来源：Bioplastic production by harnessing cyanobacteria-rich microbiomes for long-term synthesis（Science of The Total Environment）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
石油基塑料的环境问题催生了生物可降解塑料的研发热潮。聚羟基丁酸酯（PHB）作为一种微生物合成的可降解聚酯，传统生产依赖纯种异养培养，成本高、能耗大。本研究跳出这一框架，利用蓝藻富集的混合微生物组，在3 L非无菌光生物反应器中通过生长/积累交替循环，实现了长达108天的连续PHB生产，最高含量达细胞干重（dcw）的28%。该策略首次证明了光养微生物组在非无菌条件下持续生产PHB的可行性。
研究背景
石油基塑料的不可降解性及其对原油开采的依赖，推动了对可持续替代品的探索。生物基塑料因来源有机、可降低碳足迹而备受关注，其产量预计将从2022年的230万吨增至2027年的630万吨。聚羟基脂肪酸酯（PHA）因力学性能与传统塑料相近而成为研究热点，多种细菌可在无机营养缺乏时将其合成为胞内颗粒。然而，现有研究多集中于纯种异养培养，产量仍难满足市场需求。本研究另辟蹊径，以蓝藻富集的混合微生物组为对象，探索其在非无菌光生物反应器中的PHB合成潜力。
研究方法
2.1 接种物与实验装置
采用两株微生物组R3和UP作为3 L玻璃圆柱形光生物反应器（PBRs，工作体积2.5 L）的接种物。R3采集自西班牙巴塞罗那贝索斯河（41°25′20.2”N 2°13′38.2″E），该间歇性地中海河流接收巴塞罗那都市区污水处理厂的大量处理后废水；UP采集自巴塞罗那Diagonal Mar公园城市池塘（41°24′31.0”N 2°12′49.9″E），以地下水补给。样品先在低磷浓度（0.2 mg·L⁻¹）的BG-11培养基中培养以筛选光养生物，于5 klx光照（约70 μmol m⁻² s⁻¹）、15:9小时光暗周期（冷白光LED）、持续磁力搅拌条件下培养。每15天按1:5比例放大至1 L锥形瓶。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析（前期工作）显示，R3富含单细胞蓝藻——集胞藻属（Synechocystis sp.）和聚球藻属（Synechococcus sp.），分别近似于Synechocystis sp. PCC6803和Synechococcus sp. PCC 6312；UP含聚球藻属（近似Synechococcus sp. PCC 6312）及绿藻。每种微生物组设两个PBR作为平行重复。反应器光照由200 W LED泛光灯提供，距反应器15 cm，光照强度30 klx（约420 μmol·m⁻²·s⁻¹），生长期采用15:9小时光暗循环。pH通过反应器内置pH探针（HI1001，HANNA instruments，意大利）连续监测，生长期用pH控制器（HI 8711，HANNA instruments，意大利）控制在8 ± 0.5范围内；pH达8.5时，控制系统启动电磁阀向反应器注入CO₂。pH数据每5分钟由PC400软件（Campbell Scientific）记录。PHB积累期仅测量pH但不控制，以避免CO₂注入。积累期用不透明PVC管包裹反应器确保黑暗。反应器由磁力搅拌器持续搅拌保证完全混合，培养温度维持在30–35 °C。
【数据】接种物：微生物组R3（贝索斯河）与UP（Diagonal Mar公园）；培养基：BG-11（低磷0.2 mg·L⁻¹）；光照：5 klx（约70 μmol m⁻² s⁻¹）→30 klx（约420 μmol·m⁻²·s⁻¹）；光周期：15:9 h；pH：8 ± 0.5（生长期）；温度：30–35 °C；反应器：3 L玻璃圆柱形，工作体积2.5 L
2.2 实验策略
采用前期（Altamira-Algarra et al., 2024）所述生长/积累交替循环方法，运行108天（图1）。实验始于一个条件化周期，含一个生长阶段和一个积累阶段，旨在优化生物量生长条件并建立适宜后续重复实验的环境。生长阶段以100 mg挥发性悬浮固体（VSS）·L⁻¹的生物量浓度接种PBR，培养基为改良BG-11，含碳酸氢盐（作为无机碳源）、N和P，浓度分别为100 mgIC·L⁻¹、50 mgN·L⁻¹和0.1 mgP·L⁻¹。当N耗尽时进入饥饿阶段，此时添加600 mg乙酸·L⁻¹并用PVC管包裹PBR避光。此处"积累"与"饥饿"阶段同义，指细胞在营养缺乏条件下合成PHB的时段。条件化周期后，R3共进行5次重复，UP因PHB合成量低（与微生物组组成有关）仅进行3次重复。每次重复开始时，弃去约800–1200 mL培养液以净化系统，补充新鲜BG-11培养基（含25 mgN·L⁻¹、0.1 mgP·L⁻¹、无IC），初始生物量约400 mgVSS·L⁻¹。每日补加KH₂PO₄溶液维持反应器内P浓度（约0.1 mgP·L⁻¹）。每个生长阶段持续7天，直至N耗尽；之后进入饥饿阶段，添加乙酸至600 mg乙酸·L⁻¹。除R3第4次重复仅持续1周外，所有饥饿阶段均持续14天。
【数据】接种浓度：100 mgVSS·L⁻¹（条件化周期）/400 mgVSS·L⁻¹（重复实验）；培养基：改良BG-11（100 mgIC·L⁻¹、50 mgN·L⁻¹、0.1 mgP·L⁻¹）；乙酸添加：600 mg·L⁻¹；生长阶段：7天；饥饿阶段：14天（R3第4次为7天）；总运行：108天
2.3 分析方法
在选定时间点采集50 mL混合液。生物量浓度按VSS方法测定（American Public Health Association, 2012）。浊度用浊度仪（HI93703，HANNA Instruments）测量，VSS与浊度通过校准曲线关联，实现生物量浓度快速估算。溶解性化学物种测定前，样品先经0.7 μm孔径玻璃微纤维滤膜过滤去除颗粒物。硝酸盐浓度按Standard Methods方法4500-NO⁻₃(B)定量。需注意BG-11中唯一N源为硝酸盐。滤液再经0.45 μm孔径滤膜过滤，用离子色谱（CS-1000，Dionex Corporation，美国）测定乙酸。所有测量均设三次重复以确保数据稳健性和准确性。
【数据】采样量：50 mL；滤膜孔径：0.7 μm（颗粒去除）/0.45 μm（乙酸测定）；硝酸盐方法：4500-NO⁻₃(B)；仪器：浊度仪HI93703、离子色谱CS-1000；重复次数：3
2.4 显微观察
每个循环结束时，用明场和荧光显微镜（Eclipse E200，Nikon，日本）监测生物量组成。蓝藻和绿藻依据形态学特征进行鉴定和分类。每次饥饿阶段结束时用Neubauer计数板进行细胞计数，计数至>400个细胞以确保误差低于10%。胞内PHB通过改良的Nile Blue A染色法检测：将PBR样品等分涂布于玻片并经热处理固定；用1%（wt/vol）Nile Blue A溶液室温染色10分钟；去离子水轻轻冲洗残余染料；随后用8%（vol/vol）乙酸溶液处理1分钟（室温），再次充分冲洗并风干；最后在激发波长490 nm、发射波长590 nm下用荧光显微镜观察。
【数据】染色：1% Nile Blue A，室温10 min；乙酸处理：8%（vol/vol），室温1 min；荧光：激发490 nm/发射590 nm；细胞计数：>400个细胞；显微镜：Nikon Eclipse E200
2.5 透射电子显微镜
在第4次重复的饥饿阶段开始时（乙酸注入前）、第4天和饥饿阶段结束时采集TEM样品，对应整个实验的第101、105和108天。反应器样品（4 mL）离心（2000 rpm，10 min），弃上清，沉淀重悬于固定液（2%多聚甲醛和2.5%戊二醛，0.1 M PB缓冲液），室温固定2小时；随后用0.1 M PB洗涤4次。固定材料在4 °C下锇化处理3小时，之后用MilliQ水洗涤4次，储存于0.1 M PB缓冲液（4 °C）。样品经4 °C梯度乙醇系列脱水并温和搅拌。
【数据】TEM采样时间：第101、105、108天；样品量：4 mL；离心：2000 rpm，10 min；固定液：2%多聚甲醛+2.5%戊二醛（0.1 M PB），室温2 h；锇化：4 °C，3 h；洗涤：0.1 M PB×4次、MilliQ水×4次
研究结果
3.1 微生物组R3的稳定生长与PHB积累
实验以首个生物量生长阶段（条件化循环）开始，两个PBR以100 mgVSS·L⁻¹的R3接种。第4天达到稳态，生物量约800 mgVSS·L⁻¹（图2A）。平均比生长速率为0.52 d⁻¹（表2），高于相似培养条件下集胞藻纯培养的数值。然而，N完全耗尽耗时18天（图2B），原因可能是P限制——P维持在较低水平（0.1 mgP·L⁻¹）以利于蓝藻而非绿藻生长。此时进入积累阶段，添加600 mg乙酸·L⁻¹并用不透明PVC管包裹PBR。饥饿阶段维持14天以跟踪PHB合成的时间进程。此阶段生物量浓度保持恒定（图2A）。值得注意的是，尽管营养存在不利于生物聚合物积累，生物量在生长阶段仍合成了11% dcw的PHB。此前研究也报道过生长中的集胞藻细胞具有显著的PHA合酶活性。生物聚合物含量在7天内从11% dcw增至27% dcw并达峰值；此后PHB产量缓慢下降，第14天（积累阶段结束）时为21% dcw（图2A）。此期间生物量消耗了添加的600 mg乙酸·L⁻¹中的470 mg·L⁻¹（图2C）。积累阶段14天后，进行生物量排空并补充新鲜BG-11培养基以开始新一轮循环（重复1）。
后续生长阶段（重复1、2、3）旨在筛选PHB生产者。此筛选之所以可行，是因为培养基中未添加外源底物（碳源），系统仅依赖pH控制注入的CO₂维持运行。在此条件下，蓝藻主要利用储存化合物（如PHB）作为碳源。为缩短生长阶段，重复实验的N浓度降至25 mg·L⁻¹。这一调整未妨碍生物量增长——生物量在7天内达到平均近800 mgVSS·L⁻¹（图2A），足以进入积累步骤。重复1–3中生物量平均生长速率为0.17 d⁻¹（表2），比条件化循环首次生长慢3倍。该差异可归因于较低的初始生物量浓度（100 mgVSS·L⁻¹ vs. 400 mgVSS·L⁻¹）、条件化循环中存在外源IC（碳酸氢盐）以及更高的N浓度（50 mg·L⁻¹ vs. 25 mg·L⁻¹）。
重复1、2、3的PHB产量在乙酸补充和14天黑暗后增加，于积累阶段第4天达峰，平均为28% dcw PHB，对应约16 mgPHB·L⁻¹·d⁻¹的平均体积产率（表2）。峰值后PHB含量下降但在积累阶段剩余时间内保持相对恒定（约24% dcw PHB）。
pH可有效追踪生物量活性。条件化周期生长阶段（初始添加100 mgIC·L⁻¹碳酸氢盐）中，因光合作用和细胞呼吸，pH波动可预期——白天上升、夜间下降。pH达设定值（8.5）时，PBR注入CO₂以维持目标范围。条件化循环起始时有100 mgIC·L⁻¹，而重复1–3未添加碳酸氢盐。条件化周期中可用的IC促成更多细胞生长，因此pH上升更快，pH控制导致更多CO₂供应（图4A）。重复1–3中pH上升较慢，可能归因于生长阶段PHB消耗（图4B）。异养培养的pH趋势难以与此比较，因为后者常监测并控制pH，且生长阶段（异养培养中称"饥饿期"）的pH曲线极少报道。
【数据】条件化循环：接种100 mgVSS·L⁻¹，第4天达约800 mgVSS·L⁻¹，μ=0.52 d⁻¹，N耗尽18天，PHB峰值27% dcw（第7天），第14天21% dcw，乙酸消耗470/600 mg·L⁻¹；重复1–3：接种约400 mgVSS·L⁻¹，7天达约800 mgVSS·L⁻¹，μ=0.17 d⁻¹，PHB峰值28% dcw（第4天），产率约16 mgPHB·L⁻¹·d⁻¹，积累期余下时间约24% dcw
3.2 绿藻的存在削弱了PHB产量
将上述相同方法应用于两个以UP接种的PBR——UP为富含聚球藻属和绿藻的微生物组。条件化周期中，N（50 mgN·L⁻¹）在25天内完全消耗，生物量浓度约550 mgVSS·L⁻¹（图2B），平均比生长速率0.07 d⁻¹（表2），相对低于富含蓝藻的R3。后续生长阶段（重复1、2、3）未添加碳酸氢盐以促进PHB生产者生长。实验过程中绿藻逐渐增多，导致蓝藻在微生物组种群中的比例下降。绿藻能在N饥饿和黑暗条件下以淀粉或三酰甘油形式积累乙酸作为碳储存化合物，因此PBR中这些微生物的丰度可能增加——因为在积累阶段（无N、无光）它们能储存添加的乙酸，与蓝藻竞争该底物，并在后续生长阶段用作碳源。此外，绿藻还能在从阶段i转换到阶段i+1时利用PBR中残留的乙酸。条件化循环积累阶段14天后约150 mg乙酸·L⁻¹残留（图2D），这可能解释了重复1中绿藻大量增加的原因。其比例从条件化循环结束时的14%增至重复1结束时的75%，并在剩余实验中保持恒定。
PHB产量方面，与R3在第4天达峰不同，UP呈现截然不同的趋势。PHB在整个14天积累阶段持续增加，分别在条件化循环和重复1结束时达到最大值7%和8% dcw PHB（3和4 mgPHB·L⁻¹·d⁻¹）。此后，重复2和3中PHB积累骤降，仅检出2% dcw PHB，产率<1 mgPHB·L⁻¹·d⁻¹。微生物组间PHB产量的差异及其骤降与微生物组组成明确相关。显微镜观察显示，重复1后UP中绿藻大量存在，而R3生物量中几乎检测不到此类微生物（图3A-B）。这些发现表明，微藻的存在削弱了微生物组的PHB生产潜力，因为绿藻不产生PHB。
【数据】UP条件化周期：N耗尽25天，生物量约550 mgVSS·L⁻¹，μ=0.07 d⁻¹，PHB峰值7% dcw（3 mgPHB·L⁻¹·d⁻¹）；重复1：PHB峰值8% dcw（4 mgPHB·L⁻¹·d⁻¹）；重复2–3：PHB仅2% dcw（<1 mgPHB·L⁻¹·d⁻¹）；绿藻比例：14%→75%（条件化→重复1结束）；残留乙酸：约150 mg·L⁻¹
3.3 蓝藻微生物组的稳健性支撑高PHB积累
每个循环（条件化、重复1–3）结束时进行显微镜观察以评估微生物组组成。R3的结果显示种群保持稳定——蓝藻在整个实验期间占主导地位。
【数据】观察时间点：每个循环结束时；微生物组R3：蓝藻持续主导（原文未详述具体百分比）
讨论与解读
蓝藻纯培养的PHB合成研究已充分证明其作为生物聚合物生产者的潜力，但产量仍难满足以石油基塑料为主导的市场需求。本研究证明了利用富含蓝藻的微生物组连续合成PHB的可行性——该微生物培养体系包含多种蓝藻菌株和微生物，其中蓝藻驱动PHB生产过程，通过重复的生物量生长和PHB积累阶段实现。若干关键因素促成了本方法的成功：其一，微生物组组成对维持PHB合成至关重要，作为主要PHB生产者的蓝藻需在培养中占据优势地位，这一策略性控制使PHB含量达25–28% dcw，位居所研究群落中蓝藻（集胞藻属和聚球藻属）记录的最高值之列。
编译者解读：本研究以混合微生物组替代纯种培养，规避了无菌操作的工业化瓶颈，是合成生物学"去纯种化"思路的有益尝试。其核心价值在于证明了非无菌条件下光养微生物组可稳定运行108天并维持高产，这对降低PHB生产成本具有现实意义。然而，微生物组组成的不可控性（如UP中绿藻反超导致产量骤降）仍是规模化应用的主要风险。未来若能将合成生物学工具（如基因编辑增强PHA合酶表达或抑制碳分流至糖原）引入混合培养体系，或可进一步提升产量与稳定性。
参考来源
Altamira-Algarra B, et al. Bioplastic production by harnessing cyanobacteria-rich microbiomes for long-term synthesis. Science of The Total Environment, 2024. DOI: 10.1016/j.scitotenv.2024.176136
DOI: 10.1016/j.scitotenv.2024.176136