来源：Modular metabolic engineering of Yarrowia lipolytica and semi-rational design of CYP716A520 for enhanced betulinic acid biosynthesis（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
桦木酸（BA）是一种羽扇豆烷型五环三萜类化合物，具有抗炎、抗肿瘤和抗HIV等多种药理活性。然而，其商业供应长期依赖植物提取，天然含量极低（干重仅0.025%），成本居高不下。本研究以解脂耶氏酵母为底盘，通过模块化代谢工程将角鲨烯产量提升813倍，并采用整合计算工具与进化信息的半理性设计策略改造限速酶CYP716A520，获得催化活性和选择性分别提升4倍和3倍的优良突变体L359V，为桦木酸的规模化微生物生产提供了可行平台。
研究背景
桦木酸（BA）是从白桦和迷迭香等植物中分离得到的羽扇豆烷型五环三萜化合物。因其多样且强效的抗炎、抗肿瘤和抗HIV活性，BA已在制药和化妆品行业广泛应用。然而，当前BA的商业供应主要依赖植物提取，天然丰度极低（干重0.025%），且提取工艺成本高昂。此外，由于化学结构复杂，BA的化学合成面临巨大挑战。微生物工程为植物源三萜化合物的生产提供了一条有前景且可持续的途径。产油酵母解脂耶氏酵母因具有充足的前体乙酰辅酶A供应以及可作为储存池的脂质，在BA生物合成方面展现出独特优势。
研究方法
2.1 培养条件与培养基
大肠杆菌DH5α感受态细胞用于载体构建和质粒扩增。细胞在购自生工生物工程（上海）股份有限公司的LB培养基中培养，添加适当浓度的抗生素进行筛选，37°C振荡培养16小时。解脂耶氏酵母Polf菌株在YPD培养基（10 g/L酵母提取物（生工）、20 g/L蛋白胨（生工）、20 g/L葡萄糖（Sigma-Aldrich）、15 g/L琼脂（Sigma-Aldrich））中于30°C培养。酵母转化的选择性培养基购自北京索莱宝科技有限公司。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α、解脂耶氏酵母Polf；培养基：LB、YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、15 g/L琼脂）；温度：37°C（大肠杆菌）、30°C（酵母）；时间：16h
2.2 质粒与菌株构建
用于角鲨烯合成相关的上游、中游和下游途径表达的质粒及其整合载体，按照先前报道的方法构建。这些载体通过PEG/LiAc转化方法整合到Polf菌株中，获得高效角鲨烯合成的BA2菌株。随后，将来自光果甘草的羽扇豆醇合酶GgLUS克隆至pYL005载体中。来自光果甘草的细胞色素P450还原酶GgCPR和来自榕树的CYP716A520克隆至pYL006载体中。这些构建体随后整合到BA2中，生成野生型桦木酸合成菌株BA3。进一步将角鲨烯环氧酶基因ERG1引入BA3，生成BA4菌株。所有修饰的P450突变体序列均由深圳华大基因商业合成，并插入携带GgCPR的pYL006载体中。为测试P450突变体，将含有GgCPR和CYP716A520突变体的DNA片段导入基于BA2的过表达ERG1和GgLUS的BA5菌株中。本研究中使用的所有异源基因MvaE（WP_002357755.1）、MvaS（WP_002357756.1）、GgLUS（AB116228）、GgCPR（KY798117）和CYP716A520（PX508515）均针对解脂耶氏酵母进行了密码子优化，并由深圳华大基因合成。所用引物列于表S2。目的基因和载体骨架的扩增以及菌落PCR鉴定使用KOD One™ PCR Master Mix -BLUE-（东洋纺，上海）进行。PCR片段使用天根琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（增强版）按照制造商说明进行纯化。质粒组装使用DNA Assembly Mix Ultra（愚公生物，中国）进行。重组质粒通过热激转化法转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，测序验证由生工生物（上海）完成。所有工程酵母菌株均通过转化线性化质粒（NotI酶切线性化）获得，随后通过菌落PCR验证阳性克隆。
【数据】菌株：BA2、BA3、BA4、BA5；载体：pYL005、pYL006；基因：MvaE、MvaS、GgLUS、GgCPR、CYP716A520、ERG1；转化方法：PEG/LiAc、热激法；酶切：NotI
2.3 摇瓶发酵
一般情况下，从琼脂平板上随机选取24个工程酵母菌落，接种于24深孔板中的3 mL YPD培养基中，在30°C、220 rpm条件下发酵16小时。然后将种子培养物以初始OD600为0.1接种到含10 mL YPD培养基的50 mL摇瓶中，在30°C、220 rpm条件下持续振荡培养3天。选取产量最高的前3个菌落用于评估各工程的性能。
【数据】接种量：24个菌落；培养基体积：3 mL（深孔板）、10 mL（摇瓶）；OD600：0.1；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：16h（种子）、3天（发酵）
2.4 桦木酸提取
将细胞培养物转移至50 mL离心管中进行OD600测定。随后，细胞在5000 rpm条件下离心10分钟收集，弃去上清液，酵母沉淀重悬于10 mL 20% KOH溶液（20% KOH：50%无水乙醇=1：1，v/v）中。混合物在沸水浴中孵育7分钟。冷却至室温后，加入10 mL正己烷，样品在3000 rpm条件下涡旋3分钟。混合物在5000 rpm条件下离心30秒，取8 mL上层有机相转移至15 mL离心管中。在氮气流下蒸发正己烷，直至体积减至约1 mL。将剩余己烷提取物转移至1.5 mL微量离心管中，在氮气下蒸发至干。随后向干燥残留物中加入1 mL乙酸乙酯，充分涡旋，并在12,000 rpm、10°C条件下离心30分钟。取90 μL上清液转移至1.5 mL微量离心管中，加入25 μL三甲基硅烷化试剂和25 μL无水吡啶。衍生化反应在85°C、800 rpm的恒温混匀仪上进行30分钟。衍生化样品过滤后转移至GC-MS样品瓶进行分析。
【数据】离心：5000 rpm×10min；KOH浓度：20%（与50%无水乙醇1:1）；沸水浴：7min；正己烷：10mL；涡旋：3000 rpm×3min；离心：5000 rpm×30s；氮吹：至约1mL；乙酸乙酯：1mL；离心：12,000 rpm、10°C、30min；衍生化：85°C、800 rpm、30min
2.5 气相色谱-质谱联用分析
样品在GC-MS 7000E GC/TQ系统（安捷伦，美国加利福尼亚）上采用全扫描模式（m/z 40–400）进行分析，配备HP-5 ms毛细管柱（30 m × 250 μm × 0.25 μm），氦气为载气。质谱采用电子电离（EI）方式采集。GC温度程序如下：柱温箱初始温度160°C保持1分钟，以30°C/min升至280°C，再以2°C/min升至300°C，保持5分钟。化合物根据特征质谱碎片模式和峰面积进行定性和定量。
【数据】扫描范围：m/z 40–400；色谱柱：HP-5 ms（30 m×250 μm×0.25 μm）；升温程序：160°C保持1min→30°C/min至280°C→2°C/min至300°C保持5min
2.6 结构建模与进化分析
在本地服务器上建立了AlphaFold3的执行环境。输入CYP716A520的氨基酸序列、辅酶HEME的SMILES表示和底物羽扇豆醇，获得CYP716A520-HEME-羽扇豆醇复合物结构。以氨基酸序列为输入，执行位置特异性迭代基本局部比对搜索工具（PSI-BLAST）搜索UniRef90数据库，生成位置特异性打分矩阵（PSSM）。
【数据】工具：AlphaFold3、PSI-BLAST；数据库：UniRef90
2.7 分子动力学（MD）模拟与轨迹分析
突变体结构使用REvoDesign的侧链求解模块从WT模型生成。蛋白质和辅因子（HEME、SAM）使用CHARMM36（2022年7月版）全原子力场。配体结构的预处理和配体参数制备使用Avogadro和CGenFF服务器完成。MD模拟由GROMACS（版本2025.3）执行，进行100 ns的分子动力学模拟。关键原子/残基对分析使用GROMACS内置工具进行，如"distance"、"rms"和"rmsf"。下游插图用的XVG图像文件由这些分析工具生成，最终图形编辑使用XMGRACE软件完成。
【数据】力场：CHARMM36（Jul-2022）；模拟时长：100ns；软件：GROMACS 2025.3、REvoDesign、Avogadro、CGenFF、XMGRACE
研究结果
3.1 构建用于前体角鲨烯积累的解脂耶氏酵母底盘
角鲨烯是BA和自然界所有三萜化合物合成的关键前体。在酵母中，角鲨烯仅作为甾醇生物合成途径的中间体合成，而甾醇途径对细胞生长和存活至关重要。法尼基焦磷酸合酶（ERG20）作为双功能合酶，依次催化MVA途径产生的IPP和DMAPP缩合形成FPP。随后，FPP被角鲨烯合酶（ERG9）转化为角鲨烯。由于甾醇合成途径受到严格调控，野生型解脂耶氏酵母中天然合成的角鲨烯含量仅为1.5 mg/L，这将严重限制BA在解脂耶氏酵母中的生产。因此，开发高生产力的替代角鲨烯生产底盘已成为当务之急。
为构建用于后续BA合成的角鲨烯过量生产细胞工厂，将从乙酰辅酶A起始的角鲨烯生物合成途径分为三个模块，包括上游途径（含ERG10、ERG13和tHMGR的MVA上游途径）、中游途径（含ERG12、ERG8、ERG19和IDI的MVA下游途径）以及含ERG20和ERG9的下游途径。通过在解脂耶氏酵母中表达源自粪肠球菌的异源MvaE和MvaS酶来上调MVA上游途径，这两种酶催化MVA途径的前三步反应，使角鲨烯产量较亲本菌株提高了400倍，所得菌株BA1中产量达到0.6 g/L。这一数据也表明MvaE和MvaS对可作为增强天然途径的替代捷径，用于高效萜类生物合成。
为进一步增强天然MVA途径的能力，我们通过在BA1菌株中过表达ERG12、ERG8、ERG19、IDI、ERG20和ERG9来上调中游和下游途径模块，从而过表达整个角鲨烯合成途径。角鲨烯产量又增加了2.03倍，最终在所得菌株BA2中达到1.22 g/L的滴度。由于上游途径的过表达增加了MVA池的量，这反过来需要高水平的下游酶来充分转化。这些解决BA生物合成上游瓶颈的策略可以与先前报道的工程方法协同整合，以实现更高效的萜类合成。
【数据】角鲨烯产量：野生型1.5 mg/L→BA1 0.6 g/L（提高400倍）→BA2 1.22 g/L（再增2.03倍）
3.2 解脂耶氏酵母中BA合成工程途径的构建
BA的生物合成涉及两个不同的酶促阶段。首先，来自光果甘草的羽扇豆醇合酶GgLUS将2,3-氧化角鲨烯环化形成三萜骨架羽扇豆醇。随后，限速氧化修饰由来自榕树的细胞色素P450（CYP716A520）催化。结合来自光果甘草的还原酶GgCPR，三功能CYP716A520可依次催化羽扇豆醇的三步氧化反应，形成桦木醇、桦木醛和BA。本研究将密码子优化的GgLUS、CYP716A520和GgCPR引入BA2菌株进行BA的从头合成。所得工程菌株BA3中BA滴度约为2.05 mg/L。
为提高BA产量，我们进一步在BA3菌株中过表达角鲨烯环氧酶基因ERG1，以增加2,3-氧化角鲨烯——羽扇豆醇的直接生物合成前体——的供应。正如预期，所得菌株BA4的BA产量较亲本菌株BA3提高了6倍，滴度达到约12.4 mg/L。我们还分析了BA4中CYP716A520催化反应的产品分布概况，发现目标产物BA及中间产物桦木醛和桦木醇的选择性分别占21.07%、11.04%和67.89%。中间产物的大量积累表明CYP716A520在介导三步连续氧化反应方面的催化效率有限，因此构成了限制BA高效从头生物合成的关键瓶颈。
【数据】BA滴度：BA3约2.05 mg/L→BA4约12.4 mg/L（提高6倍）；产物选择性：BA 21.07%、桦木醛 11.04%、桦木醇 67.89%
3.3 结合结构与进化数据的CYP716A520工程改造
CYP716A520能特异性催化羽扇豆醇C-28位的三步连续氧化反应生成BA。其催化活性直接决定异源宿主中C-28氧化三萜化合物的生物合成效率。然而，CYP716A520在异源系统中催化活性低、稳定性差，容易积累中间产物，严重限制了具有工业应用潜力的BA生物合成效率。因此，有必要通过酶工程对CYP716A520进行功能改良。然而，涉及BA生物合成途径的P450修饰鲜有报道。在先前的研究中，来自迷迭香的RoCYP01被工程改造，但所得突变体的BA产量仅增加了9%。
为提高酶工程效率，我们在此采用了一种半理性蛋白设计策略，该策略整合了结构引导的理性设计、进化信息和能量分析，以指导CYP716A520向期望功能的快速进化。首先，使用AlphaFold3构建CYP716A520与底物羽扇豆醇和辅因子HEME的高精度复合物结构。复合物模型的结构质量评估显示，预测的局部距离差异测试（pLDDT）值处于高置信度范围（>90），表明模型具有良好的结构可靠性。进一步的构象分析证实，羽扇豆醇的C-28催化位点能准确面向HEME的Fe原子，形成典型的底物-辅因子取向，与P450酶催化反应一致。
基于上述可靠的三元复合物结构，羽扇豆醇和HEME 5 Å范围内的残基被定义为潜在设计热点。这些残基被认为参与底物结合、构象稳定和催化反应等核心过程的关键氨基酸，是酶修饰的主要靶点。在羽扇豆醇结合区域共鉴定出23个残基，在HEME基团区域鉴定出34个残基，其中7个残基为两个区域共有。
为最小化设计热点文库，我们接下来使用位置特异性打分矩阵（PSSM）进行进化保守性分析，对潜在热点残基进行二次筛选。PSSM的进化分析涉及通过多序列比对（MSA）比较CYP716A520的同源基因，计算每个位置上不同氨基酸的出现频率，从而提供这些位置氨基酸保守性的信息。PSSM分数越高表示该位置越保守。这种保守性表明该位置可能对维持酶核心结构的稳定性、确保辅因子结合的特异性或保持活性中心的构象完整性至关重要。因此，通常避免在这些位点进行突变。基于这一原则，17个高度保守的残基被排除在设计热点文库之外，最终确定了33个兼具修饰潜力和结构稳定性的核心设计热点。
接下来，基于核心设计热点的结构特征和预测的催化功能，实施了三种理性设计策略。原文此处未详述三种策略的具体内容。
【数据】结构质量：pLDDT>90；热点残基：羽扇豆醇结合区23个、HEME区34个、共有7个；排除保守残基：17个；核心设计热点：33个
3.4 CYP716A520突变体的功能表征
（注：原文此处方法描述不完整，仅展示结果框架）在摇瓶发酵后，对表达不同CYP716A520野生型或突变体的BA4菌株中桦木酸、桦木醇和桦木醛的滴度进行了测定。同时计算了各产物占总产物的比例。L359V突变体表现出最优的催化性能——BA产量较野生型酶提高4倍，BA选择性提高3倍。
【数据】L359V突变体：BA产量提高4倍、选择性提高3倍（相对野生型）
3.5 MD模拟揭示L359V突变体的结构动力学特征
分子动力学模拟揭示了L359V突变（第359位亮氨酸→缬氨酸）导致的活性口袋构象变化。突变扩大了底物通道和水通道，从而增强了质子穿梭效率并促进了底物进入活性位点。瓶颈直径的动态变化为这一机制提供了结构证据。
【数据】模拟时长：100ns；突变：Leu359→Val
讨论与解读
本研究通过模块化代谢工程在解脂耶氏酵母中构建了高效的角鲨烯供应底盘，实现了较亲本菌株813倍的角鲨烯产量提升。为克服BA合成中CYP716A520的催化瓶颈，采用整合计算工具与蛋白进化信息的半理性设计策略，获得最优变体L359V，其BA产量较野生型酶提高4倍、BA选择性提高3倍。MD模拟揭示L359V突变通过扩大底物和水通道、增强质子穿梭效率来提升催化性能。该工作不仅为可扩展的BA生产提供了有前景的平台，也为其他高价值植物天然产物的微生物生产提供了有效的计算蛋白设计策略。
编译者解读： 本研究的技术路线具有鲜明合成生物学特征——"底盘工程+限速酶改造"双管齐下。角鲨烯产量813倍的提升展示了模块化代谢工程的强大威力，而L359V突变体的获得则验证了计算设计在P450酶功能改造中的实用价值。值得注意的是，BA4菌株中桦木醇占比高达67.89%，说明三步氧化反应的不平衡是主要瓶颈，L359V对选择性的改善直击要害。未来若能将底盘优化与酶改造策略叠加，并结合发酵工艺放大，BA的微生物合成有望进一步逼近产业化水平。
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134364