来源：Metabolic engineering and metabolomics based profiling of cyanobacteria for enhanced succinate production（Algal Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
琥珀酸是重要的四碳二元羧酸，广泛应用于工业化学品、医药和可生物降解聚合物合成。传统生产依赖高能耗石化工艺，不可持续。本研究以快速生长的蓝藻 Synechococcus elongatus PCC 11801 为宿主，将乙醛酸循环异源表达与 CRISPR-Cpf1 基因编辑相结合，并在优化培养条件下实现了高达 350 mg/L 的胞外琥珀酸产量。非靶向代谢组学揭示了中心碳代谢的大规模重编程，为光合微生物细胞工厂的理性设计提供了新数据。
研究背景
琥珀酸是合成溶剂、医药和可降解塑料的重要生物基平台化合物。传统生产依赖能耗密集的石化工艺，微生物发酵被视为可持续替代路线。代谢工程通过策略性重定向代谢流，可显著提升微生物琥珀酸产量，核心操作靶点集中于三羧酸（TCA）循环及其旁路途径。乙醛酸途径作为 TCA 循环的分流支路，可绕过脱羧步骤，将异柠檬酸直接转化为琥珀酸和乙醛酸，从而节约碳原子。该策略在 E. coli 等异养菌中已取得显著成效。此外，通过 CRISPR-Cpf1 靶向敲除琥珀酸脱氢酶（SDH）可有效阻止琥珀酸向延胡索酸转化，强化琥珀酸积累。蓝藻作为光合自养宿主，具备直接利用 CO₂ 合成化学品的天然优势，是可持续生产的理想底盘生物。
研究方法
2.1 菌株工程
Synechococcus elongatus PCC 11801 在 BG-11 培养基中、38°C、连续光照（100–300 μmol m⁻² s⁻¹）、120 rpm 振荡条件下培养。E. coli TOP10 用于质粒扩繁，在 37°C、Luria–Bertani 培养基中维持。PpsbA1 和 Pcpcb300 启动子、ms 和 icl 基因（来源于 E. coli MG1655 基因组 DNA）、Tlac 和 TrrnB 终止子分别使用特异性引物扩增（表 S1）。通过重叠延伸 PCR 组装 Pcpcb300-ms-icl-TrrnB 和 PpsbA1-icl-TrrnB 两个表达盒。两个表达盒可直接使用或通过重叠 PCR 连接后，利用限制性克隆插入整合载体 pSyn_11801。所有构建体先转化至化学感受态 E. coli TOP10，再按前期研究所述方法自然转化至 S. elongatus PCC 11801 [14,17,26]。标准品和试剂详细信息见补充信息（S1.1 节）。
【数据】培养基：BG-11；温度：38°C；光照：100–300 μmol m⁻² s⁻¹；转速：120 rpm；宿主菌：E. coli TOP10（37°C，LB 培养基）
2.2 工程蓝藻菌株的培养
重组蓝藻菌株在 20 mL BG-11 培养基中、38°C、120 rpm 振荡培养 5–7 天。细胞生长和琥珀酸产量在四种条件下监测：HLLC（高光 300 μmol m⁻² s⁻¹ + 环境 CO₂ 0.04%）、LLLC（低光 50–100 μmol m⁻² s⁻¹ + 环境 CO₂）、HLHC（高光 + 1% CO₂）、LLHC（低光 + 1% CO₂）。实验设三个生物学重复。琥珀酸滴度测定：每隔一天采集样品，使用 GCMS 分析。培养上清液（200 μL）与 600 μL 甲醇混合，涡旋 30 分钟，10,000 rpm 离心 5 分钟。取提取液（200 μL）干燥并衍生化后进行 GCMS 分析 [27]。琥珀酸浓度使用标准曲线（50–400 mg/L）确定。详细方法见补充信息（S1.2 节）。
【数据】培养基体积：20 mL BG-11；温度：38°C；转速：120 rpm；培养时间：5–7 天；四种光照/CO₂ 条件：HLLC（300 μmol m⁻² s⁻¹ + 0.04% CO₂）、LLLC（50–100 μmol m⁻² s⁻¹ + 0.04% CO₂）、HLHC（300 μmol m⁻² s⁻¹ + 1% CO₂）、LLHC（50–100 μmol m⁻² s⁻¹ + 1% CO₂）；上清液取样量：200 μL；甲醇用量：600 μL；涡旋时间：30 min；离心：10,000 rpm × 5 min；标准曲线范围：50–400 mg/L
2.3 利用 CRISPR 下调竞争通路基因
采用含有 CRISPR-Cpf1 系统的 pSL2680 载体 [28]，设计 20 bp 向导 RNA（gRNA）靶向 sdh 基因。gRNA 通过两个 aarI 限制性位点克隆入载体，同时切除 X-gal 基因用于阴性筛选。随后将 sdh 基因上下游各 750 bp 的修复模板通过单一 KpnI 位点克隆入载体。最终载体通过接合转移转化至目标菌株。详细方法见补充信息（S1.3 节）。
【数据】gRNA 长度：20 bp；修复模板：sdh 上下游各 750 bp；克隆位点：aarI（gRNA）、KpnI（修复模板）
2.4 重组菌株的代谢组学分析
#### 2.4.1 代谢物提取
胞内代谢物采用本课题组开发的双相提取法 [29]。简要流程：中指数期培养物（OD₇₃₀ = 0.6–0.8）经 0.8 μm 尼龙膜过滤，细胞用 80:20 甲醇:水混合物在室温下淬灭，并在 −80°C 溶剂混合物中裂解 1 小时。涡旋后加入 0.2 M 氢氧化铵促进分相。收集上层富含水相，真空干燥后于 −80°C 保存。LCMS 分析前，样品用 100 μL 50/50 乙腈-水混合物复溶，经 0.2 μm 滤膜过滤后进样。
【数据】取样OD₇₃₀：0.6–0.8；滤膜孔径：0.8 μm（尼龙）；淬灭液：80:20 甲醇:水；裂解温度/时间：−80°C、1 h；分相试剂：0.2 M 氢氧化铵；复溶液：100 μL 50/50 乙腈-水；滤膜：0.2 μm
#### 2.4.2 LC-MS/MS 数据采集与分析
完全 ¹³C 标记的野生型 PCC 11801 生物质作为内标，在复溶时加入每个样品中，用于代谢物准确定量和归一化。色谱分离：进样 5 μL，使用 BEH-HILIC 色谱柱（130 Å，1.7 μm，2.1 mm × 100 mm，Waters）。流动相：0.1% 甲酸 + 5 mM 乙酸铵水溶液（溶剂 A）和 0.1% 甲酸乙腈溶液（溶剂 B）。质谱采用负离子模式，使用 Triple TOF 5600+ 质谱仪（SCIEX，Framingham, MA, USA），耦合 UHPLC 系统（Shimadzu Nexera LC-30AD，新加坡）。电喷雾离子源（ESI）电压 −4500 V，接口加热器温度 450°C。雾化气（GS1）、辅助气（GS2）和气帘气压分别为 40、40 和 35 psi。每批生物学重复分析前进行 LC-MS 系统校准。由生物学重复混合而成的质控（QC）样品间歇运行以监测分析一致性和性能。每五次样品进样后引入溶剂空白以评估潜在残留污染。数据预处理包括使用 MSOne（https://msone.claritybiosystems.com/）和 MS-DIAL [30] 软件平台进行初始峰检测和特征提取。代谢特征定义为具有独特质荷比（m/z）和保留时间的离子。代谢物通过与公共数据库 HMDB、GNPS 和 MS-DIAL MSP 谱图列表进行谱图匹配鉴定。使用 MetAnalyzer 对色谱峰进行人工检查和验证。数据归一化采用各目标代谢物的完全标记同位素内标。归一化峰面积比随后使用 MetaStat 进行统计分析，以鉴定显著变化的代谢物（p < 0.05，倍数变化 > 1.5）。
【数据】进样量：5 μL；色谱柱：BEH-HILIC（130 Å，1.7 μm，2.1 mm × 100 mm）；流动相A：0.1% 甲酸 + 5 mM 乙酸铵水溶液；流动相B：0.1% 甲酸乙腈；ESI电压：−4500 V；加热器温度：450°C；GS1/GS2/气帘气：40/40/35 psi；统计学阈值：p < 0.05，fold-change > 1.5
#### 2.4.3 GCMS 数据采集与分析
GCMS 分析前，胞内样品先用 MOX-吡啶-MSTFA 衍生化 [31]。干燥样品在衍生化过程中加入正缬氨酸和 PTA 作为内标。GC 和 MS 方法与前人描述一致 [32]。所有条件均使用两个生物学重复检测胞内代谢谱。使用 GCMS 后处理软件（Shimadzu，京都，日本）进行数据预处理，随后对先前用纯标准品建立的 80 种化合物进行靶向分析。
【数据】衍生化试剂：MOX-吡啶-MSTFA；内标：正缬氨酸、PTA；生物学重复：2；靶向分析化合物数：80
研究结果
3.1 乙醛酸途径异源表达实现胞外琥珀酸生产
野生型 S. elongatus PCC 11801 的基础琥珀酸产量为 5 mg/L。为提升产量，首先表达了乙醛酸循环酶——异柠檬酸裂解酶（ICL）和苹果酸合酶（MS）（图 S1）。设计了多个质粒构建体，基因可分别在强天然启动子（如 PpsbA1 驱动 ICL）下单独表达，或在 Pcpcb300 启动子下以操纵子形式共同表达。为实现染色体整合和稳定表达，构建体通过 pSyn1 整合载体插入中性位点（NS-I，命名为 DOP62_0352510）[33]。工程菌株在 LLHC 条件（100 μE m⁻² s⁻¹ 和 1% CO₂）下培养，以确保驱动 ICL 和 MS 表达的天然启动子具有高活性，从而提高酶活性和乙醛酸途径代谢通量。结果显示琥珀酸滴度提升 10 倍，达 50 mg/L（图 1A）。
【数据】野生型基础产量：5 mg/L；工程菌株产量：50 mg/L（10 倍提升）；培养条件：LLHC（100 μE m⁻² s⁻¹，1% CO₂）；整合位点：NS-I（DOP62_0352510）
3.2 敲除琥珀酸脱氢酶进一步提高琥珀酸滴度
为通过最小化竞争性代谢流进一步提升琥珀酸产量，使用 CRISPR-Cpf1 靶向敲除琥珀酸脱氢酶基因——该酶在 TCA 循环中将琥珀酸氧化为延胡索酸。1Δsdh_glyC 菌株在 LLHC 条件下培养 72 小时后，胞外琥珀酸产量达约 150 mg/L（图 1B）。这些菌株的生长速率与野生型和仅表达乙醛酸途径的工程菌株相当，表明 SDH 敲除未对细胞活力产生不利影响（图 S2）。进一步将 SDH 敲除菌株在 5× BG11 培养基中培养，通过提供充足营养和优化整体细胞环境来支持增强的代谢活性。1Δsdh 菌株的生长曲线与野生型相似，而 1Δsdh_GlyC 菌株在 8 天后生物量积累略有减少（图 S3）。然而，伴随而来的是胞外琥珀酸滴度的显著提升，最高滴度达 350 mg/L（图 1C）。
【数据】1Δsdh_glyC 产量：~150 mg/L（72 h，LLHC）；最高产量：350 mg/L（5× BG11 培养基）；生物量变化：1Δsdh_GlyC 在 8 天后略有减少
3.3 高 CO₂ 条件下工程菌株的代谢组学分析
四种 PCC 11801 菌株——野生型（11,801_wt）、1_glyC（ICL + MS 操纵子）、1Δsdh（SDH 基因敲除）和 1Δsdh_glyC（ICL + MS 操纵子 + SDH 基因敲除）——均在低光强（100 μE）和高 CO₂（1%）条件下培养，该条件在本研究中获得最高琥珀酸产量。生长曲线监测 5 天，分别在对数早期（第 1 天）、琥珀酸产量峰值期（第 3 天）和生长后期（第 5 天）取样进行详细代谢组学分析（图 2A）。非靶向 LC-MS 代谢组学检测到约 3500 个特征峰。单因素 ANOVA 鉴定出 744 个跨样品的显著特征峰。超过 80 个显著代谢物在内标中具有对应的完全标记峰，可用于相对定量（图 2C）。互补的靶向 GC-MS 对有机酸、氨基酸、糖和糖醇进行了精确的相对定量。
总体而言，野生型菌株主要将固定碳分配给生物量和储存碳水化合物，TCA 中间体水平相对稳定，琥珀酸积累可忽略不计。而重组菌株显著将碳通量重定向至琥珀酸生物合成，产生了独特的代谢特征。主成分分析（PCA）显示，菌株间基于遗传修饰和时间取样的分离清晰可见（图 2D）。第 1 天，表达乙醛酸途径的菌株（1_glyC）已明显偏离野生型，凸显了 ICL 和 MS 表达的早期代谢影响。同样，SDH 敲除菌株（1Δsdh 和 1Δsdh_glyC）形成独立聚类，反映了 SDH 破坏的深远影响。第 3 天，代谢分歧更为显著，尤其是双重修饰菌株（1Δsdh_glyC），表明乙醛酸途径表达与 SDH 敲除结合时发生了广泛的代谢重编程。第 5 天，工程菌株间的代谢分歧加剧，突出了显著的代谢调整，在双重工程菌株 1Δsdh_glyC 中尤为突出。
【数据】检测特征峰数：~3500；显著特征峰：744（单因素 ANOVA）；可相对定量代谢物：>80；取样时间点：第 1、3、5 天；培养条件：100 μE + 1% CO₂
#### 3.3.1 有机酸谱
TCA 循环中间体的定量揭示了工程菌株中有意设计的碳流重定向和补偿性响应（图 3）。1_glyC 菌株中，琥珀酸和延胡索酸水平高于野生型，第 3 天出现明显峰值，凸显了乙醛酸途径绕过 TCA 循环关键脱羧步骤的能力。1Δsdh 菌株在所有取样点均显示持续升高的琥珀酸水平，证实了琥珀酸氧化的有效阻断，而延胡索酸未同等积累，表明替代性或回补途径维持了延胡索酸稳态。在 1Δsdh_glyC 中结合两种修饰进一步放大了琥珀酸积累，同时延胡索酸水平也升高，苹果酸和柠檬酸在后期增加，表明为应对增强的碳通量而发生了更广泛的代谢调整。值得注意的是，该双重修饰菌株第 3 天柠檬酸急剧增加，提示在 TCA 通量增强时异柠檬酸脱氢酶或相关步骤可能存在瓶颈。这一限制在环境 CO₂ 条件下更为明显（数据未显示），但在 1% CO₂ 条件下得到缓解——高 CO₂ 为中心代谢提供了充足的固定碳。
【数据】1_glyC：琥珀酸和延胡索酸第 3 天达峰；1Δsdh：琥珀酸全程升高、延胡索酸未同等积累；1Δsdh_glyC：琥珀酸进一步升高、延胡索酸升高、苹果酸和柠檬酸后期上升、第 3 天柠檬酸急剧增加
#### 3.3.2 氨基酸和胁迫标志物
氨基酸库和胁迫相关代谢物的变化反映了代谢工程诱导的细胞生理胁迫。谷氨酸和氧脯氨酸呈负相关，表明谷胱甘肽（GSH）代谢发生改变。氧脯氨酸积累在第 5 天尤为明显，是氧化胁迫和 GSH 循环的诊断标志物（图 4）。重组菌株表现出 GSH 升高和眼酸（ophthalmate）降低，表明抗氧化响应增强。此外，SDH 敲除菌株中表没食子儿茶素升高，表明 ROS 清除能力增强，而乙醛酸途径表达菌株中脯氨酸水平略降，提示渗透胁迫响应改变或资源重新分配。工程菌株的谷氨酸水平在第 3 天前持续升高，表明 SDH 破坏后氮分配向氨基酸生物合成倾斜。相反，芳香族和支链氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸）在大多数天数下降，暗示其生物合成途径存在代谢瓶颈。双重工程菌株表现出显著的氨基酸库紊乱，反映了复合代谢胁迫（图 4）。
【数据】谷氨酸：第 3 天前持续升高；氧脯氨酸：第 5 天积累明显；GSH：重组菌株中升高；眼酸：降低；表没食子儿茶素：SDH 敲除菌株中升高；脯氨酸：乙醛酸途径菌株中略降；苯丙氨酸/酪氨酸/赖氨酸：多数天数下降
#### 3.3.3 中心碳代谢物动态
LCMS 对中心碳代谢物（涵盖糖酵解和 TCA 循环中间体）的胞内谱分析提供了靶向遗传修饰在培养过程中诱导的代谢重编程的详细见解（图 S4–S6）。值得注意的是，α-酮戊二酸（AKG）的积累呈现差异化动态：乙醛酸工程菌株（1_glyC）呈逐渐增加趋势，表明 TCA 循环通量对代谢扰动的渐进式调整。相反，双重工程菌株在整个培养期间维持持续升高的 AKG 水平，与碳通量持续向 TCA 循环重定向以及碳固定能力增强一致。磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和 3-磷酸甘油酸（3-PGA）在早期阶段的升高，尤其在表达乙醛酸途径酶的重组菌株中显著，表明糖酵解通量增强——原文此处截断。
【数据】AKG：1_glyC 逐渐升高、1Δsdh_glyC 全程持续升高；PEP 和 3-PGA：早期升高，在乙醛酸途径表达菌株中尤为显著
讨论与解读
本研究通过靶向代谢工程策略提升了 Synechococcus elongatus PCC 11801 的琥珀酸产量。异源共表达异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶引入乙醛酸支路，有效绕过了天然 TCA 循环的脱羧反应，将碳通量导向琥珀酸合成。使用天然蓝藻启动子（尤其是 cpcb300）实现了乙醛酸途径酶的稳定表达——这在蓝藻中通常因染色体分离问题而具有挑战性。低光、高 CO₂ 培养条件通过调控启动子活性显著增强了酶表达，凸显了遗传工程策略与优化环境条件相匹配的重要性。本研究的实际进展在于应用 CRISPR-Cpf1 基因组编辑破坏琥珀酸脱氢酶（SDH），这一关键步骤减少了琥珀酸氧化造成的碳损失，实现 150 mg/L 的滴度。代谢组学分析提供了靶向遗传修饰引起的代谢变化的详细见解。胞内谱分析确认了显著的琥珀酸积累，表明乙醛酸支路活性有效，而苹果酸产量相对较低，提示乙醛酸途径下游存在限制。
编译者解读
本研究是"遗传改造 + 组学反馈"闭环策略在光合微生物中的典型示范。作者将乙醛酸支路导入与 SDH 敲除巧妙组合，配合低光高 CO₂ 培养条件，将琥珀酸产量从野生型的 5 mg/L 推至 350 mg/L——70 倍提升。代谢组学数据揭示了双重改造菌株的代谢代价：氨基酸库紊乱、氧化胁迫标志物上升，说明碳流重定向并非无痛操作。从合成生物学应用角度看，本研究的方法论价值在于：代谢组学不仅验证了改造效果，更定位了柠檬酸积累这一潜在瓶颈，为下一步靶点选择提供了依据。局限在于高 CO₂ 依赖性和 5× BG11 培养基成本，距离工业化仍有距离。后续若能在柠檬酸节点或胁迫耐受性上继续迭代，有望进一步提升。
参考来源
期刊：Algal Research, 2025
DOI: 10.1016/j.algal.2025.104286
DOI: 10.1016/j.algal.2025.104286