来源：Identification and heterologous expression of an isoquinolinequinone biosynthetic gene cluster from Streptomyces albus J1074（Biochemical and Biophysical Research Communication）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
异喹啉醌类天然产物在微生物中罕见报道，其生物合成机制长期未知。本研究从一株具有抗金黄色葡萄球菌活性的白色链霉菌J1074接合子中分离到三种异喹啉醌化合物，通过基因组挖掘锁定候选基因簇mt4，并在天蓝色链霉菌M1146中异源表达证实其功能。研究揭示了一条新的含氮杂环天然产物生物合成途径。
研究背景
微生物是天然产物的重要资源，许多微生物天然产物及其衍生物已被用作药物发现的先导化合物。然而，在现有实验室条件下，超过99%的环境微生物无法培养，且即使在可培养微生物中，多数天然产物生物合成基因簇处于沉默状态，导致大部分微生物天然产物难以被发现。通过宏基因组学和基因组挖掘策略，研究者已从不可培养或可培养微生物中发现了结构新颖的化合物和新的生物合成途径。宏基因组学方法分为序列导向和表型导向两种策略：前者利用保守基因探针从宏基因组文库中鉴定生物合成基因簇，后者通过区分表型从文库中筛选阳性克隆。相比序列导向策略，表型导向策略更有可能发现全新生物合成途径。此外，测序技术的发展使数千个微生物基因组完成测序，为发现新的天然产物生物合成途径提供了便利。
异喹啉醌类化合物此前仅从海洋链霉菌中分离获得，近期在白色链霉菌J1074中也有发现，但其在微生物中的生物合成机制一直未见报道。本研究旨在通过基因组挖掘和异源表达揭示该类化合物的生物合成基因簇。
研究方法
2.1 土壤宏基因组文库的构建与功能筛选
采用中国四川省采集的土壤样品（N29°34′，E103°20′）中的环境DNA（eDNA）构建宏基因组文库，方法参照前期报道。简要流程如下：提取eDNA并进行末端补平；将末端补平的eDNA与经EcoRV酶切的pJTU2554载体连接；连接混合物在16°C孵育16小时，经λ噬菌体包装提取物包装后，将包装DNA转染至大肠杆菌JTU007/pUZ8002中，构建宏基因组文库。文库中的克隆通过接合转移转入白色链霉菌J1074，操作参照前期报道方案。接合子接种于新鲜ISP4琼脂平板，30°C培养7天，然后在平板上覆盖含有金黄色葡萄球菌的软琼脂LB培养基。37°C过夜培养后观察抑菌圈。
【数据】土壤样品坐标：N29°34′，E103°20′；连接温度：16°C；连接时间：16h；培养温度：30°C；培养时间：7天；检测菌株：金黄色葡萄球菌；37°C过夜培养
2.2 阳性接合子中异喹啉醌类化合物的发酵与分离
取10微升阳性接合子孢子接种于250 mL三角瓶中的50 mL R5A培养基中，30°C摇床培养3天。随后，将20 mL R5A培养物接种至含有5% HP-20树脂的200 mL ISP4液体培养基中，于1 L三角瓶中30°C培养12天。收集ISP4培养物中的HP-20树脂，用甲醇洗涤以洗脱代谢产物。代谢产物经硅胶柱色谱分离，使用CH2Cl2:MeOH梯度洗脱。化合物1、2和3分别以100:3、100:2和100:3的CH2Cl2:MeOH比例从柱上洗脱。化合物经半制备HPLC（4 mL/min）纯化，使用30%或50%甲醇等度洗脱50分钟。纯化化合物的结构通过高分辨电喷雾电离质谱（HRESIMS）和NMR确定。化合物1的分子式经HRESIMS确定为C10H8N2O2（[M+H]，m/z 189.0663，计算值189.0664）。化合物2的分子式确定为C12H12N2O2（[M+H]，m/z 217.0976，计算值217.0977）。化合物3的分子式确定为C11H10N2O2（[M+H]，m/z 203.0819，计算值203.0820）。
【数据】孢子接种量：10 μL；R5A培养基体积：50 mL；摇瓶体积：250 mL；培养温度：30°C；培养时间：3天；ISP4接种量：20 mL；ISP4体积：200 mL；HP-20树脂浓度：5%；培养时间：12天；摇瓶体积：1 L；洗脱剂：CH2Cl2:MeOH（100:3、100:2、100:3）；HPLC流速：4 mL/min；甲醇浓度：30%或50%；洗脱时间：50 min；化合物1分子式：C10H8N2O2（[M+H] m/z 189.0663）；化合物2分子式：C12H12N2O2（[M+H] m/z 217.0976）；化合物3分子式：C11H10N2O2（[M+H] m/z 203.0819）
2.3 白色链霉菌J1074基因组柯斯米德文库的构建及mt4基因簇的筛选
白色链霉菌J1074菌株在TSB培养基（胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3 g/L、葡萄糖2.5 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO4 2.5 g/L）中30°C培养3天，离心收集菌体。白色链霉菌J1074基因组DNA按前期报道方法提取，并通过机械方法随机打断。20–40 kb的基因组DNA片段经胶回收并末端补平（Epicentre公司，夏洛特，美国）。末端补平的DNA按上述方法以大肠杆菌EPI100为宿主进行文库构建。白色链霉菌J1074文库以引物mt4YZ2S（5′-GCCGCGTCGTAGTGGCTGAT-3′）和mt4YZ2as（5′-TGGTCGCCTACTTCGGTCTGG-3′）进行PCR筛选。PCR条件如下：预变性（98°C，2 min）；变性（95°C，2 min）；10个循环（95°C，40 s；65°C，40 s；72°C，54 s），每个循环退火温度降低1°C；30个循环（95°C，40 s；55°C，40 s；72°C，54 s）；最终延伸（72°C，10 min）。通过末端测序鉴定含有完整mt4基因簇的克隆（Cmt4）。
【数据】TSB培养基成分：胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3 g/L、葡萄糖2.5 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO4 2.5 g/L；培养温度：30°C；培养时间：3天；DNA片段大小：20–40 kb；PCR预变性：98°C 2 min；变性：95°C 2 min；10个循环（95°C 40 s；65°C 40 s；72°C 54 s，每循环退火温度降1°C）；30个循环（95°C 40 s；55°C 40 s；72°C 54 s）；最终延伸：72°C 10 min
2.4 mt4在天蓝色链霉菌M1146中的异源表达
将Cmt4接合转移至天蓝色链霉菌M1146，获得3个阳性接合子，按上述方法发酵。随后，发酵提取物通过HPLC和LC-MS分析，使用80:20 H2O:MeOH至100% MeOH的线性梯度洗脱50分钟，流速1 mL/min。
【数据】阳性接合子数量：3个；HPLC/LC-MS梯度：80:20 H2O:MeOH至100% MeOH；洗脱时间：50 min；流速：1 mL/min
研究结果
3.1 土壤宏基因组文库的构建与功能筛选
利用链霉菌-大肠杆菌穿梭载体pJTU2554在大肠杆菌JTU007/pUZ8002中构建了土壤宏基因组文库。该文库的柯斯米德DNA可直接从大肠杆菌JTU007/pUZ8002接合转移至链霉菌，便于功能宏基因组学筛选。获得一株对金黄色葡萄球菌具有生物活性的接合子（EM133-白色链霉菌J1074），并进一步在ISP4培养基中发酵。以含有空载体pJTU2554的白色链霉菌J1074为阴性对照，EM133-白色链霉菌J1074发酵提取物仍表现出对金黄色葡萄球菌的强生物活性，但HPLC未检测到特异性峰（图S1）。由于阴性对照无抗菌活性，研究者采用活性导向分离方法从EM133-白色链霉菌J1074中纯化生物活性化合物。
【数据】阴性对照：白色链霉菌J1074/pJTU2554；活性检测：对金黄色葡萄球菌有抑菌活性；HPLC结果：未见特异性峰
3.2 EM133-白色链霉菌J1074中异喹啉醌类化合物的分离与结构鉴定
以抗菌活性为导向，从EM133-白色链霉菌J1074发酵提取物中分离到三种化合物，结构通过NMR（表1）和HRESIMS确定。结构鉴定显示三种化合物均为异喹啉醌类化合物1–3（图1）。
化合物1的13C和DEPT NMR谱显示10个碳信号，包括5个季碳（δC 123.9, 181.2, 148.8, 181.0, 139.2）、4个烯烃次甲基（δC 148.0, 156.2, 119.0, 101.3）和1个甲基（δC 29.2）。1H谱显示6个质子信号，包括4个烯烃质子信号（δH 9.29, 9.04, 7.94, 5.85）、1个甲基信号（δH 2.99）和1个氨基质子信号（δH 6.10）。化合物1的13C和1H谱与caulibugulone A一致。
化合物2的13C NMR谱显示12个信号，包括7个季碳（δC 167.4, 131.9, 135.2, 185.1, 147.7, 181.9, 123.4）、2个烯烃次甲基（δC 145.1, 103.3）和3个甲基（δC 16.0, 24.7, 29.0）。1H谱显示6个信号，包括2个烯烃质子信号（δH 5.73, 9.04）、1个氨基质子信号（δH 5.83）和3个甲基信号（δH 2.94, 2.76, 2.71）。化合物2的1H和13C数据与前期研究中从海洋链霉菌Mei37来源的mansouramycin A一致。
由于化合物3的量较少，未能观察到全部13C NMR信号，其13C和1H谱与化合物2高度相似。1H谱观察到6个信号，包括3个烯烃质子信号（δH 9.16, 7.80, 5.81）、1个氨基质子信号（δH 6.11）和2个甲基信号（δH 2.98, 2.74）。将化合物3的1H谱数据与化合物2及海洋链霉菌来源的7-甲氨基-3-甲基异喹啉-5,8-二酮比较，可确定化合物3的结构。
【数据】化合物1分子式：C10H8N2O2；化合物2分子式：C12H12N2O2；化合物3分子式：C11H10N2O2；化合物1碳信号数：10；化合物2碳信号数：12；化合物3 1H信号数：6
3.3 白色链霉菌J1074的基因组挖掘及mt4基因簇的鉴定
异喹啉醌类化合物此前从海洋链霉菌菌株中分离获得，近期在白色链霉菌J1074中也有发现。为探究这些化合物是来源于eDNA还是由白色链霉菌J1074中的基因激活产生，研究者对整合到白色链霉菌J1074接合子基因组中的eDNA进行了测序。然而，eDNA序列与化合物之间未显示关联。因此，推测这些化合物应来源于白色链霉菌J1074宿主基因组中的生物合成基因。基于结构分析和前期报道，化合物的碳骨架可能来源于两种氨基酸（如色氨酸和苏氨酸）之间的缩合，或以色氨酸为起始单元，随后进行甲基化、环化和氧化还原等修饰步骤。研究者查阅了白色链霉菌J1074基因组（NZ_DS999645.1），未发现与非核糖体肽合成酶（NRPS）相关的基因簇——NRPS可催化两个合适氨基酸之间的缩合产生异喹啉醌类化合物。然而，研究者鉴定到一个含有色氨酸修饰相关基因（色氨酸双加氧酶基因）以及N-甲基转移酶、氧化还原酶和羧化酶基因的基因簇（mt4，1784487–1798502），与化合物生物合成的后续修饰步骤吻合。为确认该基因簇的功能，研究者将其在天蓝色链霉菌M1146中进行异源表达。
【数据】mt4基因簇位置：1784487–1798502；基因组登录号：NZ_DS999645.1；未发现NRPS相关基因簇
3.4 携带mt4基因簇的柯斯米德克隆筛选及mt4在天蓝色链霉菌M1146中的异源表达
构建了含有50000个克隆的白色链霉菌J1074基因组文库，通过PCR筛选获得携带完整mt4基因簇的阳性柯斯米德。随后将该柯斯米德整合至天蓝色链霉菌M1146中，阳性接合子在ISP4培养基中发酵。发酵提取物通过HPLC和LC-MS分析（图2）。
HPLC和LC-MS结果显示，所有接合子均能产生与EM133-白色链霉菌J1074相同的化合物。由此证实该基因簇负责异喹啉醌类化合物的生物合成。
【数据】基因组文库克隆数：50000；发酵培养基：ISP4；检测方法：HPLC和LC-MS；接合子均产生相同化合物
3.5 mt4基因簇中的基因组成
该基因簇包含12个基因（表S1），预测编码两个色氨酸2,3-双加氧酶（mt4I、mt4K）、两个氧化还原酶（mt4C、mt4H）、一个芳香族L-氨基酸脱羧酶（mt4D）、一个MFS转运蛋白（mt4A）、一个ATP-grasp结构域蛋白（mt4B）、一个甲基转移酶（mt4E）、一个犬尿氨酸甲酰胺酶（mt4F）、一个支链氨基酸转氨酶（mt4G）、一个半胱氨酸脱硫酶（mt4J）、一个生物素羧化酶（mt4L）和一个假定蛋白（mt4M）。
【数据】基因总数：12个；编码酶类：色氨酸2,3-双加氧酶×2、氧化还原酶×2、脱羧酶×1、甲基转移酶×1、犬尿氨酸甲酰胺酶×1、转氨酶×1、半胱氨酸脱硫酶×1、生物素羧化酶×1、假定蛋白×1
讨论与解读
异喹啉醌类化合物此前仅从海洋链霉菌菌株中分离获得，近期在白色链霉菌J1074中也有发现，但其在微生物中的生物合成机制一直未知。本研究通过基因组挖掘从白色链霉菌J1074中鉴定了异喹啉醌类化合物的生物合成基因簇，并通过在天蓝色链霉菌M1146中的异源表达证实了该基因簇的功能。在异喹啉醌类化合物的生物合成途径中，推测的6-羟基色氨酸起始单元经mt4K、mt4F、mt4E、mt4H和mt4L催化形成3-甲酰胺水杨酸类似物。随后，羧酸-胺连接酶mt4B催化3-甲酰胺水杨酸类似物与半胱氨酸之间的缩合，再由氧化还原酶（mt4C、mt4D和mt4J）催化氧化还原和环化反应形成异喹啉环。mt4E负责生物合成过程中的甲基转移（图3）。
含氮杂环小分子具有多种重要的药用生物活性，59%的FDA批准小分子药物含有氮杂环。异喹啉醌类化合物是自然界中罕见的化合物，仅有少数报道描述了从细菌中发现该类化合物。本研究通过基因组挖掘鉴定了负责异喹啉醌类化合物生物合成的基因簇，并通过异源表达证实了基因簇的功能。
编译者解读
本研究采用"表型导向宏基因组筛选+基因组挖掘+异源表达"的组合策略，从土壤宏基因组接合子出发，最终将活性化合物的产生溯源至宿主白色链霉菌J1074自身的隐性基因簇。这一路径提示：在宏基因组筛选中出现"阳性接合子"时，化合物来源未必是外源eDNA，宿主背景基因簇的激活同样值得关注。异源表达验证策略简洁有力——仅需一个柯斯米德克隆即可在异源宿主中重构完整生物合成途径，避免了冗长的基因敲除验证。该工作为自然界中稀有含氮杂环天然产物的生物合成机制研究提供了新案例，也为后续通过组合生物合成改造异喹啉醌类化合物结构奠定了基础。
参考来源
Chai S. Identification and heterologous expression of an isoquinolinequinone biosynthetic gene cluster from Streptomyces albus J1074. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2021. DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.12.093
DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.12.093