来源：Efficient production of retinol in Yarrowia lipolytica via synergistic enzyme and redox engineering（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
视黄醇（维生素A）是人体必需的脂溶性微量营养素。本研究以高产番茄红素的解脂耶氏酵母F11为底盘，通过强化前体供应、引入β-胡萝卜素双加氧酶（Blh）和视黄醇脱氢酶（RDH12）构建视黄醇合成途径，并借助定向进化、辅因子工程及氧化酶基因敲除等策略，最终在5-L补料分批发酵中实现8.92 g·L⁻¹的视黄醇产量，为目前微生物发酵生产视黄醇的最高报道水平。
研究背景
视黄醇（维生素A）是人体必需的脂溶性维生素，在视觉功能、免疫调节和细胞分化中发挥关键作用，广泛用作食品、制药和化妆品行业的营养添加剂。该化合物最初从鱼肝油中分离，1940年代被正式命名为视黄醇。目前视黄醇生产方法分为天然提取、化学合成和微生物发酵三类，其中化学合成（尤其是优化的Roche工艺）主导全球生产——该方法以β-紫罗兰酮（C14）和乙炔（或其他C6合成子）构建视黄醇碳骨架，再经系列复杂步骤合成视黄醇。然而，传统方法存在合成路线长、使用危险化学品、高压条件以及"三废"处理带来的严重环境/安全风险等问题。微生物合成凭借绿色可持续、高效可控、易放大等优势，成为极具前景的替代方案。已有研究在大肠杆菌等多种微生物宿主中开展视黄醇合成途径的代谢工程改造。
研究方法
2.1 菌株与培养基
以具有高番茄红素生产能力的解脂耶氏酵母F11菌株作为亲本宿主菌株。大肠杆菌JM109用于表达载体的构建。质粒在37°C下于添加氨苄青霉素或卡那霉素（100 mg·L⁻¹）的液体或固体LB培养基中培养。解脂耶氏酵母在30°C下于含氨基酸（0.5 g·L⁻¹）的酵母氮碱基（YNB）培养基（6.74 g·L⁻¹酵母氮碱基粉末，20 g·L⁻¹葡萄糖）或酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基（20 g·L⁻¹蛋白胨，20 g·L⁻¹葡萄糖，10 g·L⁻¹酵母提取物）中培养。发酵培养使用摇瓶或深孔板进行。固体YNB培养基（不含亮氨酸补充）用于筛选阳性转化菌株（见补充材料）。
【数据】菌株：解脂耶氏酵母F11、大肠杆菌JM109；抗生素浓度：100 mg·L⁻¹；温度：37°C（大肠杆菌）/30°C（酵母）；YNB培养基：6.74 g·L⁻¹酵母氮碱基粉末+20 g·L⁻¹葡萄糖+0.5 g·L⁻¹氨基酸；YPD培养基：20 g·L⁻¹蛋白胨+20 g·L⁻¹葡萄糖+10 g·L⁻¹酵母提取物
2.2 酵母表达载体与酵母菌株的构建
本研究中使用的所有外源基因的密码子优化和合成均由GENCEFE Biotech（中国无锡）完成。所有序列使用高保真DNA聚合酶（Vazyme，中国南京）通过聚合酶链式反应（PCR）扩增。重组使用Gibson一步克隆酶（Abclon，中国武汉）进行。大肠杆菌感受态细胞使用大肠杆菌感受态细胞试剂盒（Takara，日本大阪）制备。多拷贝整合工具和酵母菌株构建采用先前建立的方案进行。酵母转化使用购自Zymo Research（美国佛罗里达州奥兰治县）的酵母转化试剂盒完成。转化后，酵母细胞涂布于选择性培养基上，在30°C孵育2–3天后进行菌落验证。实验中使用的基因和质粒见补充材料。
【数据】PCR酶：高保真DNA聚合酶（Vazyme）；重组酶：Gibson一步克隆酶（Abclon）；转化试剂盒：Zymo Research酵母转化试剂盒；孵育条件：30°C，2–3天
2.3 工程酵母的培养
小规模发酵在摇瓶中进行。挑选生长良好的单菌落接种于YPD培养基中，30°C培养16小时制备种子培养液。随后，种子培养液以5%（v/v）的接种量转接至含25 mL YPD培养基的250-mL摇瓶中，在220 rpm、30°C条件下培养4天。
补料分批发酵在5-L生物反应器中进行。单菌落最初接种于含25 mL YPD培养基的250-mL摇瓶中，在220 rpm、30°C下培养16小时制备一级种子培养液。随后，一级种子培养液以5%体积比接种至含200 mL YPD培养基的2-L摇瓶中，在相同条件下培养16小时获得二级种子培养液。补料分批发酵在5-L发酵罐中进行，将全部200 mL二级种子培养液接种至2.2 L培养基中，初始OD600为0.7。发酵过程中，添加50%（v/v）氨水控制pH为6.5。发酵温度维持在28°C，空气流速设为3.0 vvm，通过调节搅拌速度将溶解氧（DO）水平维持在约20%饱和度。发酵罐中初始葡萄糖浓度为40 g·L⁻¹。在初始葡萄糖完全耗尽前启动补料策略。使用葡萄糖生物传感器分析仪（Sieman，中国深圳）监测残余葡萄糖浓度，并调整补料速率以维持发酵罐中残余葡萄糖浓度约为1 g·L⁻¹（补料葡萄糖溶液浓度为500 g·L⁻¹）。向罐内培养基、补料培养基和葡萄糖补料溶液中添加10%吐温80，以促进视黄醇的提取过程。
【数据】摇瓶发酵：250-mL摇瓶含25 mL YPD，220 rpm，30°C，4天；接种量：5%（v/v）；种子培养：30°C，16小时；5-L发酵罐：初始OD600=0.7，pH 6.5（50%氨水控制），温度28°C，空气流速3.0 vvm，DO约20%饱和度；初始葡萄糖：40 g·L⁻¹；残余葡萄糖维持：约1 g·L⁻¹；补料葡萄糖浓度：500 g·L⁻¹；吐温80浓度：10%
2.4 细胞破碎与产物提取
取200 µL发酵液，使用Lysing Matrix Tubes（MP Biomedicals，美国）提取番茄红素。样品在12,000 g离心5分钟，弃去上清液。所得沉淀用PBS或去离子水洗涤两次。加入与细菌沉淀等量的玻璃珠（直径0.5 mm，Biospec，美国），以及1.5 mL二氯甲烷作为萃取剂。使用FastPrep-24 5G（MP Biomedicals，美国）破碎3–5次，机器运行2–3次后打开盖子冷却。最终混合物在12,000 g离心5分钟。用注射器取出上清液，经0.22 µm针头过滤器（Titan，中国上海）过滤后进行HPLC分析。
取1.5 mL离心管中200 µL细胞悬液用于β-胡萝卜素和胞内视黄醇的提取。在12,000 g离心5分钟后，去除上清液，用PBS（磷酸盐缓冲液）或去离子水洗涤2–3次，加入750 µL二甲基亚砜（DMSO），使用Vortex-Genie2（Scientific Industries，美国）振荡重悬，然后置于恒温金属浴（MIULAB，中国杭州）中在55°C反应15分钟。此后，加入750 µL丙酮，充分混合后在45°C反应10分钟。所得溶液经注射器过滤（0.22 µm）后进行HPLC分析。
胞外视黄醇的提取：收集适量发酵液，在12,000 g离心5分钟。取50 µL上清液与950 µL丙酮混合，充分涡旋，经0.22 µm注射器过滤，使用高效液相色谱（HPLC）分析。
【数据】番茄红素提取：200 µL发酵液，12,000 g离心5 min，二氯甲烷1.5 mL，玻璃珠0.5 mm，FastPrep-24 5G破碎3–5次；β-胡萝卜素/胞内视黄醇提取：200 µL细胞悬液，12,000 g离心5 min，DMSO 750 µL，55°C 15 min，丙酮750 µL，45°C 10 min；胞外视黄醇提取：50 µL上清+950 µL丙酮
2.5 分析方法
含类胡萝卜素的有机相分析使用SHIMADZU LC-20AT HPLC系统，配备可变波长检测器和SHIMADZU Shim-pack Velox Biphenyl色谱柱（2.7 µm，4.6 × 150 mm）。番茄红素和β-胡萝卜素检测：流动相为含0.1%无水甲酸的乙腈，流速1.2 mL·min⁻¹，进样量10 µL，柱温35°C，运行时间20分钟，检测波长350 nm。视黄醇检测：流动相为甲醇，流速0.8 mL·min⁻¹，进样量10 µL，柱温40°C，运行时间15分钟，检测波长325 nm。使用分光光度计（722 N，菁华，中国上海）测量OD600。本实验使用的视黄醇（纯度≥95%）、β-胡萝卜素（纯度≥96%）和番茄红素（纯度≥98%）标准品均购自阿拉丁（中国上海）。每种标准品溶于丙酮并稀释，制备浓度梯度为400、200、100、50、25和20（mg/L）的标准溶液系列。通过HPLC测定各标准溶液的峰面积。以标准溶液浓度为横坐标、测定值为纵坐标构建标准曲线，所得相关系数（R²）均大于0.999，表明线性关系良好。
【数据】HPLC条件（番茄红素/β-胡萝卜素）：流速1.2 mL·min⁻¹，柱温35°C，检测波长350 nm，运行20 min；HPLC条件（视黄醇）：流速0.8 mL·min⁻¹，柱温40°C，检测波长325 nm，运行15 min；标准品纯度：视黄醇≥95%，β-胡萝卜素≥96%，番茄红素≥98%；标准曲线浓度：400/200/100/50/25/20 mg/L；R²>0.999
研究结果
3.1 构建基于番茄红素的视黄醇生产菌株
通过将β-胡萝卜素合成模块和视黄醇合成模块引入Ly01菌株，获得视黄醇生产菌株（图2A）。首先对Ly01的番茄红素生产进行优化以增强前体积累。牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）是解脂耶氏酵母中番茄红素的前体，GGPP由八氢番茄红素合酶和番茄红素脱氢酶催化产生番茄红素。为筛选高效的番茄红素脱氢酶，整合了来自深黄被孢霉（Mucor circinelloides）的八氢番茄红素合酶CarRP，并测试了来自不同来源的多种脱氢酶。
首先，为评估同源酶系统内的协同效应，选择了与先前整合的八氢番茄红素合酶CarRP同源的深黄被孢霉CarB。其次，引入粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的AL-1——一种来自子囊菌门的经典真菌脱氢酶，作为公认的性能基准。关于细菌来源的酶，关注了微生物代谢工程中广泛验证的CrtI蛋白，并选择了三种以天然高效类胡萝卜素生物合成著称的细菌来源CrtI蛋白，分别来自成团泛菌（Pantoea ananatis）、荚膜红细菌（Rhodobacter capsulatus）和类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）。这些番茄红素脱氢酶分别在E4位点单独表达，产生番茄红素生产菌株Ly01-1、Ly01-2、Ly01-3、Ly01-4和Ly01-5。结果显示，Ly01-1菌株（整合CarB）产生了更高的番茄红素滴度（1153.3 mg·L⁻¹）（图2B）。
在Ly01菌株的E4位点共表达CarB和CrtE，生成Ly02，其番茄红素滴度增加至1206 mg·L⁻¹。为增强β-胡萝卜素合成，在E5位点引入两个不同基因：来自深黄被孢霉的β-胡萝卜素环化酶CarRP和来自红发夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）的CrtYB，分别生成Ca01-1和Ca01-2。结果表明，引入CrtYB导致更高的β-胡萝卜素滴度并减少番茄红素积累（46.7 mg·L⁻¹）。在rDNA位点进一步过表达CrtYB，所得Ca02菌株的β-胡萝卜素滴度达到822.7 mg·L⁻¹（图2C）。
来自未培养海洋细菌的β-胡萝卜素15,15′-双加氧酶（Blh）和来自人的视黄醇脱氢酶（RDH12）被异源表达，以构建视黄醇生产的从头生物合成途径。这两种酶在rDNA位点过表达，产生Re01菌株。为提高视黄醇产量，基于不同萃取剂和浓度梯度试验（见补充材料），最终选择10%（v/v）浓度的吐温80作为添加到培养基中的萃取剂。在YPD培养基中30°C摇瓶发酵96小时后，视黄醇滴度达到389.6 mg·L⁻¹（图2D）。
在解脂耶氏酵母中通过模块化协同工程强化了视黄醇合成途径。结果表明，来自不同来源的功能等效酶在相同遗传背景下表现出显著差异。例如，CarB和CrtYB优于其他同源酶，这可能归因于其更好的密码子适应性、蛋白质溶解性和辅因子兼容性。这些发现强调了酶选择和工程化是途径优化的关键策略。Blh和RDH12的表达，结合吐温80原位萃取，有效缓解了反馈抑制和细胞毒性，实现了389.6 mg·L⁻¹的视黄醇滴度。该方法为疏水性化合物的微生物生产提供了有价值的参考。此外，CrtYB不仅在β-胡萝卜素合成模块中表现出比CarRP更高的环化酶活性，还显著减少了番茄红素积累。这表明CrtYB能更有效地将代谢流推向下游，避免中间产物的无效积累。最后，在引入Blh和RDH12构建完整的视黄醇生物合成途径后，吐温80原位萃取使胞内和胞外视黄醇产量均得到提高。作为一种非离子表面活性剂，吐温80在解脂耶氏酵母视黄醇生产发酵体系中发挥双重作用：其疏水部分结合亲脂性视黄醇并将产物包裹在胶束中，从而减少胞内视黄醇积累并缓解合成途径中关键酶的反馈抑制。该策略验证了在解脂耶氏酵母中构建从番茄红素到视黄醇的完整合成途径的可行性。
【数据】番茄红素滴度：Ly01-1（CarB）为1153.3 mg·L⁻¹，Ly02为1206 mg·L⁻¹；β-胡萝卜素滴度：Ca02为822.7 mg·L⁻¹；番茄红素残留：46.7 mg·L⁻¹（Ca01-2）；视黄醇滴度：389.6 mg·L⁻¹（Re01，含10%吐温80，30°C，96 h）
3.2 限速酶的鉴定与蛋白质工程
Blh在视黄醇合成途径中将一分子β-胡萝卜素对称切割为两分子视黄醛，RDH12将视黄醛还原为视黄醇。Ca02菌株产生822.7 mg·L⁻¹的β-胡萝卜素，而Re01仅产生389.6 mg·L⁻¹的视黄醇，转化率为40.5%。为鉴定视黄醇生物合成途径中的限速酶，本研究以视黄醇生产菌株Re01作为底盘细胞进行靶向遗传修饰实验。将Blh和RDH12两个关键功能基因分别整合到Re01的同一基因组位点，使用相同的启动子和终止子元件驱动其表达，从而确保实验结果的可靠性。随后的发酵测定和视黄醇滴度定量分析表明，携带Blh基因的重组菌株与野生型Re01菌株相比，视黄醇滴度显著增加。相比之下，表达RDH12的重组菌株在视黄醇产量上仅表现出微小波动，与野生型对照组无统计学显著差异（图3A）。
基于上述比较实验结果，可以明确得出结论：Blh是视黄醇生物合成途径中的限速酶。由于PDB数据库中没有与Blh序列同一性大于15%的已解析结构，使用AlphaFold3进行建模以确定Blh的近似结构。模型的高置信度分数表明其具有一定可靠性。考虑到前体胡萝卜素是对称的长链线性烯烃，其与酶的主要相互作用涉及疏水相互作用和π-π堆积相互作用。此外，Blh结构主要由九个α-螺旋组成（图3B），具有简单的酶学架构和易于识别的潜在活性位点。使用Rosetta Dock将Blh与胡萝卜素对接以进一步确定酶的精确活性位点，生成200个对接结构。选择能量最低的结构进行后续分析。根据UniProt数据库，Blh是铁依赖性双加氧酶。此类酶通常需要His或Glu残基与Fe²⁺形成配位键并激活O₂。对Blh与胡萝卜素对接构象的分析显示，胡萝卜素近似几何中心（C-C键）周围有四个His残基。推测反应涉及两个His残基利用其Nε原子与Fe²⁺形成配位键并激活O₂。对His21、His78、His188和His256残基引入成对和单独丙氨酸替换，以筛选与Fe²⁺配位的氨基酸残基（图3C）。结果表明，H78A/H188A-Blh变体保留其活性，且……
【数据】β-胡萝卜素产量：822.7 mg·L⁻¹（Ca02）；视黄醇产量：389.6 mg·L⁻¹（Re01）；转化率：40.5%；Blh结构：9个α-螺旋；对接结构数：200个；突变位点：His21、His78、His188、His256；H78A/H188A-Blh变体保留活性
讨论与解读
本研究通过多模块协同实现了解脂耶氏酵母中视黄醇的高效生物合成。首先，构建了具有高番茄红素/β-胡萝卜素滴度的底盘细胞。随后，通过丙氨酸扫描对关键酶Blh进行工程化改造以提高催化效率。敲除HFD3和FADH减少了视黄醇降解并平衡了辅因子竞争。增强NADPH再生（POS5表达）和前体供应（ACL1/2、ACS-AMPD共表达）进一步增加了途径通量。最终，在5-L补料分批发酵中实现8.92 g·L⁻¹的视黄醇产量，葡萄糖转化率为29.7 mg/g，凸显了高萜类化合物生产的整合策略。
编译者解读
该研究是典型的"平台菌株+多模块协同"策略在脂溶性维生素合成中的成功示范。值得关注的是，研究者没有停留在简单的途径组装，而是系统性地解决了三个核心瓶颈：限速酶Blh催化效率低（通过AlphaFold3建模+丙氨酸扫描定向进化）、胞内氧化还原失衡（通过敲除氧化酶基因和增强NADPH再生）、产物反馈抑制与细胞毒性（通过吐温80原位萃取）。8.92 g·L⁻¹的产量达到目前微生物发酵生产视黄醇的最高水平，表明解脂耶氏酵母凭借其强大的乙酰-CoA和NADPH供应能力，正成为脂溶性萜类化合物生产的优选底盘。该策略对其它疏水性萜类维生素（如维生素E、辅酶Q10）的微生物生产具有直接借鉴价值。不过，葡萄糖转化率（29.7 mg/g）仍有优化空间，工业化应用还需考量吐温80的回收与产品纯化成本。
参考来源
Li J. Efficient production of retinol in Yarrowia lipolytica via synergistic enzyme and redox engineering. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134041
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134041