来源：High-titer retinal production in Yarrowia lipolytica via redox engineering coupled with intra- and extracellular sequestration（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
视网膜色素（Retinal）是维生素A家族中生物活性显著高于视黄醇的类视黄醇化合物，在化妆品和医药领域应用广泛，但其微生物合成长期受限于化学不稳定性和胞内氧化还原代谢干扰。本研究以高产β-胡萝卜素的解脂耶氏酵母YB11为底盘菌株，通过筛选高效β-胡萝卜素裂解双加氧酶（BCO）、靶向敲除12个内源氧化还原酶基因、优化前体供应并结合脂质储存工程，配合肉豆蔻酸异丙酯（IPM）原位萃取与抗氧化剂稳定策略，最终在5-L补料分批发酵中实现2253 mg/L的总视网膜色素滴度，IPM相中浓度高达45.1 g/L，创下微生物生产视网膜色素的新纪录。
研究背景
类视黄醇是一类以维生素A为核心的化合物，在制药、化妆品和营养产业中具有重要应用价值。目前工业生产主要依赖化学合成，该工艺成本高昂且伴随有害副产物和复杂的纯化流程。微生物细胞工厂合成被视为可行的替代方案。已有研究多聚焦于视黄醇的微生物合成，而视网膜色素作为视黄酸（retinoic acid）的直接前体，在人体代谢中所需酶促转化步骤更少，生物活性显著高于视黄醇，在皮肤病学和治疗应用中具有更优效能。视网膜色素生产已在大肠杆菌和酿酒酵母等宿主中有所尝试，但产量受限于产物化学不稳定性和胞内氧化还原环境的干扰。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）作为产油酵母，具备强大的乙酰辅酶A供应和脂质储存能力，为类胡萝卜素及类视黄醇合成提供了潜在优势平台。
研究方法
2.1 培养条件与培养基
解脂耶氏酵母菌株在30°C的YPD培养基中培养。YPD培养基成分为：10 g/L酵母提取物（Conda）、20 g/L蛋白胨（BD Difco）、20 g/L葡萄糖（Alfa Aesar），用于基因组整合菌株的类异戊二烯生产。YSC-LEU培养基成分为：6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源基础（Sigma-Aldrich）、0.69 g/L CSM-LEU（MP Biomedicals）、20 g/L葡萄糖（Alfa Aesar），用于解脂耶氏酵母转化子筛选。载体构建所用大肠杆菌Mach1™在37°C的Luria-Broth（LB）液体培养基及添加20 g/L琼脂的固体培养基平板上培养。需要时LB培养基中添加75 mg/L氨苄青霉素。视网膜色素生产培养中，解脂耶氏酵母细胞在YPD培养基中过夜培养，随后以初始OD600为0.2接种至250 mL带挡板摇瓶中的25 mL YPD培养基中。细胞在30°C、250 rpm振荡条件下培养。培养24 h后添加十二烷或IPM，48 h后收集有机层及细胞沉淀样品。
【数据】培养基：YPD（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）；YSC-LEU（6.7 g/L YNB、0.69 g/L CSM-LEU、20 g/L葡萄糖）；LB+75 mg/L氨苄青霉素；温度：30°C（酵母）/37°C（大肠杆菌）；转速：250 rpm；初始OD600：0.2；培养时间：48 h；有机层添加时间：24 h
2.2 菌株构建
本研究以YB11菌株为基础菌株。解脂耶氏酵母基因组中的基因删除和整合基于DNA片段的同源重组，两侧翼为1000-bp同源臂用于染色体靶向。LEU2标记用于整合DNA片段的选择。采用一步醋酸锂转化法，转化混合物在铺板步骤略有差异。转化混合物包含0.5–1 µg DNA、88 µL 50% PEG4000（Sigma-Aldrich）、5 µL 2 M醋酸锂（LiAc）pH 8（Sigma-Aldrich）和2 µL单链DNA（ssDNA）（UltraPure™鲑鱼精DNA溶液，Invitrogen），与解脂耶氏酵母细胞涡旋混合至少10 s，然后在39°C孵育60 min。混合物涂布于选择性培养基上，在30°C孵育2–3天。菌落PCR筛选后，通过在YPD中培养2天去除含LEU2标记的Cas9-sgRNA表达质粒。培养物划线并孵育至单菌落形成，随后点种至YPD和YSC-LEU培养基。Cas9质粒丢失通过YSC-LEU选择性培养基上无生长来确认。整合位点通过基因组DNA（gDNA）PCR扩增子的Sanger测序验证，gDNA使用Exgene Cell SV试剂盒（GeneAll）和Zymolyase（Zymo Research）制备。本研究所构建和使用的菌株列于表S2。
【数据】同源臂长度：1000 bp；筛选标记：LEU2；转化体系：0.5–1 µg DNA、88 µL 50% PEG4000、5 µL 2 M LiAc（pH 8）、2 µL ssDNA；涡旋时间：≥10 s；孵育温度/时间：39°C/60 min；菌落生长温度/时间：30°C/2–3天；质粒去除培养时间：2天
2.3 质粒构建
Cas9-sgRNA表达质粒通过Gibson assembly构建。每个靶标的20-bp sgRNA序列作为60-nt插入片段的一部分引入，包含sgRNA间隔序列及其两侧各20-nt同源序列。该插入片段与AvrII消化的pCRISPRyl组装。转化前通过跨sgRNA插入位点的Sanger测序确认sgRNA序列的正确插入。本研究所用质粒列于表S3。所有整合或删除位点的sgRNA靶向序列列于表S4。BCO编码序列使用Integrated DNA Technologies（IDT）提供的密码子优化工具针对解脂耶氏酵母进行密码子优化并由IDT合成。本研究所用密码子优化的异源基因序列列于表S5。所有其他基因均从解脂耶氏酵母gDNA扩增获得。
【数据】sgRNA长度：20 bp；插入片段长度：60 nt（含两侧20-nt同源序列）；载体骨架：pCRISPRyl（AvrII消化）；密码子优化工具：IDT
2.4 氧化还原酶候选基因的生物信息学分析
候选解脂耶氏酵母氧化还原酶基于基因组注释中预测的醇脱氢酶、视黄醇脱氢酶样、醛/醇还原酶及相关氧化还原酶功能进行筛选。为鉴定类视黄醇相关脱氢酶的推定解脂耶氏酵母同源物，以人RDH10和RDH12的氨基酸序列为查询序列，对解脂耶氏酵母蛋白数据库进行BLASTP搜索。基于与人类RDH10和RDH12的序列相似性，分别选择YALI1_B04747g和YALI1_E29512g进行进一步分析。使用AlphaFold Server预测YALI1_B04747g和YALI1_E29512g的蛋白质结构，人类RDH10和RDH12的参考结构从AlphaFold蛋白质结构数据库下载。使用PyMOL v3.1.0 Open-Source进行成对结构叠加和可视化，通过计算比对原子的均方根偏差（RMSD）值评估结构相似性。生物信息学比较用于支持候选基因优先级排序，最终功能筛选通过删除选定的氧化还原酶基因并利用高效液相色谱（HPLC）定量视网膜色素积累来实验验证。
【数据】BLASTP查询序列：人RDH10、RDH12；候选基因：YALI1_B04747g、YALI1_E29512g；结构预测工具：AlphaFold Server；结构比对工具：PyMOL v3.1.0；定量方法：HPLC
2.5 补料分批发酵
补料分批培养中，菌株JR37首先接种至含5 mL YPD培养基的试管中。菌株在30°C、250 rpm培养24 h，然后以初始OD600为0.2接种至含50 mL YPD培养基的500 mL摇瓶中。菌株在30°C、250 rpm再培养24 h，最终接种至5-L生物反应器（BIOCNS Co., Ltd.）中的1.5 L培养基（50 g/L葡萄糖、80 g/L蛋白胨、40 g/L酵母提取物）。初始OD600设为1，发酵在两种不同通气设置下运行（恒定设置1 L/min和动态设置1.5 vvm）。搅拌速度从250 rpm开始，最终提高至430 rpm以维持溶解氧（DO）高于30%。使用50% v/v氨水和1 M盐酸（HCl）将pH维持在6.5–6.8之间。温度设定为30°C。补料分批过程在培养24 h后启动，补料培养基[500 g/L葡萄糖、80 g/L蛋白胨、40 g/L酵母提取物、1.5 mM七水硫酸锌、1.5 mM七水硫酸亚铁]以2.5 g/h的葡萄糖补料速率添加。补料分批发酵期间，持续监测残留葡萄糖浓度、溶解氧（DO）、pH和温度以评估过程稳定性和可重复性（图S3A、S3B）。含0.2% w/v BHT的IPM（5% v/v）在培养24 h后添加，并额外添加IPM以维持总液体体积的5%（v/v）比例。
【数据】培养基：1.5 L（50 g/L葡萄糖、80 g/L蛋白胨、40 g/L酵母提取物）；生物反应器：5-L；初始OD600：1；通气：恒定1 L/min / 动态1.5 vvm；搅拌：250→430 rpm；DO：>30%；pH：6.5–6.8；温度：30°C；补料启动时间：24 h；补料速率：2.5 g葡萄糖/h；补料成分：500 g/L葡萄糖、80 g/L蛋白胨、40 g/L酵母提取物、1.5 mM ZnSO₄·7H₂O、1.5 mM FeSO₄·7H₂O；IPM：5% v/v（含0.2% w/v BHT）
2.6 分析方法
有机层中视网膜色素的定量：最终培养物在13,000 g离心5 min。有机层使用配备Shim-pack Velox C18色谱柱（150 mm × 3 mm，2.7 μm，Shimadzu）和PDA检测器的HPLC分析。流动相为95%甲醇和5%乙腈，流速0.255 mL/min，柱温40°C。胞内β-胡萝卜素的定量：100 μL培养细胞离心后，细胞沉淀重悬于700 μL二甲基亚砜（DMSO）中。样品在55°C孵育10 min，加入等体积丙酮后在45°C孵育15 min。样品随后在13,000 g离心5 min。含β-胡萝卜素的上清液使用配备Shim-pack Velox C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm，Shimadzu）的HPLC分析。流动相如下：流动相A：乙腈/去离子蒸馏水（DDW）/冰醋酸——90/10/2；流动相B：乙腈/甲醇——9:1；流动相C：THF。总运行时间26 min，梯度程序为：0–4.5 min：100% A；4.5–6.5 min：至100% B；6.5–12 min：至60% B、40% C；12–15 min：保持60% B、40% C；15–20 min：至100% B；20–26 min：回到100% A。流速恒定1 mL/min，柱温恒定22°C。标准品β-胡萝卜素、视网膜色素和视黄醇购自S公司。
【数据】视网膜色素HPLC：C18柱（150 mm × 3 mm，2.7 μm）；流动相：95%甲醇/5%乙腈；流速：0.255 mL/min；柱温：40°C；离心：13,000 g/5 min；β-胡萝卜素提取：700 μL DMSO，55°C/10 min，加丙酮后45°C/15 min；β-胡萝卜素HPLC：C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；柱温：22°C；运行时间：26 min
研究结果
3.1 通过BCO筛选建立高效的视网膜色素生物合成途径
菌株YB11此前通过系统的碳和氧化还原再平衡策略实现了高产β-胡萝卜素，滴度达570 mg/L（图1A）。该成果通过整合两拷贝外源CarRP和CarB基因实现，其中一拷贝CarRP含有Y27R突变以缓解番茄红素介导的底物抑制。此外，各整合一拷贝外源GGPPS和内源HMGR以最大化类胡萝卜素途径的代谢通量。虽然该β-胡萝卜素高产菌株提供了稳健的基础底盘，但将β-胡萝卜素转化为视网膜色素仍是关键酶促瓶颈——解脂耶氏酵母缺乏催化该转化的天然代谢机制。
为克服这一催化限制，研究团队从多种细菌和哺乳动物来源系统筛选了一系列异源β-胡萝卜素15,15′-二/单加氧酶（BCOs）。这些酶催化β-胡萝卜素分子在15,15′双键处的对称氧化裂解，产生两分子视网膜色素。基于缓解裂解瓶颈和最大化途径通量的潜力，共筛选了6个BCO候选基因。初始候选池基于已知高氧化裂解活性的BCO序列的系统发育分析进行筛选。具体而言，与来自高活性海洋细菌66A03的BCO紧密聚集的序列被优先考虑，因为这些近缘分支通常表现出与类阿朴胡萝卜素生产相关的优良特性。筛选进一步结合了已有动力学参数文献——例如，人类来源的BCO因其已报道的高转化率和生产力被纳入候选，尽管其与66A03 BCO的系统发育关系较远。这一系统方法确保了最终选定的BCO基因涵盖充分的结构和功能多样性。
异源BCO基因在YB11菌株中的成功表达需要针对酵母宿主进行专门优化。BCO基因针对解脂耶氏酵母进行了密码子优化以确保高效翻译。此外，利用强人工启动子hp4d确保稳健的转录活性，有效增加从β-胡萝卜素池向视网膜色素的代谢通量。摇瓶培养使用YPD培养基并添加10%（v/v）十二烷。十二烷作为一种无毒疏水性C12烷烃，作为原位有机萃取相。由于视网膜色素的亲脂性，高胞内浓度下对酵母细胞膜具有潜在毒性。此外，作为醛类化合物，视网膜色素也易发生化学和酶促降解。因此，添加十二烷旨在缓解视网膜色素过量生产相关的挑战。
在这些优化培养条件下，大多数测试的BCO均能产生视网膜色素，但效率差异显著。来源于未培养海洋细菌HF10_25F10（25F10）的酶表现出最高产量，总视网膜色素滴度为127 mg/L（十二烷相中1270 mg/L视网膜色素）（图1C）。该滴度比表达海洋细菌66A03（blh）BCO的菌株高45%。虽然blh酶被广泛认为是微生物类视黄醇生产中最有效的生物催化剂，并在大多数现有文献中作为基准，但本研究发现25F10 BCO是该代谢途径的优良替代。值得注意的是，原位萃取非常高效，上清液和细胞沉淀中均未检测到视网膜色素，表明有机相中实现了近乎定量的回收。表达25F10 BCO的菌株命名为JR1，352 nm处的代表性色谱图见图S1。
尽管成功缓解了初始裂解瓶颈，JR1中最终的视网膜色素积累仍显著低于高β-胡萝卜素通量所预期的理论产量。基于YB11中570 mg/L的β-胡萝卜素滴度，假设一分子β-胡萝卜素完全转化为两分子视网膜色素，理论视网膜色素产量计算为604 mg/L。JR1中观察到的127 mg/L总视网膜色素滴度仅相当于β-胡萝卜素理论最大值的约21%。这一差异表明，视网膜色素的积累可能受到β-胡萝卜素裂解后内源转化或产物不稳定性的限制。
【数据】YB11 β-胡萝卜素滴度：570 mg/L；CarRP/CarB拷贝数：各2拷贝（含Y27R突变）；GGPPS/HMGR拷贝数：各1拷贝；BCO候选数：6个；十二烷添加量：10% v/v；25F10 BCO总视网膜滴度：127 mg/L；十二烷相浓度：1270 mg/L；较blh提高：45%；理论视网膜产量：604 mg/L；实际产量占比：约21%
3.2 通过靶向醇脱氢酶删除缓解胞内视网膜色素降解
视网膜色素本质上具有氧化敏感的醛基和不饱和异戊二烯侧链，使其极易受到解脂耶氏酵母复杂胞内环境中代谢干扰的影响。特别是，多种内源酶可能直接或间接扰动胞内NADH/NAD⁺氧化还原平衡，导致视网膜色素的代谢降解。鉴于内源脱氢酶天然还原活性醛以减轻细胞毒性，阻止这种降解对醛类积累至关重要。酿酒酵母中先前的多重工程研究已证实，删除特定的混杂脱氢酶（ΔADH6、ΔADH7、ΔSFA1、ΔGRE2）可成功抑制这种天然降解，使视网膜色素作为主要产物积累。
借鉴上述脱氢酶删除策略，研究团队锁定了一组可能参与视网膜色素降解的候选基因。初始候选集包括醇脱氢酶（ADH）家族（ADH1-7），以及脂肪酰辅酶A氧化酶（FAO1）和S-（羟甲基）谷胱甘肽脱氢酶（FADH）——这些基因已被证实参与酵母中疏水化合物的降解。为进一步优化候选筛选，还鉴定出可能对视网膜色素活性醛基具有非特异性亲和力的候选基因，包括NADH脱氢酶YALI1_E06616g。
鉴于解脂耶氏酵母基因组的注释不如模式真核系统完善，研究采用比较生物信息学方法鉴定对视黄醇类具有高结构特异性的基因。分析聚焦于已充分表征的人类基因视黄醇脱氢酶10（RDH10）和视黄醇脱氢酶12（RDH12），两者以对视网膜色素底物的高结合亲和力著称。这一系统分析鉴定出两个特定基因座——YALI1_B04747g和YALI1_E29512g，与人类对应基因具有高百分比同一性。YALI1_B04747g与人RDH10的结构比对显示高度结构相似性，RMSD为1.193 Å（1,206个原子，基于序列的比对）（图2A）。YALI1_E29512g与人RDH12的结构比对显示更高的结构相似性，RMSD为0.868 Å（1,655个原子）。这两个特异性同源物被靶向删除，以检验它们是否在该菌株背景下导致视网膜色素损失。
使用CRISPR-Cas9系统，在表达BCO的JR1菌株中对12个候选基因进行了靶向删除。所得菌株在相同条件下培养，以评估每个删除对最终视网膜色素浓度的影响。随后的HPLC分析显示，多个基因的删除显著影响了视网膜色素的积累水平。
【数据】候选基因数量：12个（ADH1-7、FAO1、FADH、YALI1_E06616g、YALI1_B04747g、YALI1_E29512g）；YALI1_B04747g与人RDH10 RMSD：1.193 Å（1,206原子）；YALI1_E29512g与人RDH12 RMSD：0.868 Å（1,655原子）；删除工具：CRISPR-Cas9
3.3 通过前体供应优化和DGA1相关脂质储存工程协同增强视网膜色素生产
在成功删除内源氧化还原酶后，研究进一步聚焦于代谢通量增强与产物储存能力的协同优化。ERG20（F87S）突变体被引入以增强法尼基焦磷酸（FPP）前体向类胡萝卜素生物合成途径的流动。同时，过表达二酰甘油酰基转移酶基因DGA1，该酶催化三酰甘油（TAG）生物合成的最后一步，从而扩大脂质储存能力，为亲脂性的视网膜色素提供胞内隔离场所。单独表达ERG20（F87S）或单独过表达DGA1均能提升视网膜色素积累，但将增强的生物合成通量与DGA1过表达偶联产生的视网膜色素积累提升幅度大于任一策略单独使用时的效果。这一协同效应表明，增强前体供应与扩大产物储存能力之间存在功能性互补——更高的合成通量需要相应的储存容量来容纳增加的产物，防止产物反馈抑制或降解。
【数据】ERG20突变：F87S；DGA1过表达：有；协同策略提升幅度：大于任一单独策略（原文未给出具体百分比数值）
3.4 5-L补料分批发酵与双相萃取系统
为验证工程菌株的工业化潜力，研究在5-L生物反应器中进行了补料分批发酵。菌株JR37在含50 g/L葡萄糖、80 g/L蛋白胨和40 g/L酵母提取物的1.5 L培养基中培养，初始OD600为1.0。发酵采用两种通气设置进行比较：恒定1 L/min和动态1.5 vvm。搅拌速度从250 rpm逐步提高至430 rpm以维持DO高于30%，pH通过50%氨水和1 M HCl维持在6.5–6.8之间，温度恒定30°C。补料在24 h后启动，补料培养基含500 g/L葡萄糖、80 g/L蛋白胨、40 g/L酵母提取物、1.5 mM七水硫酸锌和1.5 mM七水硫酸亚铁，葡萄糖补料速率为2.5 g/h。
培养24 h后添加含0.2% w/v BHT的IPM（5% v/v）作为原位萃取相，并随培养体积增加额外补充IPM以维持5%（v/v）比例。IPM是一种化妆品级溶剂，其作为萃取相的优势在于产物相可直接与下游配方兼容。BHT作为抗氧化剂添加，以保护氧化敏感的视网膜色素免受降解。
在优化的通气条件下，最终总视网膜色素滴度达到2253 mg/L，其中IPM相中的视网膜色素浓度高达45.1 g/L。这一结果对应于9.39 mg/L/h的生产速率和4.02 mg/g葡萄糖的转化率。与已报道的微生物视网膜色素生产研究相比（表S1），本研究的最终滴度是迄今报道的最高值。
【数据】发酵体积：1.5 L（5-L反应器）；初始OD600：1.0；通气设置：恒定1 L/min vs 动态1.5 vvm；搅拌：250→430 rpm；DO：>30%；pH：6.5–6.8；温度：30°C；补料速率：2.5 g葡萄糖/h；IPM：5% v/v（含0.2% w/v BHT）；总视网膜滴度：2253 mg/L；IPM相浓度：45.1 g/L；生产速率：9.39 mg/L/h；转化率：4.02 mg/g葡萄糖
讨论与解读
本研究通过多模块协同工程策略，在解脂耶氏酵母中实现了迄今最高水平的微生物视网膜色素生产。核心创新体现在四个层面：其一，通过系统发育分析和动力学文献指导的BCO筛选，鉴定出来源于海洋细菌HF10_25F10的BCO优于广泛使用的blh酶，产量提升45%，成功破解了β-胡萝卜素裂解瓶颈。其二，通过比较基因组学和结构生物学方法（AlphaFold预测+RMSD比对），精准识别并删除了12个内源氧化还原酶候选基因，有效遏制了视网膜色素的胞内降解。其三，将ERG20（F87S）前体通量增强与DGA1脂质储存工程偶联，产生超越单一策略的协同增益。其四，采用化妆品级IPM作为原位萃取相并辅以BHT抗氧化保护，不仅实现了产物的高效回收和稳定化，还使产物相与下游配方直接兼容。
值得注意的是，2253 mg/L的总滴度中，绝大部分产物集中在IPM有机相（45.1 g/L），水相和细胞内的产物浓度极低。这一分布特征既反映了原位萃取的高效性，也提示IPM相的容量可能成为进一步提升产量的潜在限制因素。此外，动态通气（1.5 vvm）条件下BCO酶促裂解反应对氧气的依赖与产物氧化敏感性之间的平衡，是发酵工艺优化中值得关注的精细调控点。
编译者解读
该研究展示了合成生物学中"通量-储存-稳定"三位一体的工程范式：仅增强合成通量不够，还需匹配产物储存能力；仅提供疏水环境不够，还需兼顾化学稳定性。IPM双相萃取策略将微生物生产与化妆品配方直接衔接，缩短了从发酵到产品的距离。局限在于，当前策略高度依赖IPM作为萃取剂，其生物相容性和大规模应用成本仍需评估。未来若能将此框架推广至其他氧化敏感的萜类醛化合物，产油酵母平台的价值将进一步释放。
参考来源
Song, J. High-titer retinal production in Yarrowia lipolytica via redox engineering coupled with intra- and extracellular sequestration. Bioresource Technology, 2026.
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135378
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135378