样体积：8 μL；流速：0.4 mL/min；UV波长：270 nm；柱温：40°C；梯度：90% A/10% B至（含0.1%乙酸）；校准范围：5–100 mg/L；洗涤：0.9% NaCl×2；干燥：70°C，24 h
2.4 甲苯氢醌和龙胆醇的提取及制备型HPLC-MS
甲苯氢醌和龙胆醇从摇瓶发酵液中提取。样品以3500 × g离心10 min，上清液与乙酸乙酯按1:1比例混合。混合物剧烈振摇1 h，每10 min振摇一次。使用分液漏斗分离乙酸乙酯有机相，随后在旋转蒸发仪中60°C、100 rpm蒸发。蒸发后加入10 ml甲醇重悬化合物，转移至玻璃小瓶，50°C下氮气吹干，最终用1.5 ml甲醇重悬。分级分离在制备型HPLC系统（Waters HPLC pump 515; Waters Binary Gradient Module 2545; Waters System Fluidics Organizer）上进行，配备C8色谱柱（XBridge C8 5 μm Prep Column 19 × 250 mm 130 A, Waters Corporation），连接ESI单四极杆质谱分析器（Waters Acquity QDa）、UV/Vis检测器（Waters UV/Visible detector 2489）和馏分收集器（Waters Sample Manager 2767）。系统由MassLynx V4.2（Waters Corporation）控制。分级分离使用以下溶剂梯度：100%水（HiPerSolv CHROMANORM, CAS: 7732-18-5, VWR Chemicals）和0%乙腈（HiPerSolv CHROMANORM, CAS: 75-05-8, VWR Chemicals），两者均加入0.1%甲酸（HiPerSolv CHROMANORM, ≥99%, CAS:64-18-6, VWR Chemicals），保持1 min，随后乙腈比例在10 min内增加至40%，1 min内增至99%，并在99%保持4 min，总运行时间16 min。溶剂流速设为20 mL/min，每次进样前使用起始条件预运行2 min。对于甲苯氢醌的制备运行，收集器设置为时间触发模式，在单次注射700 μl提取物后收集8至8.5 min之间的馏分。对于龙胆醇……
【数据】离心：3500 × g，10 min；提取比：上清:乙酸乙酯=1:1；振摇：1 h（每10 min一次）；旋转蒸发：60°C，100 rpm；氮气吹干：50°C；最终重悬：1.5 ml甲醇；流速：20 mL/min；运行时间：16 min；进样量：700 μl；甲苯氢醌收集窗口：8–8.5 min
研究结果
3.1 与棒曲霉素基因簇的直系同源关系提示*Aspergillus hancockii*合成龙胆醌
为建立Aspergillus hancockii中龙胆醌的生物合成途径，我们基于其与Aspergillus clavatus中已充分表征的棒曲霉素基因簇的直系同源关系，分析了一个推定的基因簇（图1A）。我们鉴定了四个推定介导龙胆醌产生的基因：一个6-甲基水杨酸（6-MSA）合酶（GQ1；PatK直系同源物）、一个脱羧酶（GQ5；PatG直系同源物），以及两个细胞色素P450单加氧酶（CYP450s），命名为GQ4和GQ3（分别为PatH和PatI直系同源物）（Li et al., 2019）。基于先前表征的棒曲霉素途径，我们提出A. hancockii中的生物合成始于部分还原型I型聚酮合酶GQ1（6MSAS）将一个乙酰-CoA和三个丙二酰-CoA单元缩合生成6-MSA。随后，6-MSA经历脱羧反应，产生间甲酚（Snini et al., 2014）。两步羟基化反应导致龙胆醇的形成（Artigot et al., 2009），其可被完全氧化为龙胆醌（图1B）。同时，该途径可能通过一条平行路线进行，其中GQ3将间甲酚羟基化形成甲苯氢醌（Artigot et al., 2009），其可被氧化为甲苯醌。当四个基因与6-MSA激活辅酶FsPPT1异源共表达时，我们观察到途径停滞在间甲酚（数据未显示）。两种CYP450单加氧酶GQ3和GQ4是II类P450酶，基于其羟基化活性可能属于CYP64超家族（Črešnar and Petrič, 2011）。作为II类P450，它们通常需要细胞色素P450还原酶（CPR）介导从NADPH到CYP450血红素中心的双电子转移（McLean et al., 2015）。因此，我们共表达了AhCPR基因，该基因编码A. hancockii天然的CYP450氧化还原伴侣。AhCPR从NADPH向GQ4和GQ3提供两个电子，它们分别催化底物间甲酚和间羟基苄醇的氧化，每个反应释放一分子的水（图1C）。
【数据】推定基因数：4个（GQ1/6MSAS、GQ5/脱羧酶、GQ4/CYP450、GQ3/CYP450）；底物：乙酰-CoA+3×丙二酰-CoA；中间产物：6-MSA→间甲酚→龙胆醇/甲苯氢醌；电子供体：NADPH；伴体：AhCPR
3.2 *A. hancockii*基因簇在*Y. lipolytica*中的异源表达实现龙胆醇和甲苯氢醌生产
我们先前已证明利用Y. lipolytica作为真菌聚酮化合物异源宿主的可行性，成功生产了龙胆醌前体6-MSA（Bejenari et al., 2024）。在本研究中，我们通过将GQ1、GQ3、GQ4（或替代性GQ4Δ20或PatH）、GQ5、FsPPT1和AhCPR基因分别整合到A08、XPR2、F17、AXP、D17和B3位点，重构了完整途径。A08和D17是假基因（Schwartz et al., 2017），AXP和XPR2在Y. lipolytica Po1f菌株中功能失活，B3和F17被描述为基因间区域（X. Liu et al., 2022）。这些位点已被表征为中性整合位点，具有先前报道的高水平基因表达和整合效率（Schwartz et al., 2017; X. Liu et al., 2022）。GQ1、GQ3、GQ5和FsPPT1单顺反子cassette在杂合启动子UAS1B8-TEF(136)调控下组成型表达（Blazeck et al., 2011），而GQ4/GQ4Δ20/PatH和AhCPR单顺反子cassette在内含子增强型TEF启动子TEFin调控下组成型表达（Tai and Stephanopoulos, 2013）。除野生型菌株（ylWT）外，评估了四种工程菌株：ylTQ、ylGQ4、ylPatH和ylGQ4Δ20，它们仅在单一CYP450单加氧酶组分上有所不同。ylTQ缺乏GQ4，而其他三种表达不同版本的酶。
来自A. hancockii的GQ4表达（ylGQ4）未导致龙胆醇的可检测生产（图2A）。相反，观察到共代谢物甲苯氢醌的积累，培养第七天滴度为815 mg/L（图2B），产率为108.6 mg/g DCW（图S1B）。相比之下，ylTQ中甲苯氢醌的滴度达到1.1 g/L（图2B），产率为140.56 mg/g DCW（图S1B）。为评估GQ4的序列特异性特征是否导致活性丧失，我们将GQ4替换为直系同源单加氧酶PatH（ylPatH）。这使得龙胆醇在第七天以1.8 g/L的滴度生产（图2A），产率为202.3 mg/g DCW（图S1A），且甲苯氢醌仅少量积累为157 mg/L（图2B）。与PatH的序列比对显示，注释的GQ4编码序列包含一个额外的20个氨基酸片段，而该片段在PatH中不存在。在GQ4Δ20变体中移除了这20个氨基酸序列。GQ4的截断使龙胆醇生产成为可能，ylGQ4Δ20菌株产生1.4 g/L（图2A），但产率比ylPatH低29%，为156.82 mg/g DCW（图S1A）。ylGQ4Δ20中的甲苯氢醌水平高于ylPatH（367 mg/L，图2B），表明GQ4Δ20的效率低于PatH。所有菌株在培养最后一天均观察到低残留水平的6-MSA（图2C），这可能是因为6MSAS是生物合成途径中的限速酶（Wei et al., 2025）。整个培养期间未检测到间甲酚或3-羟基苄醇。葡萄糖消耗曲线（图2D）和生物量（图S1C）在所有菌株中相当。至于柠檬酸，ylWT在第七天产生高达两倍的水平，可能是由于工程菌株中代谢通量转向龙胆醇和甲苯氢醌生物合成所致（图S1D）。
【数据】ylGQ4甲苯氢醌：815 mg/L（第7天），108.6 mg/g DCW；ylTQ甲苯氢醌：1.1 g/L，140.56 mg/g DCW；ylPatH龙胆醇：1.8 g/L（第7天），202.3 mg/g DCW，甲苯氢醌157 mg/L；ylGQ4Δ20龙胆醇：1.4 g/L，156.82 mg/g DCW（比ylPatH低29%），甲苯氢醌367 mg/L；6-MSA：低残留；间甲酚/3-HBA：未检出
3.3 GQ4中注释来源的序列差异损害异源途径功能
在确定GQ4单加氧酶变体产生不同水平的龙胆醇和共代谢物甲苯氢醌后，我们研究了可能导致这种行为差异的序列和结构原因。与同源蛋白的比对表明，仅在A. hancockii CYP450单加氧酶中存在20个额外氨基酸（图S2A）。此外，与PatH直系同源物的比较提示，错误注释发生在内含子3的起始处，导致其被整合到外显子3中（图S2B）。为检查潜在的结构影响，生成了GQ4、PatH和GQ4Δ20的AlphaFold3模型（Abramson et al., 2024）（图3A–C），并使用计算机蛋白-蛋白对接模拟评估了它们与AhCPR的AlphaFold3模型的相互作用。额外的残基预计定位在CYP450的近端侧，靠近血红素活性位点（图3D）。对接模拟预测GQ4-AhCPR的结合能低于PatH-AhCPR对（图3E），表明CYP-CPR相互作用可能不受额外残基的影响。
【数据】额外氨基酸数：20个；定位：CYP450近端侧，近血红素活性位点；对接结合能：GQ4-AhCPR低于PatH-AhCPR；错误注释位置：内含子3起始处
3.4 电化学表征揭示异源生产生物醌的氧化还原活性
为探索异源生产真菌醌作为AORFBs电解质的潜力，通过制备型HPLC-MS从酵母培养提取物中纯化了甲苯氢醌和龙胆醇（甲苯氢醌纯度高于98%，龙胆醇纯度高于90%），并通过NMR进行结构验证（NMR谱图——图S3–S8）。作为一线筛选工具，循环伏安法用于研究化合物的电化学可行性，重点关注电子转移反应的电化学电位和可逆性。商业来源甲苯氢醌（图4A）和异源生产甲苯氢醌（图4B）在可比扫描速率10、100和500 mV s⁻¹下获得的伏安图几乎相同，表明两种化合物在含0.1 M KCl作为支持电解质的水溶液中的电化学行为一致。它们在100 mV s⁻¹扫描速率下相对于SHE的半波电位分别为0.56和0.59 V，进一步证实了结构相似性。在较低扫描速率（10–100 mV s⁻¹）下，负电位区出现一对次级还原和氧化峰……
【数据】甲苯氢醌纯度：>98%；龙胆醇纯度：>90%；半波电位：0.56 V（商业）和0.59 V vs. SHE（异源生产），扫描速率100 mV s⁻¹；支持电解质：0.1 M KCl；扫描速率：10、100、500 mV s⁻¹
讨论与解读
本研究选取真菌次级代谢产物甲苯醌和龙胆醌作为靶标化合物，在Y. lipolytica中进行异源生物合成，并评估其作为生物电解质候选物的氧化还原特性。基于与A. clavatus中已表征棒曲霉素基因簇的直系同源关系，鉴定了A. hancockii中的推定基因簇并提出了这两种产物的生物合成途径。在间甲酚节点，途径分支产生甲苯氢醌和龙胆醇。这种分支策略在真菌中常见，是使天然产物库多样化的手段（Wei et al., 2022）。有趣的是，间甲酚羟基化为甲苯氢醌以及间羟基苄醇羟基化为龙胆醇由同一酶GQ3介导。因此，甲苯氢醌不能进一步作为底物转化为龙胆醇，提示途径分支之间存在底物竞争。在Y. lipolytica中表达鉴定的推定基因簇表明，内源Y. lipolytica CPR与A. hancockii CYP450s之间存在不相容性。尽管Y. lipolytica据报道编码至少17种CYP450和一种CPR（Mauersberger, 2013），但在缺乏共表达CPR的情况下，途径停滞在羟基化前节点，即间甲酚。先前在Y. lipolytica和Saccharomyces cerevisiae中异源表达哺乳动物CYP450-CPR对的研究也报道内源CPR是限制因素，而共表达异源CPR则……
【编译者解读】
本研究展示了合成生物学中"宿主-途径-酶工程"三位一体的典型策略：选择产油酵母作为异源宿主解决前体供给问题，通过直系同源比对定位酶功能缺陷，再用序列截断和跨物种酶互补恢复催化活性。1.8 g/L的龙胆醇产量在真菌聚酮异源生产中颇具竞争力，但作者也坦承GQ4Δ20变体效率仍低于PatH——这提示序列注释错误导致的"隐性突变"可能广泛存在于基因组挖掘结果中。电化学验证环节将生物合成与材料性能直接挂钩，为"细胞工厂→储能材料"的跨学科转化提供了可复用的评估范式。局限在于目前仅在摇瓶水平验证，放大工艺与电解液长期循环稳定性仍有待探索。
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.05.007