来源：Discovery of venediols by activation of a silent type I polyketide biosynthetic gene cluster in Streptomyces venezuelae ATCC 15439（Tetrahedron）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
委内瑞拉链霉菌ATCC 15439基因组中含有超过30个生物合成基因簇，但多数在实验室条件下转录沉默。本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，通过位点特异性插入强组成型启动子kasOp∗激活了一个隐秘的I型聚酮合酶基因簇（ved），成功发现两个新型聚酮代谢产物venediol A（1）和venediol B（2）。结构解析与异源表达结果揭示该模块化聚酮合酶在生物合成过程中存在不寻常的线性缺失现象。
研究背景
链霉菌属是革兰氏阳性细菌，是生产抗生素、杀虫剂、抗肿瘤药物和免疫抑制剂等多种生物活性次级代谢物的优秀细胞工厂。自然界中约三分之二的天然抗生素由链霉菌产生。基因组测序数据显示链霉菌含有丰富的次级代谢物生物合成基因簇（BGCs），但相当比例的BGCs在实验室培养条件下不表达或低表达。因此，激活沉默/隐秘BGCs已成为发现新型次级代谢物的有效策略。
委内瑞拉链霉菌ATCC 15439是次级代谢物的多产菌株，该模式菌株的苦霉素（pikromycin）生物合成系统已被广泛研究，负责产生多种12元和14元大环内酯类抗生素。该实验室此前通过激活由四个生物合成基因（venA−D）组成的沉默BGC，发现了二萜类产物venezuelaenes A和B。本研究在此基础上，进一步探索该菌株中其他沉默基因簇的产物。
研究方法
菌株、质粒、培养基与培养条件
本研究所用全部细菌菌株和质粒列于补充数据表S1。大肠杆菌菌株在37°C条件下于LB琼脂或LB液体培养基中培养。委内瑞拉链霉菌ATCC 15439（首尔国立大学Yeo Joon Yoon教授惠赠）、天蓝色链霉菌M1152（山东大学鞠建华教授惠赠）及其衍生菌株在30°C条件下于甘露醇大豆粉（MS）琼脂培养基（每升含20 g大豆粉、20 g甘露醇、20 g琼脂）上培养，用于产孢和接合转移。2 × YT液体培养基（每升含16 g胰蛋白胨、10 g酵母提取物和5 g NaCl）用于培养链霉菌种子培养物。SCM培养基（每升含15 g可溶性淀粉、20 g大豆胨、0.1 g CaCl₂、1.5 g酵母提取物和10.5 g MOPS，pH 7.2）作为链霉菌次级代谢物生产培养基。液体培养在250 ml摇瓶中装入30 ml培养基振荡培养。添加50 mM MgCl₂和50 mM CaCl₂的MS培养基用于大肠杆菌与链霉菌之间的属间接合转移。根据需要补充以下浓度的抗生素：25 μg ml⁻¹氯霉素、50 μg ml⁻¹卡那霉素、50 μg ml⁻¹安普霉素和25 μg ml⁻¹萘啶酸。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；链霉菌培养温度：30°C；MS培养基：20 g/L大豆粉+20 g/L甘露醇+20 g/L琼脂；2 × YT培养基：16 g/L胰蛋白胨+10 g/L酵母提取物+5 g/L NaCl；SCM培养基：15 g/L可溶性淀粉+20 g/L大豆胨+0.1 g/L CaCl₂+1.5 g/L酵母提取物+10.5 g/L MOPS，pH 7.2；抗生素浓度：氯霉素25 μg/ml、卡那霉素50 μg/ml、安普霉素50 μg/ml、萘啶酸25 μg/ml
材料
所有限制性内切酶购自Thermo Scientific（美国沃尔瑟姆）和Takara（中国大连）。本研究所用化学品和抗生素购自Solarbio（中国北京）、国药化学试剂（中国北京）和Sangon（中国上海），除非另有说明。ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒购自Vazyme（中国南京）。PrimeSTAR Max DNA聚合酶（中国大连）用于PCR扩增DNA片段。T4 DNA聚合酶购自New England Biolaboratory（中国北京）。
【数据】限制性内切酶来源：Thermo Scientific、Takara；克隆试剂盒：ClonExpress Ultra（Vazyme）；DNA聚合酶：PrimeSTAR Max；T4 DNA聚合酶：New England Biolaboratory
DNA测序与生物信息学分析
引物由Sangong（中国青岛）合成。DNA测序由TsingKe（中国青岛）完成。生物合成基因簇的基因注释和功能预测使用NCBI数据库和antiSMASH细菌版（https://secondarymetabolites.org/）进行。蛋白质序列比对使用ClustalW进行，结果由ESPript 3.0输出。DNA序列比对使用DNAman 7.0进行。转录组数据已在前期工作中公开。
【数据】比对软件：ClustalW、ESPript 3.0、DNAman 7.0；数据库：NCBI、antiSMASH细菌版
基因敲除与敲入质粒的构建
用于质粒构建和克隆筛选的所有引物列于补充数据表S2。基因敲除质粒和kasOp∗敲入质粒均源自CRISPR/Cas9基因组编辑质粒pKCcas9dO的改造。
为构建pikAⅠ（5621010–5623029 bp）缺失质粒pKCcas9dP，使用引物PikAⅠgRNA-F和PikAⅠgRNA-R从pKCcas9dO扩增pikAⅠ缺失sgRNA表达盒。使用引物对PikAⅠLA-F/PikAⅠLA-F和PikAⅠRA-F/PikAⅠRA-R分别从委内瑞拉链霉菌基因组DNA扩增pikAⅠ两侧的两个同源臂。
类似地，为构建vedA（8044206–8046225 bp）缺失质粒pKCcas9dVA，使用引物VedAgRNA-F和VedAgRNA-R从pKCcas9dO扩增vedA缺失sgRNA表达盒。使用引物对VedALA-F/VedALA-F和VedARA-F/VedARA-R分别从委内瑞拉链霉菌基因组DNA扩增vedA（8044206–8046225 bp）两侧的两个同源臂。
为构建kasOp∗敲入质粒pKCcas9dOVK，使用引物VedKRNA-F和VedKgRNA-R从pKCcas9dO扩增kasOp∗插入sgRNA表达盒。使用引物对VedKLA-F/VedKLA-R和VedKRA-F/VedKRA-R分别从委内瑞拉链霉菌基因组DNA扩增含有kasOp∗启动子序列的两个同源臂。
上述每个质粒的三个扩增片段使用ClonExpress Ultra一步克隆试剂盒连接到SpeI/HindIII线性化的pKCcas9dO载体上。正确的质粒组装通过DNA测序确认，随后质粒用于转化委内瑞拉链霉菌菌株。
【数据】pikAⅠ缺失区域：5621010–5623029 bp；vedA缺失区域：8044206–8046225 bp；克隆方法：ClonExpress Ultra一步克隆；载体线性化：SpeI/HindIII
携带vedA-C基因质粒的构建
为在天蓝色链霉菌M1152中异源表达vedA-C，使用Red/ET重组工程直接克隆和基因改造ved基因簇。用MauBI消化委内瑞拉链霉菌基因组DNA以释放48 kb的ved基因簇。使用p15A-cm-ved1/2作为含有ved侧翼同源臂的PCR引物，以克隆载体p15A-cm-tetR-tetO-hyg-ccdB为模板，通过PCR扩增获得线性载体p15A-cm。将消化的基因组DNA和带同源臂的线性载体用T4 DNA聚合酶在体外组装。随后，组装产物在室温下脱盐，并与大肠杆菌GB05-dir共电转获得载体p15A-cm-ved。正确转化子在含氯霉素的LB琼脂平板上筛选，p15A-cm-ved载体通过BamHI消化进一步验证（图S13）。
此外，以p15A-apra-kasOp∗-phiC31为模板，p15-Apra-kasOp∗-1/2为含有ved侧翼同源臂的引物，进行PCR扩增获得携带ved侧翼基因同源臂的产物p15-Apra-kasOp∗。然后，将片段p15-Apra-kasOp∗与p15A-cm-ved质粒共电转进入大肠杆菌GB08-red，获得载体p15-Apra-kasOp∗-ved。从含安普霉素的LB琼脂上生长的转化子中制备的p15-Apra-kasOp∗-ved载体通过BamHI消化验证（图S13）。
【数据】ved基因簇大小：48 kb；限制酶：MauBI；组装酶：T4 DNA聚合酶；宿主菌：E. coli GB05-dir、GB08-red；筛选抗生素：氯霉素、安普霉素；验证方法：BamHI消化
重组链霉菌菌株的构建与发酵
通过CRISPR/Cas9技术构建的基因敲除和敲入质粒以及ved异源表达质粒，按照标准链霉菌操作方案，通过属间接合转移从大肠杆菌ET12567/pUZ8002转移至委内瑞拉链霉菌或天蓝色链霉菌M1152。简言之，在30°C孵育14–16小时后，MS平板覆盖萘啶酸和安普霉素，继续孵育直至出现接合子。接合子在含安普霉素的MS平板上划线，通过PCR和DNA测序进行遗传确认（图S14）。随后，正确的委内瑞拉链霉菌重组菌株在37°C培养以在体内丢失CRISPR/Cas9质粒。ved基因簇通过质粒p15A-phiC31-kasOp∗-ved中的PhiC31整合酶插入天蓝色链霉菌M1152基因组，天蓝色链霉菌重组菌株的筛选通过发酵提取物的HPLC和LC-MS分析进行。
对于Sv-1、Sv-2和Sv-3的PCR确认，引物分别为PikAⅠYZ-F/PikAⅠYZ-R、VedKYZ-F/VedKYZ-R和VedAYZ-F/VedAYZ-R；PCR产物的预期长度分别为963、1087和1072 bp（图S14）。
关于重组委内瑞拉链霉菌和天蓝色链霉菌菌株的发酵，将特定菌株的单菌落在MS琼脂上生长4天，接种到2 × YT培养基中，30°C、220 rpm恒温振荡培养36小时，然后将种子培养物以1:10的比例接种到SCM培养基中，30°C、220 rpm恒温振荡培养7天。每个菌株的培养液用等体积乙酸乙酯萃取两次。提取物真空蒸发，N₂干燥后的提取物重新溶解于1 ml甲醇中。链霉菌菌株的代谢产物通过HPLC和LC-MS分析监测。
【数据】接合转移孵育：30°C、14–16 h；质粒丢失温度：37°C；种子培养：2 × YT、30°C、220 rpm、36 h；发酵培养：SCM、30°C、220 rpm、7 d；接种比例：1:10；萃取：等体积乙酸乙酯×2；PCR产物长度：963/1087/1072 bp
Venediols的分离与表征
粗提物的所有HPLC分析使用反相YMC Triart C-18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），在Thermo UltiMate 3000仪器上进行，流动相为含0.1%三氟乙酸的水和乙腈，流速为1 ml/min。使用乙腈在水中的线性梯度程序（0–1 min为10%，2–26 min为10–100%，26–30 min为100%，31–33 min为10%）进行色谱分离。
【数据】色谱柱：YMC Triart C-18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流速：1 ml/min；流动相：水/乙腈+0.1%三氟乙酸；梯度：10%→100%乙腈，26 min线性梯度
研究结果
我们首先使用antiSMASH细菌版6.0软件对委内瑞拉链霉菌ATCC 15439的全基因组（GenBank登录号：CP013129）进行了全面分析。基因组分析表明该菌株至少含有32个BGCs，推测负责聚酮化合物、非核糖体肽、萜类和其他次级代谢物的生物合成（表S3）。在这些BGCs中，一个30 kb的BGC（ved，表S4）包含三个预测的开放阅读框（ORFs：vedA、vedB和vedC），推测编码三个I型PKSs（图2）。该BGC与链霉菌MSC090213JE08的streptazone E BGC类似（图S1）。然而，转录组学分析表明，在 tested 培养条件下，这三个推定PKS基因均沉默（表S5）。由于vedA−C紧邻的上游和下游基因均以不同显著程度转录，我们推断ved基因簇可能仅包含这三个PKS基因。
为研究ved的产物，我们选择通过插入强启动子驱动vedA−C表达来原位激活该BGC。由于委内瑞拉链霉菌ATCC 15439产生多种苦霉素相关大环内酯（图1），这些大环内酯可能消耗大量PKS前体和构建单元，并使新化合物的检测复杂化，我们首先使用基于CRISPR/Cas9的敲除技术，通过删除第一个PKS基因pikAⅠ（8,044,206–8,046,225 bp）的必要部分来灭活苦霉素生物合成途径。如预期所料，在SCM发酵培养基中发酵的pikAⅠ失活菌株Sv-1的HPLC分析显示，其代谢物谱比野生型菌株（Sv-WT）简化，完全丧失了产生12元和14元大环内酯的能力（图3）。
接下来，我们将强组成型启动子kasOp∗（常用于上调链霉菌基因表达）插入Sv-1中vedA基因起始密码子上游，获得重组菌株Sv-2。如预期所料，Sv-2发酵提取物的HPLC分析显示一个新峰，最大吸收峰在227 nm（图3）。为确认该新峰源于ved基因簇的激活，我们在Sv-2中删除vedA的2,020 bp片段以中断该生物合成系统。结果显示，vedA失活突变株Sv-3的代谢物谱恢复为Sv-WT的状态（图3），明确表明ved在启动子工程后被成功激活。
为分离ved相关产物，Sv-2在SCM培养基中30°C振荡培养7天。通过制备型C18反相HPLC从Sv-2培养液的有机提取物中纯化新产物峰。基于HR-ESI-MS分析，分子式被确定为C₁₃H₂₂O₃，给出[M+Na]⁺准分子离子峰m/z 249.1467，提示三个不饱和度。
然而，¹H和¹³C NMR谱（表1）显示存在四个甲基、八个sp³杂化亚甲基（其中两个连氧）、八个sp²杂化次甲基和四个sp³杂化次甲基（其中两个连氧）、一个sp²杂化非质子化羰基碳和一个sp³杂化非质子化连氧碳。对1D和2D NMR谱的仔细分析揭示其本质为不可分离混合物，由两个组分1和2组成。COSY相关显示1和2中从H-1到H-7以及从H-9经H-13到H-12的自旋系统。对于化合物1，两个片段通过H-6、H-7、H-9和H-10到C-8的HMBC相关连接。同时，H-6、H-7、H-9、H-10和H-12到C-8的HMBC相关确认了化合物2的推定结构（图4）。值得注意的是，含有酮基的化合物1显示出形成分子内半缩醛生成2的趋势。根据结构特征和生物来源，我们将1和2分别命名为venediol A和venediol B。
为确定1的相对构型，进行了基于J的构型分析（JBCA）。H-10和H-11的大耦合常数（³J H-10,H-11 = 7.9 Hz）揭示Newman投影中两个质子呈反式排列，H-9和H-10到H-13的NOE交叉峰确立了Fisher投影中C-10和C-11的赤式构型，从而将C-10和C-11的相对构型指定为10R∗和11S∗（图S9）。为进一步确认C-10和C-11立体中心的相对构型，基于DP4+方案计算了两个可能异构体（1a和1b，图S10）的质子和碳数据。计算数据与实验值的统计比较表明异构体1b为等效结构，概率为100%，与JBCA结果一致。2的相对构型通过DP4+概率分析类似地指定为8R∗、10R∗和11S∗，实验NMR数据与异构体2b（图S10）的计算数据匹配良好（100%）。
此外，通过venediol PKSs中酮还原酶（KR）结构域的生物信息学分析推导了1和2的绝对构型。多重蛋白比对显示所有KR结构域（KR1、KR2、KR3和KR5）均含有典型的"LDD"基序，因此被分类为B型KRs，推测产生R构型的羟基（图5C）。该分析强烈表明venediols的C-10羟基应采用R构型。综合以上结果，1和2的绝对构型分别确定为10R,11S和8R,10R,11S。
关于venediol生物合成，我们分析了组织成六个模块的总共28个酶结构域（图2）。最小的装载模块含有酰基转移酶（AT）、酮合酶（KSQ）和酰基载体蛋白（ACP）结构域，其中正常KS的催化半胱氨酸残基被谷氨酰胺替换，产生KSQ结构域以脱羧丙二酸单酰辅酶A形成乙酰基，作为聚酮链组装的起始单元（图5A）。相同的KSQ结构域已在许多I型PKS系统中发现，如苦霉素和lavendiol。所有剩余的KS结构域（KS1−5）似乎均有活性，因为它们各自具有完整的负责脱羧缩合的催化残基。
模块5的AT结构域（AT5）含有GHSQG和YASH基序，特异性转移甲基丙二酸单酰部分，而所有其他延伸AT结构域具有GHS(I/V)G和HAFH基序，对丙二酸单酰部分具有特异性（图5B）。预测的这些丙二酸单酰和甲基丙二酸单酰构建单元的线性组装与venediols的骨架结构一致。
在下一个延伸步骤之前，与ACP结构域磷酸泛酰巯基乙胺臂相连的β-酮酰基部分预计被KR、DH和ER交替修饰，这为不同聚酮化合物的复杂性和立体化学设置了基础。有趣的是，ER在venediol生物合成中完全缺失。序列分析显示所有KR结构域（KR1、KR2、KR3和KR5）属于B1型，应产生R构型的羟基（图5C）。DH结构域催化KR结构域立体选择性还原产生的β-羟基脱水，形成反式双键。一致地，venediols中的所有双键均采用反式构型。
关于venediol DH结构域，功能性DH结构域（DH1和DH2）具有特征性HXXXGXXXXP基序和其他保守基序（图5D）。相比之下，模块4（DH4）和模块5（DH5）的DH结构域可能无功能，因为两个结构域均含有对LPFXW基序的显著改变，类似于利福霉素生物合成中涉及的无活性DH6和DH7结构域。此外，VedB的DH4缺乏保守的G...
【数据】基因组BGC数量：≥32；ved基因簇大小：30 kb；ORF数量：3（vedA、vedB、vedC）；pikAⅠ缺失区域：8,044,206–8,046,225 bp；vedA缺失片段：2,020 bp；新峰最大吸收：227 nm；分子式：C₁₃H₂₂O₃；[M+Na]⁺：m/z 249.1467；不饱和度：3；³J H-10,H-11 = 7.9 Hz；DP4+概率：100%；KR类型：B型（含LDD基序）；AT5基序：GHSQG/YASH（甲基丙二酸单酰特异性）；其他AT基序：GHS(I/V)G/HAFH（丙二酸单酰特异性）；DH功能域基序：HXXXGXXXXP；DH4/DH5：LPFXW基序改变，可能无功能
讨论与解读
广泛的基因组测序揭示链霉菌携带大量次级代谢物BGCs，但多数在实验室培养条件下沉默或极低表达。在合成生物学时代，激活沉默或弱表达BGCs是发现新化合物以应对日益增长的抗生素耐药性的重要策略。该实验室此前通过基因组挖掘方法探索隐秘萜类BGC，并通过沉默基因激活发现了两个新化合物venezuelaenes A和B。连同本研究发现venediols A和B，这些隐藏代谢物表明委内瑞拉链霉菌ATCC 15439具有发现更多新型次级代谢物的潜力。
Venediols的发现增加了链霉菌次级代谢物的多样性。未来需要找到有效方法分离1和2，以分别测试其生物活性。Venediols的I型模块化PKS线性缺失引发了一个关键问题：在没有ER结构域的情况下，C6/C7双键如何被还原？由于venediol生物合成没有任何后修饰步骤，研究人员推测意外的C-6/C-7饱和可能由最终TR结构域介导。需要进一步的遗传和生化研究来阐明确切的生物合成机制，该工作目前正在实验室进行中。
编译者解读：本研究展示了CRISPR/Cas9精准编辑在激活沉默基因簇方面的强大实用价值——通过单启动子插入即可撬动整个隐秘通路。值得注意的是，研究者先敲除苦霉素途径再激活目标基因簇的策略，巧妙规避了前体竞争和背景干扰，这种"先减后加"的工程思路值得借鉴。venediol结构中ER缺失却出现饱和键的现象，对模块化PKS的经典共线性规则构成挑战，提示TR结构域可能具有未被充分认识的多功能性。未来若能将1和2分离并逐一评估生物活性，或将拓展这类新型聚酮的应用潜力。
参考来源
Li S. Discovery of venediols by activation of a silent type I polyketide biosynthetic gene cluster in Streptomyces venezuelae ATCC 15439. Tetrahedron, 2022. DOI: 10.1016/j.tet.2022.133072
DOI: 10.1016/j.tet.2022.133072