拉曼光谱原位评估

📅 2026-08-24 📰 Bioresource Technology Reports 2026-06-30 📂 研究进展 👁 12

来源：In situ assessment of unsaturated fatty acids using Raman spectroscopy in Yarrowia lipolytica（Bioresource Technology Reports）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

脂肪酸不饱和度直接决定脂质的物理性质与工业应用价值，传统GC-MS分析需破坏细胞并经历繁琐的提取衍生化流程。本研究以三株解脂耶氏酵母（NCIM 3472、3589、3590）为模型，利用共聚焦拉曼光谱技术，仅凭三个特征谱带（1445、1650、3005 cm⁻¹）的强度比值，实现了活细胞内脂肪酸不饱和度的免标记、实时原位评估，并与GC-MS结果良好吻合。该方法为工业菌株筛选和生物过程在线监测提供了快速可靠的工具。

研究背景

脂质是支撑膜结构、参与细胞内通讯和能量储存的关键生物分子。脂肪酸作为脂质的结构基础，其化学组成直接影响整个脂质池的物理与生物学特性。根据碳链中双键数量，脂肪酸分为饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA），不饱和程度深刻影响脂质流动性和功能。微生物如真菌和微藻因高生长速率和将碳流导向脂质合成的能力，正被开发为高效的产脂工厂。

传统的脂质组学分析方法——GC-MS、薄层色谱和荧光光谱——均需先提取脂质或进行标记，这掩盖了细胞间的关键差异。拉曼光谱作为一种非破坏性振动光谱技术，能以化学键振动指纹信息直接探测活细胞内的分子组成。本研究采用拉曼光谱，以3005 cm⁻¹和1650 cm⁻¹相对于1445 cm⁻¹的强度比值，对三株解脂耶氏酵母进行不饱和度的原位评估，并以GC-MS验证其可靠性，同时探索拉曼成像在单细胞脂质定位中的应用。

研究方法

2.1 微生物菌株与培养条件

三株解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）NCIM 3472、NCIM 3589和NCIM 3590购自印度浦那国家工业微生物保藏中心（NCIM）。选择这些菌株的原因是它们此前已在改良富葡萄糖培养基中通过GC-MS测试过脂肪酸谱（Katre et al., 2012a）。根据先前报道的数据，NCIM 3472呈现含PUFA的脂质谱，NCIM 3589显示高水平的MUFA，而NCIM 3590的MUFA与SFA含量几乎相等。选择这些菌株是为了评估其不饱和模式在最低限度合成培养基中是否保持一致，以及拉曼光谱能否在单细胞分辨率下分辨这些差异。

为此，三株菌均在添加60 g/L葡萄糖的酵母氮源基础（YNB）培养基中培养。NCIM 3472和NCIM 3589在摇瓶中于30 ± 1 °C培养，而NCIM 3590在20 ± 1 °C、180 rpm振荡条件下培养（Katre et al., 2012b）。通过测定600 nm处光密度（OD600）在设定时间间隔监测生长，以确保各菌株在限定条件下生长性能一致。

【数据】菌株：NCIM 3472、NCIM 3589、NCIM 3590；培养基：YNB + 60 g/L葡萄糖；温度：30 ± 1 °C（NCIM 3472/3589）、20 ± 1 °C（NCIM 3590）；转速：180 rpm；监测手段：OD600

2.2 脂肪酸提取与GC-MS分析

#### 2.2.1 脂质提取

采用改良的Bligh和Dyer方法（Bligh and Dyer, 1959）从稳定期收获的细胞中提取总脂质。细胞沉淀通过5000 ×g离心5 min获得。沉淀用1× PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤三次，浸入甲醇:水溶液（2:1，v/v）中。加入氯仿使氯仿:甲醇:水比例为1:2:0.8，在室温下剧烈涡旋。最后加入氯仿和水使终比例为2:2:1.8（氯仿:甲醇:水），实现分相。离心后，收集含有总脂质的下层有机相至玻璃小瓶。收集的溶液用真空浓缩仪干燥，储存于−20 °C直至进一步分析。

【数据】离心：5000 ×g，5 min；洗涤：1× PBS三次；溶剂体系：氯仿:甲醇:水 = 2:2:1.8；干燥：真空浓缩；储存：−20 °C

#### 2.2.2 脂肪酸甲酯（FAME）制备

为进行GC-MS分析，采用酸催化酯交换反应将总脂质提取物化学修饰为脂肪酸甲酯（FAMEs）（Moradi-kheibari et al., 2017）。脂质样品重悬于含2%（v/v）H₂SO₄的甲醇溶液中，于90 °C保持50 min。期间定期搅拌以确保所有脂肪酸均酯化为甲酯。FAME冷却至室温后，加入正己烷和水进行分相，随后剧烈涡旋。收集含有FAME的上层正己烷层至GC小瓶。用真空浓缩仪干燥后，重新溶解于新鲜正己烷中，最终储存于−20 °C备用。

【数据】酯化试剂：2% H₂SO₄/甲醇（v/v）；温度：90 °C；时间：50 min；萃取：正己烷/水；储存：−20 °C

#### 2.2.3 FAME的GC-MS分析

总脂质提取物制备的FAME使用配备质谱检测器的Thermo Scientific TRACE 1600气相色谱仪分析。FAME样品溶解于正己烷中，1 μL以分流模式注入TG-WAXMS毛细管柱。氦气为流动相，恒定流速1.0 mL min⁻¹，进样口温度固定为250 °C。柱温箱采用程序升温序列：起始50 °C保持1 min，以10 °C min⁻¹升至150 °C并保持2 min，随后以4 °C min⁻¹升至250 °C并保持10 min。质谱分析器采用70 eV电子轰击电离能量，离子源温度230 °C，四极杆温度150 °C。离子碎片在m/z 50–550范围内记录。通过将色谱洗脱行为和质谱图谱与已建立的参考文库及外标比对，鉴定特定脂肪酸。分析级纯硬脂酸（C18:0，饱和）、油酸（C18:1，单不饱和）和亚油酸（C18:2，多不饱和）在相同衍生化条件下处理，用于确认峰身份。采用相对峰面积比较三株菌的脂肪酸组成和不饱和程度。

【数据】进样量：1 μL；流速：1.0 mL min⁻¹；进样口温度：250 °C；程序升温：50 °C→150 °C（10 °C/min）→250 °C（4 °C/min）；电离能：70 eV；m/z范围：50–550

2.3 拉曼光谱参考标准品

硬脂酸、油酸和亚油酸用作分析级参考脂肪酸。拉曼光谱通过WITec alpha300共聚焦拉曼显微镜获取，激发激光532 nm。使用600 g/mm衍射光栅、冷却CCD探测器和100×显微镜物镜（数值孔径0.8）。每个光谱的激光功率设为8 mW，积分时间5 s，累加3次。脂肪酸标准品的参考光谱从样品上十个不同位置获取，以确认所获光谱的准确性和可重复性。这些参考光谱随后用于考察拉曼强度比值随脂肪酸不饱和度增加的变化规律。

【数据】激光：532 nm；光栅：600 g/mm；物镜：100×（NA 0.8）；功率：8 mW；积分时间：5 s；累加：3次；采样位置：10处

2.4 生物提取物的拉曼光谱

从三株解脂耶氏酵母中提取脂质，操作步骤与前文相同（Sharma et al., 2015）。将少量提取脂质滴加在干净的CaF₂盖玻片上。使用配备532 nm激光、600 g/mm光栅、冷却CCD探测器和100×物镜（数值孔径0.8）的共聚焦WITec alpha300拉曼成像系统采集光谱。在载玻片上10个不同区域共采集10个光谱，每个光谱积分时间5 s，累加3次。光谱采集范围限定在指纹区和高波数区（覆盖600 cm⁻¹至3100 cm⁻¹）。每个光谱均进行基线校正、平滑和归一化处理。

【数据】基底：CaF₂盖玻片；光谱范围：600–3100 cm⁻¹；积分时间：5 s；累加：3次；光谱数：10个

2.5 原位拉曼光谱采集

为在无需冗长提取或化学衍生化的情况下直接识别和区分单个酵母细胞内的脂质不饱和度，直接在完整酵母细胞上进行活细胞拉曼测量。各菌株细胞在稳定期收获，2500 ×g离心沉淀，随后用10× PBS洗涤三次。在CaF₂载玻片上随机选取不同区域采集单细胞光谱，以确保代表细胞异质性。光谱采集积分时间7 s，每光谱累加5次。每株菌采集30个光谱，所有实验重复三次以保证可重复性。对于比值分析，计算每个光谱的拉曼强度比值（1650/1445和3005/1445）。所得比值用于计算各菌株的平均值±标准差。组间统计显著性使用这些单次比值测量进行评估。

【数据】离心：2500 ×g；洗涤：10× PBS三次；积分时间：7 s；累加：5次；每株光谱数：30；重复：三次；比值：1650/1445、3005/1445

2.6 拉曼成像

各解脂耶氏酵母菌株细胞按前述标准制备方法固定在氟化钙（CaF₂）基底上。使用2.3节所述的共聚焦拉曼显微镜进行拉曼高光谱成像。光谱图采集面积为10 μm × 10 μm。空间步长约0.2 μm，以确保亚细胞分辨率。每像素采集时间1 s，单张拉曼图像的总采集时间为1至2 h，取决于成像面积。单细胞拉曼光谱的相同预处理流程应用于高光谱成像数据集。采集的高光谱数据使用MATLAB 2025a处理。基线校正采用多项式拟合算法进行。

【数据】成像面积：10 μm × 10 μm；步长：0.2 μm；每像素时间：1 s；总采集时间：1–2 h；软件：MATLAB 2025a

研究结果

3.1 最低培养基中的生长曲线

三株解脂耶氏酵母——NCIM 3472、NCIM 3589和NCIM 3590——在添加60 g/L葡萄糖的限定YNB培养基中均表现出与标准酵母培养基相当且一致的生长，如图1所示。120小时内的OD600测量显示各菌株均无明显迟滞期或生长抑制。OD600还表明三株菌均在大约第60小时从指数生长期过渡到稳定期。已知产油酵母在稳定期脂质积累达到最大，因此基于OD600的生长曲线分析用于确定后续脂质和拉曼分析的适当时间窗口。

▲ 解脂耶氏酵母菌株NCIM 3472、NCIM 3589和NCIM 3590的生长动力学。它们在补充有60 g/L葡萄糖的基础YNB培养基中培养。在120小时期间的规定时间点监测600 nm处的光密度（OD600）。所有三种菌株表现出相似的生长，

【数据】监测时间：120 h；进入稳定期：约第60 h；培养基：YNB + 60 g/L葡萄糖

3.2 GC-MS验证脂肪酸谱

FAME提取物的GC-MS分析揭示了菌株特异性脂质谱，与这些菌株在替代生长培养基中报道的脂质组成存在部分差异。NCIM 3472具有高比例的多不饱和脂肪酸，主要为亚油酸（C18:2），与其既往研究中的不饱和特性一致。同样，NCIM 3590表现出以硬脂酸（C18:0）为主的饱和脂质谱，与先前报道相符。与先前报道的脂肪酸谱相比出现的偏差可能源于本研究培养基配方的改变——早期工作是在不同生长条件下表征这些菌株，而本研究采用添加60 g/L葡萄糖的限定YNB最低培养基。已知解脂耶氏酵母的脂肪酸组成可随营养可利用性、碳源和培养条件显著变化，这些因素影响脂质生物合成途径的调控。因此，NCIM 3589中观察到的向更均衡的饱和与单不饱和脂肪酸分布转变，可能反映了菌株对本研究限定培养基的代谢适应。这一偏差进一步支持解脂耶氏酵母的脂质组成对营养环境敏感，表明本研究的限定最低培养基可能改变了其脂肪酸生物合成途径。

表1总结了三株解脂耶氏酵母中MUFA和PUFA的存在与缺失情况。从GC-MS分析获得的这些菌株特异性脂肪酸谱作为解释后续拉曼光谱结果的参考。为从GC-MS结果中获得脂肪酸组成的定量表示，使用已鉴定脂肪酸的相对峰面积计算不饱和指数（MUFA + PUFA）/SFA。脂肪酸组成的比值分析显示菌株间存在明显不同的脂质谱，使其能够分为含PUFA、MUFA = SFA和富SFA三类，如图2所示。用于此计算的详细GC-MS峰面积见补充表S1。脂肪酸组成主要包含C14-C18脂肪酸，油酸为主要成分。菌株间SFA和MUFA分布的差异反映了YNB高葡萄糖条件下菌株特异性的脂质代谢。

▲ Ratiometric analysis of lipid composition across different strains based on relative area contributions of SFA, MUFA, and PUFA obtained from spectral data. The comparative ratios were used to categorize the strains into PUFA-containing, MUFA = SFA and SFA-rich groups, reflecting differences in fatty

【数据】NCIM 3472：高比例PUFA（亚油酸C18:2）；NCIM 3590：以硬脂酸C18:0为主；NCIM 3589：SFA/MUFA均衡分布；主要脂肪酸链长：C14-C18；主要成分：油酸

3.3 纯标准品的拉曼光谱

硬脂酸、油酸和亚油酸分别从五个不同区域扫描作为光谱参考。1445 cm⁻¹峰在三者中均出现，反映脂肪酸典型的CH₂弯曲振动。相比之下，1650 cm⁻¹和3005 cm⁻¹信号从硬脂酸到油酸再到亚油酸逐渐增强，与双键数量的增加一致，如图3所示。这一趋势证实这些拉曼特征峰可靠地反映脂肪酸不饱和度的变化。

▲ 分析级纯脂肪酸标准品（硬脂酸、油酸、亚油酸）的平均拉曼光谱。突出显示了1445 cm⁻¹（CH₂弯曲）、1650 cm⁻¹（C=C伸缩）和3005 cm⁻¹（=C-H伸缩）处的特征振动带。这三个突出波段分别代表总饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。

【数据】1445 cm⁻¹：CH₂弯曲（三者均存在）；1650 cm⁻¹：C=C伸缩（随不饱和度增强）；3005 cm⁻¹：=C-H伸缩（随不饱和度增强）

3.4 总脂质提取物的拉曼光谱

三株解脂耶氏酵母脂质提取物的平均拉曼光谱显示出与GC-MS分析所得脂肪酸组成相似的明显差异。含PUFA菌株（NCIM 3472）在1650 cm⁻¹和3005 cm⁻¹位置均显示最高强度，如图4所示。NCIM 3589在1650 cm⁻¹和3005 cm⁻¹处显示较低强度带，意味着与NCIM 3472相比不饱和度降低。而NCIM 3590的1650 cm⁻¹带比NCIM 3589更弱，且在3005 cm⁻¹处无明显可见带。综合这两个标记，表明NCIM 3590具有饱和脂质谱。这也证明即使不经过任何酯化处理，直接通过拉曼光谱分析提取脂质即可捕获菌株间脂肪酸不饱和度的差异。

▲ A. Average Raman spectra of total lipid extracts from NCIM 3472 (PUFA-containing), NCIM 3589 (MUFA = SFA), and NCIM 3590 (SFA-rich). The CH2 bending at 1445 cm−1 and the CC stretching band at 1650 cm−1 are associated with the total lipid content and lipid unsaturation, respectively, as highlighted i

【数据】NCIM 3472：1650/3005 cm⁻¹强度最高；NCIM 3589：1650/3005 cm⁻¹强度中等；NCIM 3590：1650 cm⁻¹最弱，3005 cm⁻¹不可见

3.5 原位单细胞拉曼分析

各菌株活体解脂耶氏酵母细胞的平均拉曼光谱如图5A所示。这些光谱突出了三株菌间脂质相关振动特征的明显菌株依赖性差异。三株菌均在1445 cm⁻¹处有显著谱带（CH₂弯曲），表明总体脂质存在。但在不饱和度敏感谱带处观察到差异。含PUFA菌株（NCIM 3472）在1650 cm⁻¹（C=C伸缩）和3005 cm⁻¹（=C-H伸缩）处均显示强信号。NCIM 3589在不饱和谱带处显示降低的强度，表明与NCIM 3472（含PUFA）相比不饱和度较低。相比之下，NCIM 3590显示最弱的1650 cm⁻¹和3005 cm⁻¹谱带，因为其脂质谱以饱和脂肪酸为主。

▲ A. Mean of 90 single-cell Raman spectra from each strain of Yarrowia lipolytica cells showing strain-dependent differences in lipid unsaturation. The blue spectrum corresponds to the PUFA-containing strain (NCIM 3472), the green spectrum represents the strain with approximately equal proportions of

【数据】NCIM 3472：1650/3005 cm⁻¹强信号；NCIM 3589：不饱和谱带强度降低；NCIM 3590：1650/3005 cm⁻¹最弱

3.6 拉曼成像与单细胞脂质定位

▲ 明场图像及对应的单个解脂耶氏酵母菌株细胞的拉曼强度图。每行依次代表不同菌株NCIM 3472（含PUFA）、NCIM 3589（MUFA = SFA）和NCIM 3590（富含SFA），各列显示明场图像。

In situ assessment of unsaturated fatty acids using Raman sp — ▲ 论文配图

【数据】成像面积：10 μm × 10 μm；步长：0.2 μm；每像素时间：1 s

讨论与解读

本研究展示了一种简单可靠的基于拉曼光谱的分析技术，用于评估三株不同解脂耶氏酵母菌株中提取脂质和活细胞内的脂质不饱和度。该方法的简便性源于仅使用三个光谱谱带，即可快速、免标记、无损伤地测量脂肪酸不饱和水平，同时减少了对复杂多变量建模或使用危险易燃化学品的侵入性提取流程的需求。利用相同三个谱带，还可在单细胞水平考察细胞内脂质分布，实时理解单个细胞内脂滴大小和质量的差异。对于微生物菌株筛选、脂质工程和生物过程监测，本研究确立了1650/1445 cm⁻¹和3005/1445 cm⁻¹比值作为实际应用中的实用工具。该方法为基础研究和工业生物技术中的高通量表型分析和活细胞脂质组学开辟了新途径。

编译者解读：本研究最值得借鉴之处在于将拉曼光谱的三个特征峰比值巧妙转化为脂质不饱和度的定量指标，绕开了传统GC-MS繁琐的样品前处理流程，使实时在线监测成为可能。从合成生物学应用角度看，该方法直接对接工业菌株高通量筛选和发酵过程监控两大需求——无需破坏细胞即可追踪产油性能，为动态调控脂质合成路径提供了实时反馈手段。其局限在于目前仅验证了三株菌的差异分辨，若要推广至更广泛的菌株库或复杂发酵体系，仍需建立更大样本量的谱图-成分关联数据库。此外，单细胞拉曼成像的采集时间（1–2小时/图）尚难以满足真正意义上的高通量需求。

参考来源

Dadhara R. In situ assessment of unsaturated fatty acids using Raman spectroscopy in Yarrowia lipolytica[J]. Bioresource Technology Reports, 2026. DOI: 10.1016/j.biteb.2026.102771

DOI: 10.1016/j.biteb.2026.102771

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