来源：Sustainable high-titer production of β-elemene in Yarrowia lipolytica via modular engineering, pathway refactoring, and a chimeric germacrene A synthase（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
β-榄香烯是一种具有抗肿瘤活性的倍半萜化合物，传统植物提取面临产量低、纯化难与环境问题。本研究以产油酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）为底盘，整合启动子工程、蛋白质设计、途径重构与亚细胞区室化四大策略，构建了高效合成β-榄香烯的细胞工厂。通过筛选获得优势内源启动子P_TMAL，理性设计嵌合型大根香叶烯A合酶L1H2H3-V436LH4，并结合过氧化物酶体MVA途径区室化与脂代谢调控，最终在5-L生物反应器中实现52.53 g/L的β-榄香烯产量，为目前报道的最高水平。
研究背景
萜类化合物是自然界中种类繁多、结构多样的次生代谢产物，其中倍半萜因异戊二烯骨架的重排与修饰而呈现出最丰富的结构多样性，在医药、营养保健品、生物燃料、香料及化妆品领域具有广阔应用前景。β-榄香烯是由大根香叶烯A经Cope重排生成的倍半萜化合物，主要从传统中药材温郁金的成熟块茎中提取，对多种癌症具有强效抗肿瘤活性，可与其他药物联用以提高疗效并克服肿瘤耐药性。然而，当前β-榄香烯的生产高度依赖植物提取，成本高昂；化学合成则面临产率低、催化剂昂贵和环境不友好等挑战。近年来，微生物细胞工厂在酿酒酵母、大肠杆菌、毕赤酵母、多形汉逊酵母和解脂耶氏酵母等宿主中实现了β-榄香烯和大根香叶烯A的异源合成，但不同宿主对同一来源的大根香叶烯A合酶（GAS）往往表现出明显的偏好性差异，底盘选择与酶适配仍是关键瓶颈。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
本研究所用菌株列于表S1。大肠杆菌JM109用于质粒构建，在37°C下于Luria-Bertani培养基（LB：10 g/L NaCl，10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物）中培养，必要时添加100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素。以解脂耶氏酵母菌株（ATCC MYA-2613）为起始菌株。酵母细胞在30°C下于酵母蛋白胨葡萄糖培养基（YPD：10 g/L酵母提取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖）中培养。基础培养基YNB、YNB-URA或YNB-LEU（20 g/L葡萄糖，20 g/L琼脂，6.7 g/L无氨基酸酵母氮源，需要时添加0.1 g/L尿嘧啶或0.1 g/L L-亮氨酸）用于筛选酵母转化子。菌株在含1 g/L 5-FOA的YPD平板上培养以回收URA3标记。
【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；LB培养基：10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物；抗生素：100 μg/mL氨苄青霉素或50 μg/mL卡那霉素；酵母培养温度：30°C；YPD培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖；YNB筛选培养基：20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂、6.7 g/L无氨基酸酵母氮源、0.1 g/L尿嘧啶或0.1 g/L L-亮氨酸；5-FOA浓度：1 g/L
2.2 质粒与菌株构建
聚合酶链式反应（PCR）扩增使用Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶（Vazyme Biotech，南京，中国）。PCR片段经HiPure凝胶纯化DNA试剂盒（Magen Biotech，广州，中国）纯化。所有质粒使用购自TransGen Biotech Co., Ltd.（北京，中国）的Basic Seamless Cloning and Assembly Kit构建，列于表S2。质粒提取使用FlaPure Mini质粒试剂盒（Genesand Biotech，北京，中国）。含表达盒的线性质粒通过Thermo Fisher Scientific（Waltham，MA）的限制性内切酶消化获得，随后整合入基因组。异源基因经密码子优化适配解脂耶氏酵母，由北京擎科生物科技有限公司（北京，中国）合成，本研究所用GAS基因和内源DNA序列列于表S3。解脂耶氏酵母的DNA转化使用Frozen-EZ酵母转化II试剂盒（Zymo Research，Tustin）。质粒和菌株构建的详细流程见补充信息。引物由擎科生物（北京，中国）合成，列于表S4。菌株构建流程如图S1所示。
【数据】PCR聚合酶：Phanta Super-Fidelity DNA聚合酶；质粒构建试剂盒：Basic Seamless Cloning and Assembly Kit；质粒提取试剂盒：FlaPure Mini Plasmid Kit；转化试剂盒：Frozen-EZ酵母转化II试剂盒；基因合成：密码子优化后由北京擎科生物合成；引物合成：擎科生物
2.3 摇瓶培养
摇瓶培养中，种子培养通过将单菌落接种至3 mL YPD培养基中，在旋转摇床中30°C、220 rpm培养24 h制备。随后将培养物转移至新鲜3 mL YPD培养基中，30°C培养8 h。之后将培养物转移至含50 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，初始OD600为0.1。培养物在30°C、220 rpm振荡培养72 h。结果以三个独立生物学样本的平均值±标准差表示。圆点代表数据点，误差棒代表标准差。显著性p值来自双尾t检验。表示p值小于0.05，表示p值小于0.01，表示p值小于0.001，****表示p值小于0.0001。
【数据】种子培养：3 mL YPD、30°C、220 rpm、24 h；二次活化：3 mL YPD、30°C、8 h；摇瓶发酵：250 mL摇瓶含50 mL YPD、初始OD600=0.1、30°C、220 rpm、72 h；统计分析：三个独立生物学样本，双尾t检验
2.4 补料分批发酵
补料分批发酵中，工程菌株EME-82按以下流程培养：首先将EME-82单菌落接种至5 mL YPD培养基中，30°C、220 rpm振荡培养24 h。然后将培养物转移至含100 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，相同条件下再培养24 h制备种子液。最后将种子液接种至初始工作体积为2 L的5 L生物反应器中，48 h时启动补料分批发酵。改良丰富培养基组成为：葡萄糖10 g/L，酵母提取物20 g/L，蛋白胨40 g/L。发酵参数控制如下：温度维持在30°C，pH通过自动添加3 M NaOH调节至5.5，溶解氧（pO₂）通过级联控制搅拌速度（300–900 rpm）维持在30%空气饱和度，通气速率恒定为2.0 vvm（体积/体积/分钟）。泡沫通过添加消泡剂204（Sigma-Aldrich，St. Louis，MO）控制。补料在培养24 h时启动，以甘油（从500 g/L储备液）进行补料。发酵开始时向生物反应器中添加400 mL十二烷以促进β-榄香烯的萃取。发酵样品每12 h采集一次，用于代谢物分析和滴度测定。
【数据】种子培养：5 mL YPD、30°C、220 rpm、24 h；二级种子：100 mL YPD、30°C、220 rpm、24 h；5-L反应器初始工作体积：2 L；补料启动时间：48 h；改良丰富培养基：葡萄糖10 g/L、酵母提取物20 g/L、蛋白胨40 g/L；温度：30°C；pH：5.5（3 M NaOH自动调节）；pO₂：30%空气饱和度；搅拌速度：300–900 rpm级联控制；通气速率：2.0 vvm；消泡剂：204（Sigma-Aldrich）；补料启动时间：24 h；甘油储备液：500 g/L；十二烷添加量：400 mL；采样间隔：12 h
2.5 生物量测定、代谢物萃取与定量
光密度（OD）使用TU-1901系列紫外分光光度计在600 nm处测定。为简化β-榄香烯的萃取，培养前向培养基中添加4% v/v无菌十二烷。有机相以4000 g离心10 min。随后收集的十二烷以1:25比例用十二烷稀释，并与100 mg/L β-石竹烯内标以1:1比例混合。最后，十二烷相中β-榄香烯的滴度使用配备HP-5 ms气相色谱柱（15 m × 0.25 mm × 0.25 μm）的GC-MS（Agilent 7890B气相色谱仪，Agilent 7000D质谱仪）分析。GC-MS分析条件如下：起始温度80°C保持1 min，然后以30°C/min升温至140°C保持5 min，再以10°C/min升温至170°C保持1 min，最后以30°C/min升温至290°C保持5 min。氦气为载气，恒定流速1.5 mL/min。β-榄香烯的保留时间为8.9 min。β-榄香烯标准品购自北京索莱宝科技有限公司（北京，中国）。葡萄糖和甘油浓度通过配备蒸发光散射检测器（ELSD）和Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA）的Shimadzu LC-20A高效液相色谱（HPLC）系统测定。等度洗脱以0.1%（v/v）甲酸水溶液为流动相，恒定流速0.4 mL/min。柱温维持在60°C，进样体积10 μL。
【数据】OD测定波长：600 nm；十二烷添加量：4% v/v；离心条件：4000 g、10 min；稀释比例：1:25；内标：100 mg/L β-石竹烯，1:1混合；GC-MS：Agilent 7890B/7000D，HP-5 ms柱（15 m × 0.25 mm × 0.25 μm）；GC程序：80°C 1 min→30°C/min至140°C 5 min→10°C/min至170°C 1 min→30°C/min至290°C 5 min；载气：氦气，1.5 mL/min；β-榄香烯保留时间：8.9 min；HPLC：Shimadzu LC-20A，ELSD检测器，Aminex HPX-87H柱；流动相：0.1%甲酸水溶液，0.4 mL/min；柱温：60°C；进样量：10 μL
2.6 大根香叶烯A合酶的分子建模
首先，使用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）构建GAS的同源结构。底物法尼基焦磷酸（FPP）的结构从PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载。随后，使用AutoDock Vina（Center for Computational Structural Biology，La Jolla，CA，USA）对野生型和突变体GAS与底物FPP及Mg²⁺进行分子对接。其中，Mg²⁺的对接模式和对接位点基于催化机制和模板晶体结构确定。GAS中的FPP结合口袋使用proteins.plus平台（https://proteins.plus/）预测。相关图像使用PyMOL软件（DeLano Scientific，South San Francisco，CA，USA）生成。使用Amber22软件包进行分子动力学模拟。分子动力学模拟使用ff19SB力场，系统以OPC水模型溶剂化。基于库仑势网格添加Na⁺离子以保持所有系统电中性。整个系统使用组合最速下降法进行完全最小化，以消除不合理的原子接触。在恒定体积下，系统温度在1 ns模拟时间内从100 K逐渐升至310.2 K。系统在常温常压（310.2 K和1 bar）下平衡。最后，对HaGAS1和HaGAS1V436L进行了100 ns的分子动力学模拟，时间步长设为2 fs。
【数据】同源建模：SWISS-MODEL；底物结构：PubChem下载FPP；分子对接：AutoDock Vina；结合口袋预测：proteins.plus平台；分子动力学模拟：Amber22，ff19SB力场，OPC水模型；温度：100 K→310.2 K（1 ns升温）；平衡条件：310.2 K、1 bar；模拟时长：100 ns；时间步长：2 fs
研究结果
3.1 异源大根香叶烯A合酶的筛选与优化表达
为筛选高效的异源大根香叶烯A合酶（GAS），将来源于向日葵（Helianthus annuus L.，HaGAS1）、莴苣（Lactuca sativa，LTC2）和念珠藻（Nostoc sp. PCC 7120，NpGAS）的三种GAS在杂合启动子P_UAS1B8TEF(136)的控制下于解脂耶氏酵母Po1f中异源表达，分别获得工程菌株EME-01、EME-02和EME-03。如图2a所示，携带HaGAS1的菌株EME-01产生了最高的β-榄香烯滴度33.54 ± 1.43 mg/L，菌株EME-02产量为23.19 ± 1.55 mg/L，而菌株EME-03中未检测到β-榄香烯。这是首次报道在解脂耶氏酵母中HaGAS1比广泛使用的LTC2表现出更高的催化效率。此外，尽管NpGAS在大肠杆菌中表现出良好性能，但它在解脂耶氏酵母中未显示任何活性。
为进一步评估控制GAS表达的启动子强度，在菌株EME-01中过表达甲羟戊酸（MVA）途径的关键限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR），以消除前体供应的干扰，获得菌株EME-04。其β-榄香烯滴度达到121.15 ± 12.12 mg/L，相对于菌株EME-01提升了3.61倍。
启动子是调控代谢途径中限速酶表达的有力工具。解脂耶氏酵母中已有大量内源启动子被鉴定。具体而言，启动子强度评估显示所选候选启动子之间存在明确的层级关系，相对强度顺序为P_H3 > P_TMAL > P_TEF > P_GPD > P_FBA。此外，虽然截短的P_ERG9–50已被证明可通过下调角鲨烯生物合成有效提高倍半萜和三萜产量，但P_ERG9本身的强度尚未被测试。因此，选择六个内源启动子P_FBA、P_GPD、P_TEF、P_H3、P_TMAL和P_ERG9来优化HaGAS1的表达。如图2b所示，P_TMAL在驱动HaGAS1表达方面最为有效（菌株EME-13，90.24 ± 2.79 mg/L），与使用已知强启动子P_TEF1的菌株EME-12（86.27 ± 9.17 mg/L）相当。尽管P_H3具有最强的基因表达，菌株EME-11的β-榄香烯滴度仅为51.84 ± 2.12 mg/L，远低于菌株EME-12。此外，使用P_ERG9的菌株EME-10的β-榄香烯产量与使用P_GPD的菌株EME-09相当，表明P_ERG9的强度与强启动子P_GPD相当。这表明在一定的转录强度范围内，较高的转录水平与HaGAS1蛋白表达增加相关；然而，其基因表达的精细调控对于蛋白质正确折叠和酶活性仍然至关重要。
天然启动子固有地受宿主代谢网络调控，这一局限性限制了碳流向目标产物生物合成的高效重定向。P_XPR2启动子的上游激活序列（UAS）已被鉴定并广泛用于杂合启动子工程，其中不同拷贝数的UAS与核心启动子元件（如P_hp4d、P_UAS1B4TEF、P_UAS1B8TEF(136)）融合。为增强启动子效力，通过将4、8或12拷贝的UAS融合至P_TMAL启动子的核心区域，构建了三个杂合启动子（P_UAS1B4TMAL(250)、P_UAS1B8TMAL(250)和P_UAS1B12TMAL(250)），该策略与P_UAS1B8TEF(136)的构建方法类似。当在P_UAS1B4TMAL(250)控制下表达时，菌株EME-UB4产生103.63 ± 5.75 mg/L β-榄香烯，高于携带P_TMAL的菌株所达到的滴度。UAS拷贝数的增加与β-榄香烯滴度的逐渐提高相关，表明UAS元件有效增强了杂合启动子的转录活性。值得注意的是，启动子P_UAS1B8TMAL(250)和P_UAS1B12TMAL(250)表现出相似的性能，相应菌株产生的β-榄香烯滴度均高于携带P_UAS1B8TEF(136)的菌株EME-04（121.15 ± 12.12 mg/L）。综合考虑菌株构建的便利性和长期基因组稳定性，选择P_UAS1B8TMAL(250)用于后续菌株工程。
【数据】三种GAS来源：HaGAS1（向日葵）、LTC2（莴苣）、NpGAS（念珠藻）；EME-01（HaGAS1）：33.54 ± 1.43 mg/L；EME-02（LTC2）：23.19 ± 1.55 mg/L；EME-03（NpGAS）：未检测到；EME-04（过表达HMGR）：121.15 ± 12.12 mg/L，为EME-01的3.61倍；启动子强度顺序：P_H3 > P_TMAL > P_TEF > P_GPD > P_FBA；EME-13（P_TMAL）：90.24 ± 2.79 mg/L；EME-12（P_TEF1）：86.27 ± 9.17 mg/L；EME-11（P_H3）：51.84 ± 2.12 mg/L；EME-UB4（P_UAS1B4TMAL(250)）：103.63 ± 5.75 mg/L；杂合启动子UAS拷贝数：4、8、12
3.2 HaGAS1的理性设计以提高β-榄香烯产量
异源酶固有的低催化效率往往限制微生物细胞工厂中的产物积累。结构引导的蛋白质工程为增强酶活性和改善代谢途径通量提供了有力方法。本研究采用结构驱动策略对HaGAS1进行工程改造，以优化解脂耶氏酵母中的β-榄香烯生产。使用Swiss-Model生成HaGAS1的同源模型，并通过Autodock分子对接模拟构建HaGAS1–FPP复合物（图3a）。鉴于此前已对β-法尼烯合酶和反式橙花叔醇合酶进行了基于序列的突变研究，涵盖活性位点和蛋白表面残基的综合候选突变位点集合可作为指导理性酶工程的可靠框架。通过这两种已知倍半萜合酶与HaGAS1的比较序列分析，根据这些合酶已验证的位点，选择R465、R467、D536、T412、E184、Q167、L101、D433和V436残基进行定点突变（图S2）。基于酶-底物复合物结构，这些残基的空间分布如图3a所示。
在携带HaGAS1突变体的菌株中，变体E184T和V436A将β-榄香烯产量分别提升至147.93 ± 14.01 mg/L和159.19 ± 9.07 mg/L（图3b），其中V436A表现出更优的催化性能。相比之下，变体D536Q几乎不产生β-榄香烯（图3b），表明D536在维持HaGAS1催化活性中发挥重要作用。此外，变体Q167H、T412S、R465Q和R467L的β-榄香烯滴度远低于野生型，仅为对照菌株的17.8–26.9%（图3b）。变体L101W和D433N的活性低于野生型，但其β-榄香烯产量明显优于Q167H、T412S、R465Q和R467L。进一步对D536位点进行饱和突变，所有D536变体均几乎不产生β-榄香烯。结构分析表明，T412、R465、R467和D536靠近活性中心（图3a）。这些位点的突变可能破坏酶-底物相互作用，从而降低结合稳定性并干扰催化活性。截短1–213位残基（命名为t214）导致活性完全丧失（图3b），表明该柔性片段对催化结构域的正确折叠和功能也至关重要。
为进一步提高HaGAS1的催化活性，在E184和V436位点进行了饱和突变。在E184的突变中，仅变体E184T显著提高了β-榄香烯产量，其他取代均未显示明显改善（图3c）。至于V436变体，半数突变体在不同程度上提高了GAS活性，其中V436L变体效果最为显著，将产量提升近2.07倍至250.86 ± 13.08 mg/L（图3d）。为筛选更有效的突变体，基于V436L单突变体进一步构建了双突变体（如V436L-E184T和V436L-E184C）。尽管一些双突变体菌株的β-榄香烯滴度高于野生型（菌株EME-04），但所有组合的产量均低于携带V436L单突变体的菌株（图3e）。
通过比较HaGAS1与LTC2的序列保守性，将这两种GAS蛋白划分为四个结构域（图4a）。鉴于LTC2在解脂耶氏酵母中也表现出良好活性，且V436L突变已证明能有效提升HaGAS1的催化效率，作者推测将HaGAS1中对应V436L突变的结构域与LTC2的结构域进行组合交换，可能产生催化性能更优的嵌合酶。基于此设想，构建了一系列结构域嵌合变体。结果显示，将HaGAS1的H3结构域（含V436L突变）与LTC2的相应区域进行替换获得的嵌合酶L1H2H3-V436LH4表现出最优的催化活性。该嵌合酶结合了HaGAS1的N端结构域（L1、H2）和含V436L突变的H3结构域，以及LTC2的H4结构域（图4b）。携带该嵌合酶的菌株EME-61在摇瓶培养中产生了1347.33 ± 37.92 mg/L的β-榄香烯（图4c），显著高于携带野生型HaGAS1或LTC2的菌株。
为进一步提升产量，作者尝试将ERG20（法尼基焦磷酸合酶）与L1H2H3-V436LH4进行融合表达，以增强FPP前体向GAS的通道化。通过筛选不同长度的连接肽（linker），发现使用特定连接肽融合ERG20和L1H2H3-V436LH4可显著提高β-榄香烯产量（图5a）。在此基础上，增加L1H2H3-V436LH4-ERG20融合基因的拷贝数进一步提升了β-榄香烯产量（图5b），表明前体供应与末端合酶的有效偶联对提高产物积累至关重要。
【数据】V436A：159.19 ± 9.07 mg/L；E184T：147.93 ± 14.01 mg/L；D536Q：几乎不产生；Q167H、T412S、R465Q、R467L：为对照的17.8–26.9%；t214截短：完全丧失活性；V436L：250.86 ± 13.08 mg/L（为野生型的2.07倍）；双突变体V436L-E184T和V436L-E184C：产量低于V436L单突变体；嵌合酶L1H2H3-V436LH4（菌株EME-61）：1347.33 ± 37.92 mg/L
3.3 下游MVA途径强化与脂代谢工程调控
为满足β-榄香烯合成对前体FPP的大量需求，作者对MVA途径进行了系统强化。首先，将MVA途径的关键酶（包括ERG10、ERG13、HMG1、ERG12、ERG8、ERG19等）靶向定位至过氧化物酶体，利用过氧化物酶体的区室化效应提高局部酶浓度和代谢通量（图6a）。同时，对脂质代谢途径进行工程调控，包括增强β-氧化和脂质分解代谢，以将碳流从脂质积累重新导向萜类生物合成。具体而言，过表达TGL4基因（编码三酰甘油脂肪酶）以增强脂质分解，释放的脂肪酸经β-氧化途径产生乙酰辅酶A，为MVA途径提供更多前体。
通过上述策略的组合优化，最终获得的工程菌株EME-82在摇瓶培养中β-榄香烯滴度达到3584.18 ± 87.30 mg/L，相对于初始菌株EME-01（33.54 ± 1.43 mg/L）提升了106.86倍。这一结果表明，过氧化物酶体区室化MVA途径与脂代谢重编程的协同作用，能够有效驱动碳流朝向目标萜类产物的高效合成。
【数据】菌株EME-82摇瓶产量：3584.18 ± 87.30 mg/L；初始菌株EME-01：33.54 ± 1.43 mg/L；提升倍数：106.86倍；TGL4基因：过表达以增强脂质分解
3.4 5-L生物反应器补料分批发酵
为评估工程菌株EME-82的工业化应用潜力，在5-L生物反应器中进行了补料分批发酵（图7）。发酵过程中，以50%甘油为补料碳源，维持培养基中甘油浓度低于1 g/L。发酵持续240 h，最终β-榄香烯滴度达到52.53 g/L，为目前报道的β-榄香烯最高产量。所有数据均为三次重复的平均值±标准差。
【数据】发酵规模：5-L生物反应器；补料碳源：50%甘油，维持低于1 g/L；发酵时间：240 h；最终产量：52.53 g/L β-榄香烯；重复次数：三次
讨论与解读
本研究通过模块化工程策略在解脂耶氏酵母中实现了β-榄香烯的高水平合成。核心创新点包括：发现内源启动子P_TMAL优于经典强启动子P_TEF1，并通过UAS融合构建杂合启动子P_UAS1B8TMAL(250)进一步提升表达效率；基于结构-guided蛋白工程，鉴定出H3结构域和V436残基为HaGAS1催化活性的关键决定因素，并通过结构域 shuffling 构建了嵌合酶L1H2H3-V436LH4；将MVA途径靶向过氧化物酶体并结合脂代谢调控，实现了碳流的有效重定向。最终在5-L生物反应器中获得52.53 g/L的β-榄香烯，为目前最高报道水平。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"多策略集成"的典型范式——从启动子工程到蛋白理性设计，再到亚细胞区室化和代谢网络重编程，每一步都基于明确的分子机制假设而非盲目筛选。尤其值得关注的是，过氧化物酶体区室化策略巧妙利用了真核细胞的天然细胞器结构，在提高局部酶浓度的同时减少了中间代谢物的扩散损失。嵌合酶设计思路——基于序列保守性划分结构域并进行跨物种组合——为其他倍半萜合酶的改造提供了可推广的方法论。然而，52.53 g/L的产量虽高，发酵周期达240 h，时空产率仍有优化空间；此外，十二烷原位萃取的工业放大可行性和产品回收成本也是产业化需要考虑的问题。
参考来源
Liu, S.-C. Sustainable high-titer production of β-elemene in Yarrowia lipolytica via modular engineering, pathway refactoring, and a chimeric germacrene A synthase. Chemical Engineering Journal, 2026. DOI: 10.1016/j.cej.2025.172276
DOI: 10.1016/j.cej.2025.172276