来源：Discovery and biosynthetic pathway analysis of new 2-hydroxyphenylthiazoline natural products from a shrimp-associated Streptomyces ardesiacus SCSIO XS006（Tetrahedron）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
抗生素耐药性问题日益严峻，从海洋微生物中寻找新结构天然产物成为研究热点。本研究从西沙群岛虾类样本中分离到一株链霉菌 Streptomyces ardesiacus SCSIO XS006，从其发酵产物中获得9个2-羟基苯基噻唑啉类化合物，其中4个为新化合物。研究团队完成了菌株全基因组测序，定位了负责该类化合物生物合成的基因簇 sar，并提出了合理的生物合成途径。抗菌活性测试显示化合物2对白念珠菌临床株有抑制作用，化合物5对多种耐药菌具有抗菌活性。
研究背景
天然产物尤其是微生物次生代谢产物，长期以来是抗生素的重要来源。然而，随着抗生素耐药性问题的加剧，现有药物疗效不断下降，从尚未充分开发的海洋微生物中寻找新型抗生素已成为重要研究方向。本研究团队此前已从深海来源的稀有放线菌中发现了具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐多药粪肠球菌活性的antarmycin A，以及新型抗感染聚酮类化合物neoabyssomicins A和C。在本研究中，团队发现一株虾共附生链霉菌SCSIO XS006的发酵提取物对耐药表皮葡萄球菌和粪肠球菌具有抑菌活性，HPLC-DAD-UV分析显示该提取物中含有多个紫外吸收特征相似的化合物，提示可能存在系列结构类似物。通过大规模发酵和活性追踪分离，最终获得9个2-羟基苯基噻唑啉衍生物。
研究方法
4.1 通用实验条件
紫外光谱使用Shimadzu UV-2600光谱仪在甲醇中测定。ECD光谱使用Applied Photophysics Limited chirascan CD光谱仪测定。一维和二维核磁共振谱（HSQC、HMBC、NOESY和COSY）使用Brucker Avance 500或700 MHz谱仪在CDCl₃或CD₃OD中测定。高分辨质谱（HRESIMS）使用Bruker MaXis四极杆飞行时间质谱仪测定。半制备高效液相色谱使用HITACHI Primaide系统，配备1110等度泵和1430二极管阵列检测器，采用YMC Pack ODS-A色谱柱（250 × 10 mm，5 μm）。柱色谱使用硅胶（100–200目和200–300目，烟台江友硅胶开发有限公司）和Sephadex LH-20（GE Healthcare公司）。所有化学试剂和溶剂均为分析纯或色谱纯。PCR反应试剂和DNA购自Takara公司（中国大连）和Trans Gene公司（中国北京）。本工作中使用的所有引物和试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
【数据】仪器：UV-2600光谱仪、chirascan CD光谱仪、Brucker Avance 500/700谱仪、MaXis Q-TOF质谱仪；色谱柱：YMC Pack ODS-A（250 × 10 mm，5 μm）；试剂来源：Takara、Trans Gene、上海生工
4.2 菌株材料
菌株SCSIO XS006分离自中国西沙群岛采集的虾样本。采集的样本用无菌海水仔细冲洗，然后用无菌研钵和研杵匀浆。将匀浆液等分涂布于2216E和AIA琼脂培养基平板（含0.2%甘露醇、0.01% L-天冬酰胺、0.05% K₂HPO₄、0.01% MgSO₄·7H₂O、0.01% FeSO₄·7H₂O、0.2% CaCO₃、2%琼脂和3%海盐，pH 7.0–7.4），分别添加50 μg/mL制霉菌素和萘啶酸。在28°C培养3天后，挑取单菌落并连续纯化。基于形态学分析和16S rRNA基因序列系统发育分析（使用MEGA 7.0.14软件），将该菌株鉴定为 Streptomyces ardesiacus SCSIO XS006。该菌株保藏于中国科学院南海海洋研究所RNAM海洋微生物中心（中国广州）。野生型 S. ardesiacus SCSIO XS006及其衍生突变株在MS琼脂平板上28°C培养用于产孢和接合转移。E. coli DH5α用于DNA克隆和测序。E. coli ET12567/pUZ8002用于通过接合转移将DNA从大肠杆菌转入链霉菌。用于基因失活的穿梭载体pYH7衍生自pHZ1358。所有大肠杆菌菌株在液体Luria-Bertani（LB）培养基中37°C或28°C、200 rpm条件下培养。本研究中抗生素的最终浓度分别为：阿普拉霉素（Apr，100 μg/mL）、卡那霉素（Kan，50 μg/mL）、氯霉素（CM，25 μg/mL）和甲氧苄啶（TMP，50 μg/mL）。
【数据】菌株：S. ardesiacus SCSIO XS006；培养基：2216E、AIA、MS、LB；温度：28°C（链霉菌）、37°C/28°C（大肠杆菌）；转速：200 rpm；抗生素浓度：Apr 100 μg/mL、Kan 50 μg/mL、CM 25 μg/mL、TMP 50 μg/mL；时间：3 d
4.3 菌株SCSIO XS006中化合物1–9的大规模发酵、分离和结构鉴定
Streptomyces ardesiacus SCSIO XS006在MS琼脂平板（2%大豆粉、2% D-甘露醇和2%琼脂，pH 7.2–7.4）上28°C培养5天。将孢子和菌丝体接种到每个250 mL锥形瓶（含50 mL HMT液体培养基：1%鱼粉、0.5%酵母提取物粉末、2%甘油三酯和3%粗海盐，pH 7.2，0.05% CaCO₃）中，然后在旋转摇床上（28°C，200 rpm）培养48小时。培养48小时后，将25 mL种子培养液转移至含200 mL HMT培养基的1 L锥形瓶中。锥形瓶在旋转摇床上（28°C，200 rpm）培养7天。7天后，约25 L发酵培养液离心（3900 rpm，10 min）分离上清液和菌丝体。上清液和菌丝体分别用丁酮和丙酮萃取四次。根据HPLC分析将上清液和菌丝体的提取物合并，命名为残渣A。残渣A经正相硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇混合液（100/0、98/2、96/4、94/6、92/8、90/10、85/15、80/20、50/50、0/100，v/v，每个馏分2 L）梯度洗脱，得到10个馏分A1–A10。馏分A2经正相硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯混合液（100/0、98/2、95/5、93/7、90/10、88/12、85/15、80/20、75/25、70/30、50/50、0/100，v/v）梯度洗脱，得到12个馏分B1–B12。馏分B7经半制备HPLC进一步纯化，使用35% B等度系统（A：含0.1%乙酸的H₂O；B：CH₃CN），流速2.5 mL/min，运行30 min，得到pulicatin B（2，5.7 mg，t_R = 11.6 min）和aerugine（5，6.2 mg，t_R = 10.0 min）。馏分B10经半制备HPLC纯化，使用ODS色谱柱，35% B等度洗脱（A：含0.1%乙酸的H₂O；B：CH₃CN），流速2.5 mL/min，运行30 min，得到pulicatin G（4，5.3 mg，t_R = 12.6 min）。馏分A1经正相硅胶柱色谱，用石油醚-乙酸乙酯混合液（100/0、99/1、98/2、97/3、96/4、95/5、93/7、91/9、88/12、85/15、80/20、70/30、50/50、0/100，v/v）梯度洗脱，得到14个馏分C1–C14。馏分C3和C4合并后上Sephadex LH-20柱，用氯仿-甲醇混合液（1:1，v/v）洗脱，得到馏分D1–D16。馏分D7–D10合并后经半制备HPLC纯化，使用ODS色谱柱，35% B等度系统（A：含0.1%乙酸的H₂O；B：CH₃CN）洗脱，流速2.5 mL/min，运行30 min，得到pulicatin K（8，3 mg，t_R = 18.8 min）。馏分C5和C6合并后经正相硅胶柱色谱，依次用石油醚-乙酸乙酯混合液（100/0、95/5、90/10、80/20、70/30、60/40、50/50、40/60、30/70、20/80、10/90、0/100，v/v）和乙酸乙酯-甲醇混合液（98/2、95/5、93/7、90/10、85/15、80/20、50/50、0/100，v/v）洗脱，得到20个馏分E1–E20。馏分E7和E8分别经半制备HPLC纯化，使用ODS色谱柱，40% B等度系统（A：含0.1%乙酸的H₂O；B：CH₃CN），流速2.5 mL/min，运行30 min，得到methyl thiazostatin B（1，3.0 mg，t_R = 18.3 min）、methyl thiazostatin A（6，1.5 mg，t_R = 18.5 min）、methyl watasemycin B（7，4.4 mg，t_R = 20.2 min）。馏分E9经半制备HPLC纯化，使用ODS色谱柱，40% B等度系统（A：含0.1%乙酸的H₂O；B：CH₃CN），流速2.5 mL/min，运行30 min，得到pulicatin L（9，2.0 mg，t_R = 20.8 min）。馏分E4经半制备HPLC纯化，使用ODS色谱柱，40% B等度系统（A：含0.1%乙酸的H₂O；B：CH₃CN），流速2.5 mL/min，运行30 min，得到pulicatin D（3，2.6 mg，t_R = 20.9 min）。
【数据】发酵规模：25 L；培养基：MS、HMT；温度：28°C；转速：200 rpm；时间：5 d（MS）、48 h（种子）、7 d（发酵）；离心：3900 rpm，10 min；HPLC流速：2.5 mL/min；化合物产量：2（5.7 mg）、5（6.2 mg）、4（5.3 mg）、8（3 mg）、1（3.0 mg）、6（1.5 mg）、7（4.4 mg）、9（2.0 mg）、3（2.6 mg）
4.4 化合物6–9的理化性质
Methyl thiazostatin A（6）：淡黄色固体；UV（MeOH）λ_max（log ε）250（3.25）、209（3.69）nm；IR（ATR）ν_max 3419、2922、2850、1734、1593、1456、1257、1217、1153、1031、952、754 cm⁻¹；¹H和¹³C NMR波谱数据见表1；（+）-HRESIMS m/z 353.0989 [M + H]⁺（计算值C₁₆H₂₁N₂O₃S₂，353.0988）和[M + Na]⁺（计算值C₁₆H₂₀N₂NaO₃S₂，375.0808）。
Methyl watasemycin B（7）：淡黄色固体；UV（MeOH）λ_max（log ε）252（3.66）、210（4.04）nm；IR（ATR）ν_max 3385、2958、2922、2850、1734、1591、1456、1290、1253、1222、1155、1033、987、821、754 cm⁻¹；¹H和¹³C NMR波谱数据见表1；（+）-HRESIMS m/z 367.1142 [M + H]⁺（计算值C₁₇H₂₃N₂O₃S₂，367.1145）和389.0947 [M + Na]⁺（计算值C₁₇H₂₂N₂NaO₃S₂，389.0964）。
Pulicatin K（8）：淡黄色固体；UV（MeOH）λ_max（log ε）249（3.23）、211（3.59）nm；IR（ATR）ν_max 3373、2958、2927、2852、1732、1622、1595、1489、1456、1282、1155、1033、754 cm⁻¹；¹H和¹³C NMR波谱数据见表1；（+）-HRESIMS m/z 294.1162 [M + H]⁺（计算值C₁₅H₂₀NO₃S，294.1158）和[M + Na]⁺（计算值C₁₅H₁₉NNaO₃S，316.0978）。
Pulicatin L（9）：透明晶体；UV（MeOH）λ_max（log ε）329（3.39）、231（3.27）、203（2.96）nm；IR（ATR）ν_max 3402、2920、2850、1662、1456、1259、1205、1124、1024、802、748、721 cm⁻¹；¹H和¹³C NMR波谱数据见表1。
【数据】化合物6：HRESIMS m/z 353.0989 [M+H]⁺；化合物7：HRESIMS m/z 367.1142 [M+H]⁺；化合物8：HRESIMS m/z 294.1162 [M+H]⁺；化合物9：HRESIMS m/z 260.0740 [M+H]⁺（原文后文数据）；UV吸收峰及IR吸收峰见上述
研究结果
2.1 菌株SCSIO XS006中化合物1–9的分离
菌株SCSIO XS006分离自西沙群岛潮间带采集的虾标本。16S rDNA序列系统发育分析将该菌株鉴定为 Streptomyces ardesiacus。通过28 L规模发酵、萃取以及采用硅胶、Sephadex LH-20和半制备HPLC的色谱纯化，获得化合物1–9。通过综合分析HRESIMS数据以及将其¹H和¹³C NMR波谱数据与文献值进行详细比较，化合物1–5的结构被鉴定为已知代谢物methyl thiazostatin B（1）、pulicatin B（2）、pulicatin D（3）、pulicatin G（4）和aerugine（5）（见图1）。
Methyl thiazostatin A（6）为淡黄色固体。6的HRESIMS分析显示质子化分子离子[M + H]⁺位于m/z 353.0988（计算值C₁₆H₂₁N₂O₃S₂），表明分子式为C₁₆H₂₀N₂O₃S₂，与1相同。6的一维NMR数据与1高度相似，唯6中C-5′、C-4″和C-8″出现轻微低场位移，表明其为1的异构体（表1和表S1）。HSQC、¹H–¹H COSY和HMBC相关性的进一步分析确认6的平面结构与1相同（见图2）。6的相对构型通过分析观察到的NOESY相关性并与1比较确定。6中H-2″与H-8″之间缺乏NOESY相关性（该相关性在methyl thiazostatin B（1）中可观察到），提示6中H-2″和H₃-8″为反式关系（图3）。此外，6中H-4′与H-2″之间的小耦合常数（J = 2.8 Hz）与1中（J = 4.2 Hz）相比更小，加上这些质子间存在NOESY相关性，支持6中H-4′和H-2″为顺式关系。因此，6的相对构型被指定为4′S，2″R，4″S。6的实验ECD光谱在272 nm处显示正Cotton效应，在248和320 nm处显示负Cotton效应，与4′S，2″R，4″S异构体的计算ECD光谱一致（图S1）。由此确定6的绝对构型为4′S，2″R，4″S。
Methyl watasemycin B（7）为淡黄色固体。基于HRESIMS分析确定其分子式为C₁₇H₂₂N₂O₃S₂，显示质子化分子离子[M + H]⁺位于m/z 367.1145（计算值C₁₇H₂₃N₂O₃S₂）。化合物7的分子量比1高14 Da，表明存在一个额外的亚甲基。7的¹H NMR和¹³C NMR谱与1非常相似，主要差异在于1中C-5′处亚甲基信号的缺失，以及出现对应于一个甲基（δ_C 17.62，δ_H 1.28，CH₃-6′）和一个次甲基（δ_C 48.00，δ_H 3.96，CH-5′）的信号（表1和表S1）。该观察结果表明甲基取代在C-5′位，这通过H₃-6′/H-5′/H-4′/H-2″的¹H–¹H COSY相关性以及H₃-6′到C-5′、H-5′到C-2′的HMBC相关性得到确认（图2）。因此，7的平面结构如图2所示。H-4′与H-5′之间观察到的NOESY相关性确认C-2″取代基和C-5′甲基处于顺式关系（图3）。7中H-4′与H-2″之间的大耦合常数（J = 10.0 Hz）以及H₃-6′与H-2″之间的NOESY相关性提示H-4′和H-2″为反式关系（图3）。7中H-2″与H₃-8″之间观察到的NOESY相关性提示它们位于噻唑烷环的β面（图3）。因此，7的相对构型被指定为4′S，5′S，2″S，4″S。7的实验ECD光谱在263 nm处显示正Cotton效应，在223和245 nm处显示负Cotton效应，与4′S，5′S，2″S，4″S异构体的计算ECD光谱一致（图S1）。由此确定7的绝对构型为4′S，5′S，2″S，4″S。
另一个淡黄色固体化合物pulicatin K（8），基于HRESIMS分析（m/z 294.1158 [M + H]⁺）确定分子式为C₁₅H₁₉NO₃S。8的¹H NMR和¹³C NMR谱与5非常相似，区别在于出现了对应于一个酯羰基（δ_C 178.42，C-8′）、一个季碳sp³（δ_C 39.02，C-9′）和三个甲基（δ_C 27.29，δ_H 1.21，CH₃-10′/11′/12′）的额外信号（表1和表S3）。从H₃-10′到C-11′、从H₃-11′到C-9′以及从H₃-12′到C-8′的HMBC相关性支持存在一个2,2-二甲基丙酰基片段。此外，从H₂-6′到C-8′的HMBC相关性提示2,2-二甲基丙酰基片段通过氧原子连接至C-6′（图2）。鉴于8和5来源于相同的生物合成途径，8的绝对立体化学被指定为4′S，这得到8的实验ECD光谱与4′S异构体的计算ECD光谱一致性的支持（图S1）。
Pulicatin L（9）为无色晶体，基于HRESIMS分析确定分子式为C₁₄H₁₃NO₂S，表明有9个不饱和度，显示质子化分子离子[M + H]⁺位于m/z 260.0740（计算值C₁₄H₁₄NO₂S）。9的¹H NMR和¹³C NMR谱与3相似。将9与3的¹H和¹³C NMR数据进行比较，发现与双键共轭的醛基信号消失，出现了对应于一个烯烃（δ_C 133.55，δ_H 7.67，CH-7′；δ_C 129.15，δ_H 6.90，CH-8′）、一个羰基（δ_C 201.47，C-9′）和一个甲基（δ_C 27.75，δ_H 2.43，CH₃-10′）的额外信号（表1和表S2）。H-7′与H-8′的¹H–¹H COSY相关性以及H-8′和H-10′到C-9′的HMBC相关性确认这些新信号归属为α,β-不饱和甲基酮单元。从H-7′到C-4′和C-5′的HMBC相关性表明该α,β-不饱和甲基酮单元连接在C-4′位（图S28）。因此，9的平面结构如图2所示，并通过X射线晶体学分析进一步确认（图4）。
【数据】化合物6：HRESIMS m/z 353.0988 [M+H]⁺；J(H-4′,H-2″) = 2.8 Hz；ECD Cotton效应：272 nm（+）、248 nm（−）、320 nm（−）；化合物7：HRESIMS m/z 367.1145 [M+H]⁺；J(H-4′,H-2″) = 10.0 Hz；ECD Cotton效应：263 nm（+）、223 nm（−）、245 nm（−）；化合物8：HRESIMS m/z 294.1158 [M+H]⁺；化合物9：HRESIMS m/z 260.0740 [M+H]⁺；发酵规模：28 L
2.2 2-羟基苯基噻唑啉生物合成基因簇的鉴定及化合物1–9的推测生物合成途径
为鉴定负责产生2-羟基苯基噻唑啉衍生物（化合物1–9）的生物合成基因簇（BGC），研究团队使用PacBio RS和Illumina平台对 S. ardesiacus SCSIO XS006进行了全基因组测序。SCSIO XS006基因组包含一条7,787,329 bp的线性染色体和一个5196 bp的环状质粒，平均GC含量为72.58%。基因组注释鉴定出6897个蛋白质编码基因，以及18个rRNA和70个tRNA基因。AntiSMASH分析显示SCSIO XS006基因组中编码29个推定BGC，包括7个聚酮合酶（PKS）、4个非核糖体肽合酶（NRPS）、1个非核糖体肽合成酶-聚酮合酶杂合酶（PKS-NRPS）、7个萜烯、2个核糖体合成和翻译后修饰肽（RiPPs）、1个羊毛硫肽和7个其他类别的BGC。在29个预测的BGC中，第7个簇（本文称为 sar）被认为负责化合物1–9的生物合成，因为它与先前报道的2-羟基苯基噻唑啉BGC高度相似，例如负责 Streptomyces venezuelae ATCC 10712中watasemycin生物合成的 sven 簇，以及负责 Pseudomonas aeruginosa PAO1中pyochelin生物合成的 pch 簇（图5）。
【数据】基因组大小：7,787,329 bp（染色体）+ 5196 bp（质粒）；GC含量：72.58%；蛋白质编码基因：6897个；rRNA：18个；tRNA：70个；BGC总数：29个（PKS 7个、NRPS 4个、PKS-NRPS 1个、萜烯 7个、RiPPs 2个、羊毛硫肽 1个、其他 7个）
讨论与解读
本研究从虾共附生链霉菌SCSIO XS006中分离获得9个2-羟基苯基噻唑啉衍生物，其中4个为新化合物。通过NMR、HRESIMS、ECD和单晶X射线衍射等综合分析手段，完整阐明了新化合物的平面结构和绝对构型。研究团队进一步鉴定了负责该类化合物生物合成的基因簇 sar，并提出了合理的生物合成途径。活性测试显示，化合物2对白念珠菌具有抗真菌活性（MIC为64 μg/mL），化合物5对耐甲氧西林表皮葡萄球菌SRH-Sep、耻垢分枝杆菌mc2155和粪肠球菌ATCC 29212具有抗菌活性，MIC分别为64 μg/mL、128 μg/mL和64 μg/mL。
编译者解读：本研究展示了海洋共附生放线菌作为新天然产物来源的潜力——一株菌中同时产出9个结构多样的2-羟基苯基噻唑啉类化合物，体现了微生物次生代谢途径的灵活性。研究将基因组信息与基因失活实验相结合，为理解该类化合物的生物合成提供了遗传学基础。从合成生物学角度看，sar 基因簇的定位为后续异源表达和组合生物合成研究奠定了基础，有望通过途径工程产生更多结构多样的衍生物用于活性筛选。不过，新化合物6–9的抗菌活性未见报道，其生物学功能仍需进一步挖掘。
参考来源
Yuan X. Discovery and biosynthetic pathway analysis of new 2-hydroxyphenylthiazoline natural products from a shrimp-associated Streptomyces ardesiacus SCSIO XS006. Tetrahedron, 2025. DOI: 10.1016/j.tet.2025.134852
DOI: 10.1016/j.tet.2025.134852