来源：Secretory and metabolic engineering of squalene in Yarrowia lipolytica（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
角鲨烯是一种重要的三萜类化合物，在医药、化妆品等领域应用广泛。然而，其膜不透性导致产物在胞内积累，制约产量提升。本研究以解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为宿主，系统筛选ABC转运蛋白并开发了载体蛋白介导的代谢物转运系统，成功实现角鲨烯的高效胞外分泌。工程菌株在补料分批发酵中胞外角鲨烯产量达3.43 g/L，占总产量的27.2%，为迄今报道的最高分泌水平。
研究背景
角鲨烯是一种线性多不饱和三萜化合物，在医药、保健和化妆品领域被广泛用作食品补充剂、保湿剂、抗氧化剂、抗病毒和抗癌剂。微生物合成角鲨烯为可持续生产和环境保护提供了可行途径。酿酒酵母和解脂耶氏酵母等酵母菌已被视为生产角鲨烯的可行平台。通过将角鲨烯生物合成途径引入线粒体或过氧化物酶体，并结合细胞质工程策略，酿酒酵母和解脂耶氏酵母的角鲨烯产量已达11.0 g/L至51.2 g/L。然而，由于膜不透性，角鲨烯等亲脂性萜类化合物无法被高效转运至胞外，而是在胞内积累。这种胞内积累常导致储存限制和代谢负担，从而限制目标化合物产量的进一步提高。对膜不透性萜类进行分泌工程改造是解决上述问题的有效策略。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株列于表S1。选用大肠杆菌DH5α进行克隆和质粒构建。选择营养缺陷型解脂耶氏酵母菌株Po1f（Leu⁻, Ura⁻, Trp⁻）作为亲本菌株，用于构建工程衍生菌株。酵母菌株在YPD培养基中、30°C、220 rpm条件下培养。使用含有必需氨基酸的YNB培养基筛选转化子。摇瓶发酵采用两相培养系统进行角鲨烯分泌实验。将十二烷按1:10的体积比加入YPD培养基中，以促进角鲨烯的萃取。
【数据】菌株：E. coli DH5α、Y. lipolytica Po1f（Leu⁻, Ura⁻, Trp⁻）；培养基：YPD、YNB；温度：30°C；转速：220 rpm；两相体系：十二烷:YPD = 1:10（体积比）
2.2 质粒与菌株构建
本研究所用引物列于表S2。所有内源基因（见补充材料）均从Po1f基因组DNA中扩增获得，使用Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶（诺唯赞，南京，中国），按照制造商说明进行操作。AtoB、EfMvaE、EfMvaSA110G和MmMK（见补充材料）经密码子优化后由Genewiz（苏州，中国）合成。所有质粒均使用MultiF Seamless Assembly Mix（ABclonal，武汉，中国）进行组装。所得重组质粒经I-SceI或NotI酶线性化后，通过醋酸锂转化法转化至解脂耶氏酵母中，并随机整合至基因组。
【数据】聚合酶：Phanta Super-Fidelity DNA polymerase（Vazyme）；组装试剂：MultiF Seamless Assembly Mix（ABclonal）；线性化酶：I-SceI或NotI；转化方法：醋酸锂转化法
2.3 角鲨烯的提取
为提取胞内角鲨烯，将1 mL发酵液、400 μL十二烷和1 g石英砂加入5 mL微量离心管中，使用研磨仪在65 Hz条件下研磨15 min。随后将混合物在12,000 rpm离心7 min，收集有机层用于气相色谱（GC）检测。为提取胞外角鲨烯，取约5 mL发酵液在12,000 rpm离心7 min，收集上层有机层并进行GC分析。
【数据】胞内提取：1 mL发酵液 + 400 μL十二烷 + 1 g石英砂；研磨：65 Hz，15 min；离心：12,000 rpm，7 min；胞外提取：5 mL发酵液，12,000 rpm，7 min
2.4 3-L生物反应器补料分批发酵
工程菌株E25用于3-L生物反应器补料分批发酵，装液量为1.8 L YPD培养基和180 mL十二烷，温度28°C，通气量2 vvm。D-葡萄糖初始浓度设为50 g/L，连续添加YPD培养基（含20 g/L酵母提取物、40 g/L蛋白胨和600 g/L葡萄糖），以维持葡萄糖水平保持在检测限以下。每24 h取样测定OD600以及胞外和胞内角鲨烯产量。
【数据】反应器：3-L；装液量：1.8 L YPD + 180 mL十二烷；温度：28°C；通气量：2 vvm；初始葡萄糖：50 g/L；补料培养基：20 g/L酵母提取物 + 40 g/L蛋白胨 + 600 g/L葡萄糖；取样间隔：24 h
研究结果
3.1 工程化改造解脂耶氏酵母角鲨烯生物合成途径
角鲨烯是酵母甾醇生物合成的中间产物。野生型菌株解脂耶氏酵母Po1f产角鲨烯7.97 mg/L。为提高解脂耶氏酵母的角鲨烯产量，本研究过表达了从乙酰辅酶A到角鲨烯生物合成途径中所有酶的编码基因（图1A）。过表达来自大肠杆菌的AtoB、来自Bordetella petrii的HMGS以及内源HMGR和ERG12，将角鲨烯产量提高至86.07 mg/L（图1B）。进一步过表达ERG8、ERG19、IDI和ERG20，使角鲨烯产量提升至114.93 mg/L。同时表达ERG9和ERG20后，角鲨烯产量达133.72 mg/L（13.06 mg/g DCW）（图1B）。
乙酰辅酶A是萜类生物合成的关键前体。在菌株E2中过表达ACL1、ACL2、YHM2和AMPD后，ACL1和YHM2的过表达使角鲨烯产量提高至408.11 mg/L。ACL1和YHM2的过表达可能显著提高了胞质乙酰辅酶A水平，最终增强了角鲨烯的合成。为进一步提高乙酰辅酶A向甲羟戊酸的转化效率，表达了来自粪肠球菌的EfMvaE和EfMvaSA110G（图1A），工程菌株E12的角鲨烯产量达1299.55 mg/L（67.66 mg/g DCW）。上述工程策略使角鲨烯产量较Po1f提高了160倍（图1B）。
【数据】Po1f产量：7.97 mg/L；过表达AtoB+HMGS+HMGR+ERG12后：86.07 mg/L；过表达ERG8+ERG19+IDI+ERG20后：114.93 mg/L；过表达ERG9+ERG20后：133.72 mg/L（13.06 mg/g DCW）；过表达ACL1+YHM2后：408.11 mg/L；菌株E12：1299.55 mg/L（67.66 mg/g DCW）；提高倍数：160倍
3.2 工程化改造ABC转运蛋白促进解脂耶氏酵母角鲨烯分泌
角鲨烯是一种膜不透性萜类化合物，在胞内积累，过量的胞内积累常造成不利的代谢负担，从而限制萜类产量的进一步提高。为促进角鲨烯分泌，通过多序列比对在解脂耶氏酵母中鉴定了5个潜在的内源ABC转运蛋白：YOL075c、SNQ2、PDR15、ABC2和PDR5。评估了ABC转运蛋白介导角鲨烯外排的能力，结果显示过表达SNQ2显著提高了角鲨烯分泌量至45.13 mg/L，较亲本菌株E12提高了68%，而其他转运蛋白无显著效果（图2B）。这些结果表明SNQ2是解脂耶氏酵母中介导角鲨烯外排的主要输出蛋白。
OSH家族在酿酒酵母中已知可结合并转运甾醇和磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）（图2A）。OSH蛋白与ABC转运蛋白协同作用，已被证明可促进酿酒酵母中角鲨烯的外排。解脂耶氏酵母的OSH家族有4个成员：OSH1、OSH3、OSH4和OSH6。为验证解脂耶氏酵母OSH家族成员是否能转运角鲨烯，在过表达SNQ2的工程菌株中分别过表达OSH3、OSH4和OSH6基因。其中，仅OSH3过表达提高了胞外角鲨烯水平，达77.60 mg/L（3.39 mg/g DCW），为工程菌株E17的1.64倍（图2C）。相比之下，OSH4和OSH6的过表达对胞外角鲨烯水平影响甚微。此外，分子对接分析表明OSH3ORD与角鲨烯的结合自由能最低（图2D）。上述发现表明，解脂耶氏酵母内源OSH3可与SNQ2协同促进角鲨烯的胞外分泌。
【数据】SNQ2过表达：45.13 mg/L，较E12提高68%；OSH3过表达：77.60 mg/L（3.39 mg/g DCW），为E17的1.64倍；OSH4/OSH6过表达：无显著效果
3.3 设计载体蛋白介导的代谢物转运系统促进解脂耶氏酵母角鲨烯分泌
尽管ABC转运蛋白工程促进了角鲨烯的分泌，但胞外水平仍然较低。载体蛋白介导的囊泡运输代谢物转运系统已被证明可有效促进角鲨烯分泌。本研究开发了一种新的载体蛋白介导的代谢物转运系统，以增强解脂耶氏酵母的角鲨烯分泌（图3A）。本研究发现解脂耶氏酵母的OSH3可促进角鲨烯转运。因此，将ORD结构域（脂质结合结构域）作为载体蛋白，与分泌信号肽融合，携带角鲨烯进行分泌。将先前报道的tSPF与Lip2pre（脂肪酶2）融合仅分泌59.56 mg/L角鲨烯，而将OSH3ORD与Lip2pre融合后，分泌量提高至84.2 mg/L，为对照菌株E12的1.62倍，比tSPF过表达菌株高0.41倍（图3B）。这些修饰对细胞生长无显著影响（图S2）。相比之下，单独过表达OSH3ORD并不能促进角鲨烯的胞外分泌（图3B）。这些发现表明，带有分泌信号肽的内源OSH3ORD在角鲨烯分泌中发挥有效作用。
在分泌途径中，信号肽（SPs）在决定分泌效率方面起关键作用。本研究测试了6种信号肽的分泌效率：Lip2pre、Lip2pre-3xLA、Xpr2（碱性胞外蛋白酶2）、Sp1（YALI0B03564g）、Sp3（YALI0E22374g）和Sp4（YALI0D06039g）。已有研究表明这6种信号肽可促进异源淀粉分解酶在解脂耶氏酵母中的胞外分泌。随后将每种信号肽与OSH3ORD融合，并导入工程菌株E12中。在这些信号肽中，Lip2pre-3xLA表现出最高的角鲨烯分泌效率（144.67 mg/L，8.53 mg/g DCW），其次是Xpr2（120.53 mg/L）和Sp3（111.47 mg/L）（图3C）。这些发现凸显了信号肽选择在优化解脂耶氏酵母胞外角鲨烯产量中的关键作用。在测试的信号肽中，Lip2pre-3xLA表现最佳。
与ABC转运蛋白相比，带有分泌信号肽的OSH3ORD在内质网中折叠，而角鲨烯正是在内质网中合成的。因此，载体蛋白可在内质网中接触角鲨烯，并通过囊泡运输将其携带至胞外。不同的是，ABC转运蛋白位于质膜上，无法主动接触角鲨烯，只能在角鲨烯靠近质膜时进行转运。因此，载体蛋白介导的转运效率高于ABC转运蛋白。基于OSH3ORD的代谢物转运系统也被证明可有效促进产β-胡萝卜素的工程解脂耶氏酵母菌株中β-胡萝卜素的分泌（见补充材料）（图S1和图S3）。这些结果表明该系统在促进疏水性萜类分泌方面具有一定程度的通用性。
【数据】tSPF+Lip2pre：59.56 mg/L；OSH3ORD+Lip2pre：84.2 mg/L（E12的1.62倍，tSPF菌株的1.41倍）；OSH3ORD单独过表达：无分泌促进效果；Lip2pre-3xLA：144.67 mg/L（8.53 mg/g DCW）；Xpr2：120.53 mg/L；Sp3：111.47 mg/L
3.4 工程解脂耶氏酵母菌株在3-L生物反应器中的补料分批发酵
在3-L生物反应器中对E25进行补料分批发酵，以评估工程菌株的生产性能。葡萄糖作为初始碳源，十二烷按1:10的体积比加入YPD培养基作为萃取剂。葡萄糖耗尽后，持续向反应器补加培养基。定量检测胞内和胞外角鲨烯浓度。最终，角鲨烯总产量达12.61 g/L。胞内产量为9.18 g/L，胞外产量为3.43 g/L，占总产量的27.2%（图4）。与摇瓶产量相比，角鲨烯生物合成量提高了8.07倍。据作者所知，本研究报告的胞外角鲨烯产量是迄今报道的最高分泌滴度。
【数据】总产量：12.61 g/L；胞内：9.18 g/L；胞外：3.43 g/L（占27.2%）；较摇瓶提高：8.07倍
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程和分泌工程策略，成功实现了解脂耶氏酵母中角鲨烯的高效胞外分泌。首先过表达角鲨烯生物合成途径全部酶基因，结合乙酰辅酶A供应增强和异源甲羟戊酸途径引入，使总产量较野生型提高160倍。随后筛选ABC转运蛋白，发现SNQ2是主要的角鲨烯外排蛋白。更重要的是，研究开发了基于OSH3ORD载体蛋白与信号肽融合的代谢物转运系统，利用囊泡运输实现角鲨烯的主动分泌。信号肽筛选进一步将分泌效率提升至144.67 mg/L。在3-L生物反应器补料分批发酵中，工程菌株E25实现3.43 g/L的胞外角鲨烯分泌，占总产量的27.2%，为迄今最高分泌水平。
编译者解读：该研究的核心亮点在于突破性地设计了载体蛋白介导的代谢物转运系统，巧妙利用角鲨烯合成位点（内质网）与载体蛋白折叠位置的时空耦合，实现了膜不透性萜类的主动外排。这一策略相较于传统ABC转运蛋白被动外排具有明显效率优势，且被证实对β-胡萝卜素同样有效，具备一定的通用性。从合成生物学应用角度看，该系统为其他膜不透性高价值萜类化合物的微生物分泌生产提供了可借鉴的平台。不过，胞外分泌仅占总产量的27.2%，仍有较大提升空间；此外，载体蛋白与货物分子的结合机制及囊泡运输的调控细节尚待进一步阐明。
参考来源
Chai L. Secretory and metabolic engineering of squalene in Yarrowia lipolytica. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132171
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132171