来源：Synthesis and characterization of glucose oxidase bimetallic hybrid magnetic nanoflowers for a sensitive glucose biosensor and an effective antibacterial agent（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
糖尿病及其并发症的防控高度依赖血糖的精准监测，而传统葡萄糖氧化酶（GOx）传感器面临酶稳定性差、回收困难等瓶颈。本研究通过将GOx固定于Cu²⁺/Zn²⁺双金属磷酸盐杂化磁性纳米花（GOx-mcNFs）中，并以戊二醛交联增强结构稳定性，成功构建了兼具优异类过氧化物酶活性、高封装率（93.5%）与显著抗菌性能的双功能平台。该系统在血糖比色检测中展现出0.7 µM的低检测限，并对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别实现99.6%和98.8%的灭活率。
研究背景
葡萄糖是人体最重要的能量来源，其稳态必须持续维持，否则可能引发与I型、II型糖尿病相关的代谢紊乱。血糖水平作为糖尿病诊断、治疗乃至预防的关键生物标志物，其规律且精准的监测对防止慢性病并发症至关重要。目前已有电化学、比色法、表面增强拉曼散射、荧光和化学发光等多种方法用于检测体液中的葡萄糖。其中，比色法因操作简便、稳定性高、灵敏度好、成本低且响应快速而被广泛采用，其反应引起的颜色变化甚至可用肉眼直接判读，适合即时检测场景。
葡萄糖氧化酶（GOx，EC 1.1.3.4）是大多数比色葡萄糖生物传感器的生物识别元件，可催化葡萄糖氧化产生葡萄糖酸和H₂O₂，在食品、纺织、能源、医药及抗菌等领域均有应用。然而，游离GOx在极端pH、高温条件下稳定性差，且难以回收复用。酶固定化技术是提升酶稳定性与可重复使用性的有效手段，其中有机-无机杂化纳米花因其制备条件温和、比表面积大、酶负载量高而备受关注。本研究在双金属（Cu²⁺、Zn²⁺）磷酸盐纳米花体系中引入磁性Fe₃O₄纳米颗粒，并以戊二醛交联强化结构，旨在开发一种兼具高灵敏葡萄糖传感和有效抗菌性能的 bifunctional 纳米平台。
研究方法
2.1 试剂与仪器分析
七水合硫酸亚铁（FeSO₄·7H₂O）、六水合三氯化铁（FeCl₃·6H₂O）、牛血清白蛋白（BSA）、NaCl、KCl、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、乙酸钠（NaAc）、乙酸（HAc）、磷酸二氢钾（KH₂PO₄）、戊二醛（GA）、3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）、β-D-葡萄糖、35%过氧化氢、营养肉汤和营养琼脂均购自Merck公司。来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶（GOx）、五水合硫酸铜（CuSO₄·5H₂O）和硫酸锌（ZnSO₄）购自Sigma-Aldrich（美国圣路易斯）。整个实验过程中使用去离子水和分析级试剂配制溶液。能量色散X射线光谱（EDX）和场发射扫描电子显微镜（FESEM）图像通过MIRA3 FESEM（TESCAN，捷克）获得。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）在Tensor 27 FT-IR光谱仪（Bruker，德国）上完成。使用Carry 50紫外-可见分光光度计（Varian，澳大利亚）获取吸收数据。
【数据】试剂来源：Merck、Sigma-Aldrich；仪器：MIRA3 FESEM、Tensor 27 FT-IR、Carry 50 UV-vis
2.2 磁性Fe₃O₄纳米颗粒的合成
Fe₃O₄纳米颗粒（NPs）参照先前报道的方法并稍作修改制备[46,47]。首先，将0.72 g FeSO₄·7H₂O加入30 mL含有1.43 g FeCl₃·6H₂O的去离子水中。随后，在室温下向溶液中逐滴加入氢氧化铵（NH₄OH），获得棕色沉淀。通过简单离心并用去离子水洗涤至pH 7.0，以去除残余离子。在100 °C下干燥2小时后，得到Fe₃O₄ NP粉末。
【数据】FeSO₄·7H₂O用量：0.72 g；FeCl₃·6H₂O用量：1.43 g；去离子水体积：30 mL；干燥温度：100°C；干燥时间：2h；最终pH：7.0
2.3 纳米花的制备
GOx-cNFs和GOx-mcNFs的制备： 纳米花的合成程序参照先前方法并稍作修改[36,42]。首先制备Cu₃/Zn₃(PO₄)₂-葡萄糖氧化酶杂化纳米花。简言之，将200 μL CuSO₄水溶液（200 mM）和50 μL ZnSO₄水溶液（200 mM）与30 mL含有不同浓度葡萄糖氧化酶（0.02–0.31 mg mL⁻¹）的0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）混合，随后在4 °C下孵育72小时[36]。纳米花完全形成后，将其置于戊二醛中以改善稳定性和可重复使用性。因此，通过将制备的混合物与1 mL 0.1 M戊二醛溶液（终浓度3 mM）在4 °C下再孵育4小时，获得戊二醛处理的GOx纳米花（GOx-cNFs）[26,48–50]。最后，制备双金属磁性交联葡萄糖氧化酶纳米花（GOx-mcNFs）。为此，将合成的Fe₃O₄纳米颗粒（0.1 mg mL⁻¹）和不同浓度的葡萄糖氧化酶（0.02–0.31 mg mL⁻¹）加入30 mL PBS溶液（0.01 M，pH 7.4）中混合2小时。然后向混合物中加入200 μL CuSO₄水溶液（200 mM）和50 μL ZnSO₄水溶液（200 mM），随后在4 °C下孵育72小时[32]。之后，按上述方法进行戊二醛处理。将产生的GOx-cNFs和GOx-mcNFs离心（5000 g，10分钟），并用PBS额外洗涤。最后，收集的沉淀在25 °C下干燥。双金属磁性葡萄糖氧化酶纳米花（GOx-mNF）以相同方式合成，但不使用磁性纳米颗粒。
为设置对照及获得结构相似的类过氧化物酶纳米酶以研究游离酶活性[32,51]，使用相同方法制备了双金属交联BSA纳米花（BSA-cNFs）和双金属磁性交联BSA纳米花（BSA-mcNFs），仅将GOx替换为BSA。还考察了CuSO₄和ZnSO₄浓度（120、200 mM）、反应温度（4、25 °C）和孵育时间（24、72 h）对BSA-mcNFs和GOx-mcNFs合成的影响[52,53]。
使用Bradford法测定上清液中GOx或BSA的浓度[54]。以BSA作为标准蛋白。将不同浓度的BSA（0.0–100 μg mL⁻¹）与Bradford试剂孵育，在595 nm处监测吸光度值以获得BSA标准曲线（图S1）。然后，将50 μL GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的上清液分别与450 μL Bradford试剂孵育5分钟，随后记录595 nm处的吸光度。根据BSA标准曲线（方程Y = 0.0079X + 0.0172，R² = 0.9976）计算上清液中的蛋白质浓度。该方法也用于计算蛋白质的初始量。封装率（EY）和活性回收率（AR）分别针对类过氧化物酶活性和葡萄糖氧化酶活性按以下公式评估[18]：
（1）EY（%）=（初始GOx或BSA浓度 – 上清液中GOx或BSA浓度）/ 初始GOx或BSA浓度 × 100
（2）类过氧化物酶AR（%）= GOx-mcNFs的总过氧化物酶活性 / BSA-mcNFs的总过氧化物酶活性 × 100
（3）葡萄糖氧化酶AR（%）= GOx-mcNFs的总活性 / 游离GOx的初始活性 × 100
【数据】CuSO₄浓度：200 mM，体积：200 μL；ZnSO₄浓度：200 mM，体积：50 μL；PBS：0.01 M，pH 7.4，30 mL；GOx浓度范围：0.02–0.31 mg mL⁻¹；孵育：4°C，72h；戊二醛：0.1 M，1 mL（终浓度3 mM），4°C，4h；Fe₃O₄：0.1 mg mL⁻¹；离心：5000 g，10 min；干燥：25°C；Bradford方程：Y=0.0079X+0.0172（R²=0.9976）
2.4 纳米花类过氧化物酶性质研究
通过观察TMB在H₂O₂辅助下的催化氧化过程，考察GOx-cNFs、GOx-mcNFs、BSA-cNFs和BSA-mcNFs的类过氧化物酶模拟活性。在典型的400 μL反应体系中，将20 μL各纳米花（50 μg mL⁻¹）添加到340 μL含有0.52 mM TMB（20 μL）和2.3 mM H₂O₂（20 μL）的50 mM NaAc-HAc缓冲液（pH 4.0）中。在50 °C孵育15分钟后，离心混合物（5000 g，5分钟）以去除纳米花。随后使用紫外-可见分光光度计记录652 nm处的吸收光谱。按照相同程序，还在不同pH值（pH 3.0–6.0范围的50 mM乙酸钠缓冲液和pH 6.0–7.5范围的50 mM磷酸钠缓冲液）、温度（20–80 °C）和mcNFs浓度（0.0–125 μg mL⁻¹）下评估类过氧化物酶活性[14,21]。
采用稳态动力学参数评估GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的类过氧化物酶活性。使用不同浓度的H₂O₂（0.0–2.87 mM）和TMB（0.0–0.65 mM）进行测定。鉴于氧化态TMB的摩尔消光系数为3.9 × 10⁴ M⁻¹ cm⁻¹，使用Lineweaver-Burk图估算表观动力学参数K_m和V_max，公式如下[55]：
（4）1/V = K_m/V_max（1/[S] + 1/K_m）
其中V对应初始速度，S为底物浓度，V_max和K_m分别为最大反应速度和米氏常数。
【数据】反应体系：400 μL；纳米花浓度：50 μg mL⁻¹（20 μL）；TMB：0.52 mM（20 μL）；H₂O₂：2.3 mM（20 μL）；缓冲液：50 mM NaAc-HAc，pH 4.0；孵育：50°C，15 min；离心：5000 g，5 min；检测波长：652 nm；pH范围：3.0–7.5；温度范围：20–80°C；mcNFs浓度：0.0–125 μg mL⁻¹；H₂O₂浓度范围：0.0–2.87 mM；TMB浓度范围：0.0–0.65 mM；ε(oxTMB)=3.9×10⁴ M⁻¹cm⁻¹
2.5 GOx-mcNFs比色检测葡萄糖
一步法葡萄糖测定：将100 μL不同浓度的葡萄糖溶液（0.0–5.0 mM）添加到260 μL含有0.52 mM TMB（20 μL）和20 μL GOx-mcNFs（75 μg mL⁻¹）的50 mM HAc-NaAc缓冲液（pH 4.0）中。在40 °C孵育25分钟后，最终在652 nm处获得对应oxTMB的吸收光谱。此外，还在不同纳米花浓度（0.0–100 μg mL⁻¹）、不同pH值（pH 3.5–6.0范围的乙酸钠缓冲液和pH 6.0–7.5范围的磷酸钠缓冲液）、不同温度（20–80 °C）以及不同浓度的乙酸钠缓冲液（pH 4.0，25–100 mM）下评估GOx-mcNFs的葡萄糖传感性能。为考察生物传感器选择性，在相同浓度（5 mM）的不同干扰组分（抗坏血酸、半胱氨酸、半乳糖、谷氨酸、果糖、尿素等）存在下进行酶学评估[21]。
【数据】葡萄糖浓度范围：0.0–5.0 mM（100 μL）；TMB：0.52 mM（20 μL）；GOx-mcNFs：75 μg mL⁻¹（20 μL）；缓冲液：50 mM HAc-NaAc，pH 4.0，260 μL；孵育：40°C，25 min；检测波长：652 nm；纳米花浓度范围：0.0–100 μg mL⁻¹；pH范围：3.5–7.5；温度范围：20–80°C；缓冲液浓度范围：25–100 mM；干扰物浓度：5 mM
2.6 GOx-mcNFs稳定性与可重复使用性研究
通过将GOx-mcNFs和游离GOx置于一系列温度（20–80 °C）下保持，评估其热稳定性。
【数据】温度范围：20–80°C（原文节选至此，后续具体参数原文未详述）
研究结果
3.1 纳米花的合成
多种变量影响酶纳米花的形成，进而影响封装率和活性回收率[25]。因此，在固定蛋白质浓度（0.16 mg mL⁻¹）的条件下，评估了BSA-mcNFs和GOx-mcNFs在不同Cu²⁺和Zn²⁺浓度（120和200 mM）、温度（4、25 °C）和孵育时间（24、72 h）下的合成情况（如表1所述）。选择最高封装率、最高葡萄糖氧化酶活性回收率以及BSA-mcNF和GOx-mcNF之间类过氧化物酶活性差异最小作为筛选最有利合成纳米结构条件的标准。表1显示，在200 mM金属离子、4 °C孵育72小时的条件下，BSA-mcNF（75%）和GOx-mcNF（83.9%）获得最佳EY，葡萄糖氧化酶AR最高（236.5%）。此外，在这些条件下观察到BSA-mcNF和GOx-mcNF之间的类过氧化物酶活性差异最小（116.3%）。
此外，还在不同PBS浓度（1.0–40.0 mM）和不同蛋白质溶液浓度（0.02–0.31 mg mL⁻¹）下制备了BSA-mcNFs和GOx-mcNFs（表S1、S2）。表S1结果显示，在10 mM PBS下获得BSA-mcNF（79.8%）和GOx-mcNF（85.1%）的最大EY值。PBS浓度更高时EY下降，可能是由于过量金属磷酸盐覆盖花瓣，最终阻止了纳米花的形成[27]。此外，在10 mM PBS下葡萄糖氧化酶AR最高（452%），类过氧化物酶AR最低（109.8%）。如表S2所述，对不同蛋白质浓度的考察结果显示，在0.08 mg mL⁻¹时BSA-mcNF（87.1%）和GOx-mcNF（93.5%）的EY值最高，葡萄糖氧化酶AR为650.3%。在此条件下，类过氧化物酶AR为101.9%。在浓缩蛋白质溶液中观察到的EY下降与先前报道一致[14]，这可能是由于过量蛋白质存在时金属磷酸盐达到饱和。此外，较高酶浓度下活性较低可能归因于酶活性位点的封闭[65]。
相比之下，Cheon等人报道了使用120 mM硫酸铜溶液、0.1 mg mL⁻¹ GOx、100 mM磷酸钠缓冲液，在25 °C下孵育72小时制备MNP-GOx NFs。他们报道MNP-GOx NFs的葡萄糖传感活性比游离GOx高约四倍[32]。Guo等人使用FeSO₄（0.0188 M）水溶液、磷酸钠缓冲液（0.0125 M）和0.25 mg mL⁻¹ GOx合成GOx–Fe₃(PO₄)₂·8H₂O，在室温下孵育三天。GOx–Fe₃(PO₄)₂·8H₂O的活性比游离GOx高400%以上，EY为73.03%[14]。此外，Batule等人使用CuSO₄溶液（120 mM）、PBS（pH 7.4）和0.02 mg mL⁻¹的GOx，通过声化学法在五分钟内合成了SGOx-NFs，EY为78%，活性比游离GOx高3倍[51]。
与先前报道相比，我们的结果显示在相对较低的初始蛋白质浓度下获得了更高的EY，且双金属GOx-mcNF比游离酶表现出更高的葡萄糖传感性能。根据表1、S1和S2，GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的类过氧化物酶活性最初存在显著差异。然后通过优化合成条件，该差异逐渐减小。这种优化对于在类过氧化物酶模拟活性方面比较GOx-mcNFs和BSA-mcNFs是必要的。结果证明GOx-mcNFs和BSA-mcNFs提供几乎相似的类过氧化物酶活性。在这种情况下，可以在后续评估中在相同过氧化条件下更准确地比较固定化和游离GOx的葡萄糖传感活性。
【数据】最佳EY（BSA-mcNF）：75%；最佳EY（GOx-mcNF）：83.9%；最高GOx AR：236.5%（200 mM金属离子，4°C，72h）；最佳PBS浓度：10 mM（EY：BSA-mcNF 79.8%，GOx-mcNF 85.1%；GOx AR：452%；过氧化物酶AR：109.8%）；最佳蛋白浓度：0.08 mg mL⁻¹（EY：BSA-mcNF 87.1%，GOx-mcNF 93.5%；GOx AR：650.3%；过氧化物酶AR：101.9%）
3.2 GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的表征
使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）对GOx-mcNFs和BSA-mcNFs进行形貌分析。根据图2a、b（FESEM图像），金属磷酸盐和蛋白质的自组装使杂化纳米结构形成类似花朵的分级球形形貌。BSA-mcNFs也观察到相同结果（图S2）。FESEM图像揭示了GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的多孔结构，这是有助于底物和产物扩散并提高催化活性的因素[36]。所得纳米花的直径约为4 μm，花瓣状纳米结构在28.21–68.47 nm范围内。
Yuan等人报道了合成直径为15 μm的球形GOx&DhHP-6-Cu₃(PO₄)₂纳米花[34]。Sun等人的另一篇报道中，GOx&HRP–Cu₃(PO₄)₂·3H₂O NFs的近似直径为30 μm[66]。本研究中GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的尺寸小于类似纳米花。通常，纳米花的尺寸和形状取决于反应条件以及金属离子和酶的类型与浓度[67]。与铜基纳米花相比，双金属GOx-mcNFs和BSA-mcNFs尺寸更小，可能是由于Cu²⁺和Zn²⁺的协同效应——据报道铜基纳米花具有柔软结构，而锌基纳米花提供更紧凑的结构[35]。此外，增加金属离子浓度（200 mM）是另一个原因，有助于花瓣增厚并形成更致密的纳米花，为酶分子中的酰胺或胺基提供有效的配位位点[35,67]。
另外，通过FESEM测定了Fe₃O₄ NPs的尺寸（图S3）。Fe₃O₄ NPs几乎呈球形，粒径在32.90–39.90 nm范围内。MNPs的粒径与其他研究几乎相似。我们先前关于Km12脂肪酶磁性交联酶聚集体的研究表明Fe₃O₄纳米颗粒的粒径范围为31.0–52.3 nm[47]。Reza等人报道Fe₃O₄纳米颗粒的平均尺寸为27 nm ± 8 nm[46]。基于先前研究，带正电荷的MNPs可能与纳米花中带负电荷的酶建立静电相互作用，或物理吸附到纳米花的多孔结构中[40]。
此外，通过FT-IR光谱证实了GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的形成（分别为图2c和图S4a）。GOx-mcNFs在991–1048 cm⁻¹处（图2c）和BSA-mcNFs在992–1050 cm⁻¹处（图S4a）的峰可归因于P-O伸缩振动，表明GOx-mcNFs和BSA-mcNFs中均存在磷酸基团[14,43]。两种杂化结构均在1638 cm⁻¹和1466 cm⁻¹处观察到明显谱带，表明存在肽键[43]。在561–623 cm⁻¹处表征的峰与Fe₃O₄ NPs中的Fe-O键（伸缩振动）相关，表明磁性纳米颗粒存在于GOx-mcNFs和BSA-mcNFs杂化结构中[47]。GOx-mcNFs在1638 cm⁻¹处和BSA-mcNFs在1651 cm⁻¹处的峰代表C=N伸缩振动（希夫碱），表明戊二醛已掺入纳米结构中[26,68]。在两种杂化结构中，2920和2922 cm⁻¹处的明显峰是-CH₂基团中C-H键（伸缩振动）的指示[40]，3448 cm⁻¹处的峰与-NH和-OH伸缩相关[33]。
如图2d和图S4b所示，分别使用能量色散X射线光谱（EDX）测定了GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的元素组成。这些光谱证实了Cu、Zn、P、N、O、C和Fe的存在，与金属磷酸盐、GOx、BSA和磁性纳米颗粒相对应。
【数据】纳米花直径：约4 μm；花瓣尺寸：28.21–68.47 nm；Fe₃O₄粒径：32.90–39.90 nm；FT-IR特征峰：991–1048 cm⁻¹（P-O）、1638 cm⁻¹（肽键/C=N）、561–623 cm⁻¹（Fe-O）、2920 cm⁻¹（C-H）、3448 cm⁻¹（-NH/-OH）；EDX元素：Cu、Zn、P、N、O、C、Fe
3.3 GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的类过氧化物酶性能
首先验证了GOx-mcNFs和BSA-mcNFs的类过氧化物酶模拟活性。
【数据】原文节选至此，具体数值原文未详述。
【数据】原文节选至此，具体数值原文未详述。
【数据】原文节选至此，具体数值原文未详述。
【数据】原文节选至此，具体数值原文未详述。
【数据】原文节选至此，具体数值原文未详述。
【数据】原文节选至此，具体数值原文未详述。
讨论与解读
本研究成功开发了一种双金属（Cu²⁺、Zn²⁺）磁性葡萄糖氧化酶-无机杂化纳米花（GOx-mcNFs），并采用戊二醛作为交联剂。除固定化酶外，含MNPs的Cu²⁺/Zn²⁺-磷酸盐还可作为具有优异类过氧化物酶性质的纳米酶。GOx-mcNFs与游离GOx相比展现出相当的催化活性、稳定性和可回收性，同时因戊二醛和双金属离子的稳定效应而具有高酶负载效率。这为人体血清样本中葡萄糖检测提供了一个简单、选择性的比色平台，具有相对较低的检测限和宽线性范围。除构建葡萄糖生物传感器外，GOx-mcNFs还通过ROS产生机制发挥杀菌作用。在此系统中，相对低浓度的双金属基GOx-mcNFs从无害葡萄糖中持续产生H₂O₂，可有效发挥体外抗菌性能。因此，双功能GOx-mcNFs有望在临床诊断和抗菌应用中成为一种有前景的策略。
编译者解读
从合成生物学应用视角看，本研究的核心价值在于"一石三鸟"的设计智慧——磁性纳米颗粒赋予回收能力，双金属磷酸盐提供类过氧化物酶活性，戊二醛交联则显著提升结构稳定性。93.5%的封装率和650.3%的活性回收率说明该固定化策略在保持酶活性方面相当成功。尤其值得一提的是，通过优化合成条件使GOx-mcNFs与BSA-mcNFs的类过氧化物酶活性趋于一致，从而可在同一过氧化条件下公平比较固定化与游离GOx的催化性能——这种严谨的实验设计值得借鉴。不过，纳米花制备耗时较长（72小时以上），且抗菌实验所需剂量（750 μg mL⁻¹对E. coli）相对较高，未来若能缩短制备周期并降低有效剂量，将更利于实际临床转化。
参考来源
Iranmanesh S. Synthesis and characterization of glucose oxidase bimetallic hybrid magnetic nanoflowers for a sensitive glucose biosensor and an effective antibacterial agent. Biochemical Engineering Journal, 2025. DOI: 10.1016/j.bej.2024.109583
DOI: 10.1016/j.bej.2024.109583