来源：Engineering a biosensor based high-throughput screening platform for high-yield caffeic acid production in Escherichia coli（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
咖啡酸（CA）是一种具有广泛应用价值的酚类化合物，但微生物合成面临异源酶活性低和产物毒性两大瓶颈。本研究鉴定并工程化了来自伍氏醋酸杆菌的新型酚酸响应转录因子CarR，构建了对对香豆酸（p-CA）响应的基因编码生物传感器。通过将该传感器与荧光激活细胞分选（FACS）偶联，建立了高效的高通量筛选（HTS）平台，成功获得催化活性提高6.85倍的FjTALG85S突变体和耐受性增强的p-CA高产菌株M5。最终工程菌株CA8在5-L生物反应器中达到9.61 g L⁻¹的咖啡酸产量，为迄今报道的最高水平。
研究背景
微生物细胞工厂合成天然产物已取得显著进展，但仅依赖推-拉-阻断等传统代谢工程策略仍面临诸多局限。这些瓶颈源于对细胞代谢网络复杂性以及酶结构与功能关系的认知不足，导致许多工程途径性能不佳，表现为低生产率、不理想的滴度或低得率。非理性工程策略如实验室适应性进化、随机诱变和定向进化虽可规避认知局限，但突变文库容量极大，缺乏高效筛选工具时难以获得目标突变体。因此，开发灵敏、快速的高通量筛选技术对于探索更大的突变文库至关重要。
研究方法
2.1 菌株与试剂
本研究所用菌株列于表S1。大肠杆菌DH5α用于质粒构建与保存，大肠杆菌BL21(DE3)用于蛋白表达，大肠杆菌W3110作为生产p-CA的宿主菌。p-CA、肉桂酸、咖啡酸、阿魏酸、左旋多巴（DOPA）、酪氨酸、4-羟基苯丙酮酸和苯丙氨酸等化学品购自麦克林（中国上海）。用于生物传感器测试的化学品溶于DMSO（除非另有说明），配制为以下储存浓度：1 M p-CA、1 M CA、1 M肉桂酸、1 M 4-羟基苯丙酮酸、50 mM苯丙氨酸（溶于水）、1 mM酪氨酸（直接溶于培养基）、1 mM DOPA（直接溶于培养基）。测试时各化学品的工作浓度统一设定为1 mM，以确保条件一致性和可比性。按需加入适量储存液，并补充DMSO或水以保持所有反应体系最终体积一致。
【数据】菌株：E. coli DH5α、BL21(DE3)、W3110；储存浓度：1 M p-CA、1 M CA、1 M肉桂酸、1 M 4-羟基苯丙酮酸、50 mM苯丙氨酸、1 mM酪氨酸、1 mM DOPA；工作浓度：1 mM
2.2 培养基与培养条件
LB培养基用于大肠杆菌质粒提取、蛋白表达、外源添加p-CA响应测试和种子活化。M9Y培养基（1 g L⁻¹酵母提取物、17.1 g L⁻¹ Na₂HPO₄·12H₂O、3 g L⁻¹ KH₂PO₄、0.5 g L⁻¹ NaCl、1 g L⁻¹ NH₄Cl、0.241 g L⁻¹ MgSO₄、0.011 g L⁻¹ CaCl₂和20 g L⁻¹葡萄糖）用于p-CA响应测试。HTS和摇瓶发酵实验使用FM2培养基：20 g L⁻¹葡萄糖、5 g L⁻¹酵母提取物、1 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、4 g L⁻¹ K₂HPO₄、1 g L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、30 mg L⁻¹ FeSO₄·7H₂O、30 mg L⁻¹ MnSO₄·H₂O、1 g L⁻¹柠檬酸钠、1 mL L⁻¹维生素溶液、1 mL L⁻¹微量元素溶液（6.2 mM Na₂MoO₄·2H₂O、3.2 mM NiCl₂·6H₂O、34 mM CaCl₂·2H₂O、0.8 mM CuSO₄·5H₂O、1.7 mM Al₂(SO₄)₃·18H₂O、7 mM CoCl₂·6H₂O、0.9 mM ZnSO₄·7H₂O、1.2 mM H₃BO₃）。必要时向培养基中添加100 mg L⁻¹盐酸奇霉素、100 mg L⁻¹氨苄青霉素、50 mg L⁻¹卡那霉素或30 mg L⁻¹氯霉素。
【数据】M9Y培养基：1 g L⁻¹酵母提取物、17.1 g L⁻¹ Na₂HPO₄·12H₂O、3 g L⁻¹ KH₂PO₄、0.5 g L⁻¹ NaCl、1 g L⁻¹ NH₄Cl、0.241 g L⁻¹ MgSO₄、0.011 g L⁻¹ CaCl₂、20 g L⁻¹葡萄糖；FM2培养基：20 g L⁻¹葡萄糖、5 g L⁻¹酵母提取物、1 g L⁻¹ (NH₄)₂SO₄、4 g L⁻¹ K₂HPO₄、1 g L⁻¹ MgSO₄·7H₂O、30 mg L⁻¹ FeSO₄·7H₂O、30 mg L⁻¹ MnSO₄·H₂O、1 g L⁻¹柠檬酸钠；抗生素：100 mg L⁻¹奇霉素、100 mg L⁻¹氨苄青霉素、50 mg L⁻¹卡那霉素、30 mg L⁻¹氯霉素
2.3 菌株与质粒构建
所用质粒、引物和遗传元件序列分别列于表S2、表S3和表S4。pET28a质粒用于蛋白表达，pTrc99a质粒用于生物传感器构建，pACYC-Dut1质粒用于FjTAL表达。所有过表达的内源基因均从大肠杆菌W3110基因组DNA扩增获得，来自伍氏醋酸杆菌的CarR（Awo_c15690，登录号：H6LGM3）和来自约氏黄杆菌的FjTAL（登录号：WP_012023194.1）经大肠杆菌密码子优化后由擎科生物技术公司（中国天津）合成。基因模块的敲入和敲除使用CRISPR-Cas9系统，操作如前人所述（Wu et al., 2018）。pTrc99a、pET28a和pACYCDuet-1质粒作为基因表达载体，按标准分子克隆流程构建。例如，在pRrG构建中，通过反向PCR扩增获得pTrc99a线性载体。P_carR_-P_car和P_carR_由引物组装。增强型绿色荧光蛋白（eGFP）基因以pCL-P_esaS_-eGFP（Gu et al., 2020）为模板扩增。CarR相关基因片段从pUC57-carR扩增。将DNA产物carR、P_carR_-P_car、egfp通过Gibson组装方法克隆到线性化pTrc99a中，获得质粒pRrG。
【数据】质粒：pET28a、pTrc99a、pACYC-Dut1；CarR登录号：H6LGM3；FjTAL登录号：WP_012023194.1；组装方法：Gibson assembly
2.4 培养条件
所有摇瓶发酵实验均设三次生物学重复以确保实验可靠性。具体流程如下：首先，将保存的工程菌株接种到含5 mL LB培养基的试管中，37°C、220 rpm振荡过夜培养。然后，取1 mL培养物转接至含30 mL LB培养基的250 mL摇瓶中，继续培养8–10 h制备种子液。最后，将3 mL种子液接种至含26 mL FM2发酵培养基的250 mL摇瓶中，补充1 mL 600 g L⁻¹葡萄糖溶液，37°C、220 rpm振荡培养24 h。发酵体系pH通过添加12 g L⁻¹ CaCO₃维持稳定。
补料分批发酵：首先将单菌落接种到含10 mL LB培养基的试管中，37°C、220 rpm培养12 h。然后将培养物转接至含200 mL LB培养基的500 mL摇瓶中，相同条件下培养6 h。当OD₆₀₀达到2时，将培养物接种至含2 L新鲜FM2培养基（补充1 g L⁻¹甜菜碱）的5-L生物反应器（T&J Bio-engineering，中国上海）中。发酵过程中温度维持在37°C，pH通过自动添加NH₃·H₂O控制在6.8 ± 0.1，溶解氧（DO）通过调节搅拌速度（200–800 rpm）维持在15%饱和度。初始添加20 g L⁻¹葡萄糖。初始葡萄糖完全消耗后，自动补入灭菌的800 g L⁻¹葡萄糖溶液，维持残余葡萄糖浓度低于2 g L⁻¹。每4 h取样测定细胞密度、残余葡萄糖和产物浓度。
【数据】摇瓶发酵：37°C、220 rpm、24 h、12 g L⁻¹ CaCO₃；补料分批发酵：5-L反应器、37°C、pH 6.8 ± 0.1、DO 15%、200–800 rpm、初始葡萄糖20 g L⁻¹、补糖800 g L⁻¹、残余葡萄糖<2 g L⁻¹、取样间隔4 h
2.5 蛋白表达与纯化
挑取新鲜菌落接种至含5 mL LB培养基的试管中，37°C过夜培养。将1 mL培养物转接至含1 L LB培养基的摇瓶中，37°C振荡培养至OD₆₀₀达到0.6。加入0.5 mM IPTG诱导蛋白表达，18°C继续培养16 h。随后4°C、8000 rpm离心10 min收集细胞。纯化野生型（WT）FjTAL、突变体G85S和CarR时，将细胞以0.05 g湿重每mL的浓度重悬于裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10 mM咪唑；pH 8.0）中。超声破碎细胞。使用HisTrap HP柱（1 mL）在ÄKTA pure系统（Cytiva，中国上海）上纯化目标蛋白。用含10 mM咪唑的裂解缓冲液洗涤去除杂质后，以10–300 mM咪唑线性梯度洗脱目标蛋白（洗脱缓冲液：50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、300 mM咪唑；pH 8.0）。收集主洗脱峰，SDS-PAGE分析后进行后续表征。蛋白样品按照制造商说明使用PD-10脱盐柱脱盐至50 mM Tris-HCl中。
【数据】诱导：0.5 mM IPTG、18°C、16 h；离心：8000 rpm、10 min、4°C；裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10 mM咪唑、pH 8.0；细胞浓度：0.05 g湿重/mL；洗脱梯度：10–300 mM咪唑
2.6 凝胶迁移率变动分析（EMSA）
使用CarR蛋白和操纵子双链DNA P_carR_-P_car在存在或不存在p-CA的条件下进行EMSA，以监测CarR与P_carR_-P_car的相互作用。用于EMSA的364-bp P_carR_-P_car-cy5标记探针以质粒pRrG为模板通过PCR制备，Cy5标记引物对cy5由擎科生物技术公司（中国天津）合成。相互作用测定中，将50 ng双链DNA P_carR_-P_car-cy5标记探针和不同量的CarR（0–1 μM）加入结合缓冲液。p-CA诱导测定中，将1 μM CarR蛋白和50 ng双链DNA P_carR_-P_car-cy5标记探针的混合物与0–1 mM p-CA共孵育。CA诱导测定中，将1 μM CarR蛋白和50 ng双链DNA P_carR_-P_car-cy5标记探针的混合物与0–1.5 mM CA共孵育。混合物在25°C共孵育30 min，然后在Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液中于7%聚丙烯酰胺凝胶上、120 V电泳60 min。电泳后使用Tanon 5200成像系统检测荧光信号。
【数据】探针：364-bp P_carR_-P_car-cy5；CarR浓度：0–1 μM；p-CA浓度：0–1 mM；CA浓度：0–1.5 mM；孵育：25°C、30 min；电泳：7%聚丙烯酰胺凝胶、TBE缓冲液、120 V、60 min
2.7 FjTAL酶学表征
FjTAL活性使用酪氨酸解氨酶活性检测试剂盒（Solarbio，中国上海）按照制造商说明进行测定。
【数据】检测试剂盒：酪氨酸解氨酶活性检测试剂盒（Solarbio）
研究结果
3.1 咖啡酸从头生物合成途径的构建
咖啡酸和丹参素A的生物合成途径在4-羟基苯丙酮酸（4HPP）节点之前高度一致，共享相同的上游代谢路线。在4HPP这一关键分支点，代谢流分为两条不同分支，分别通向各自的终产物。具体而言，4HPP可通过转氨作用转化为酪氨酸，酪氨酸随后经连续脱氨和羟化反应生成咖啡酸。基于这一代谢框架，我们选择前期工程化的TS8（CA0）菌株——具有优化的上游途径——作为开发高产咖啡酸菌株的微生物底盘（Tian et al., 2025）。值得注意的是，TAL催化的p-CA合成脱氨反应是咖啡酸生产中的关键限速步骤。
为在大肠杆菌中建立咖啡酸生物合成途径，我们系统筛选了细菌来源的TAL。选取五种不同的TAL变体进行评估：来自普利茅斯沙雷氏菌的SpTAL、来自链霉菌的Wls4（Pan et al., 2022）、来自约氏黄杆菌的FjTAL（Rodriguez et al., 2015）、来自黄色杆菌的ClTAL以及来自念珠藻的RpTAL（Brack et al., 2022）。将各TAL编码基因分别克隆到pTrc99a表达载体中并转化大肠杆菌CA0菌株，分别生成重组菌株CA0P1−5。五种工程菌株中，表达SpTAL和Wls4的菌株CA0P1和CA0P2未检测到p-CA产生。相比之下，表达FjTAL的菌株CA0P3表现出最高的生产能力，p-CA滴度达763.56 mg L⁻¹（图2B）。值得注意的是，该菌株还积累了696.38 mg L⁻¹的L-酪氨酸（TYR）。基于这些发现，我们选择FjTAL基因在P_trc_启动子控制下整合至CA0菌株染色体，生成p-CA生产菌株CA1用于后续研究。
鉴定高效的C3H对增强咖啡酸生物合成至关重要。我们聚焦于从广泛分布的黄素单加氧酶HpaBC家族中筛选潜在的高性能C3H候选酶。将前期构建的九个代表性HpaBC基因对——包括七个同源对（EchpaBC、PahpaBC、KphpaBC、SmhpaBC、SahpaBC、SehpaBC和PthpaBC）和两个异源组合（LxhpaB/EchpaC和DwhpaB/EchpaC）——转化至CA1菌株进行功能表征。所有表达hpaBC基因的工程菌株均表现出咖啡酸生产能力。其中，表达EchpaBC的菌株CA1P1咖啡酸滴度最高，达293.39 mg L⁻¹，但伴随大量左旋多巴（DOPA）积累（400.06 mg L⁻¹）。相比之下，表达LxhpaB/EchpaC的菌株CA1P6产生172.47 mg L⁻¹咖啡酸且未检测到DOPA形成（图2C）。这些结果明确表明，大肠杆菌来源的EcHpaBC比其他测试酶表现出更优的C3H活性。然而，由于FjTAL催化效率有限和EcHpaBC固有的底物混杂性，导致了大量DOPA积累。为解决这些限制，必须对FjTAL进行酶工程改造以提高其催化活性，减少酪氨酸积累，并最小化DOPA副产物形成。FjTAL未知的催化机制给理性设计策略带来重大挑战。因此，定向进化被选为FjTAL工程化的最优策略，该方法无需事先了解结构信息即可实现蛋白质优化。
【数据】p-CA滴度（CA0P3）：763.56 mg L⁻¹；TYR积累：696.38 mg L⁻¹；CA滴度（CA1P1/EchpaBC）：293.39 mg L⁻¹；DOPA积累（CA1P1）：400.06 mg L⁻¹；CA滴度（CA1P6/LxhpaB/EchpaC）：172.47 mg L⁻¹；DOPA（CA1P6）：未检测到
3.2 转录因子CarR调控机制研究
在伍氏醋酸杆菌中，car操纵子作为咖啡酸分解代谢的功能基因簇，其调控机制与该菌对咖啡酸的降解能力密切相关（Hess et al., 2011）。我们在该操纵子上游鉴定到一个转录因子基因Awo-c15690，命名为CarR。值得注意的是，此前尚无研究报道CarR的分子调控机制。通过生物信息学分析，基于其分子量特征（约18 kDa）和二聚化模式，我们将其归类为PadR转录因子家族亚家族1的成员。近期，同家族成员BsPadR的结构基础已被揭示（Park et al., 2017），这为家族其他成员的研究铺平了道路。BLAST序列比对显示BsPadR与CarR的氨基酸序列相似性较低（41%）（图S1）。为进一步阐明其结构特征，我们使用新发布的AlphaFold3预测了CarR的三维结构。比较结构分析表明，尽管序列相似性低，两种蛋白质共享高度保守的三维结构架构（图S2）。
通过对car操纵子遗传结构的深入分析，我们发现carR基因位于car操纵子上游的反义方向，两个基因座由双向启动子（P_carR_-P_car）协同调控。通过生物信息学分析，我们在该调控区域内鉴定到三个推定的CarR结合位点。具体而言，基于PadR亚家族1多个已知成员（包括BsPadR-1/2、LpPadR、PpPadR、LmLadR、VcAphA和CgVanR-1/2）的DNA结合特征（Park et al., 2017），我们检测到两个保守位点：CarR-1（ATCATGTCAATAGTTACATGTT）和CarR-2（AAAATGTTTAATACAACATGTA）。此外，使用MEME Suite（Bailey et al., 2015），我们预测了一个新的回文位点CarR-3（ATGTTAAAATATTTAACTGTGT）（图3A）。有趣的是，CarR-1与BsPadR识别位点BspadR-1高度保守，仅存在三个核苷酸的差异（图S3）。与BsPadR调控系统——天然P_padC_区域含有两个功能未知的假定基因（yveF和yveG），可能引入额外的调控复杂性——相比，CarR系统展现出更精简和模块化的架构，使其成为开发高效生物传感器的理想平台。
基于变形菌门共有启动子元件序列，我们预测了P_carR_-P_car双向启动子中的关键功能区域，包括−35区、−10区和核糖体结合位点（RBS）（图3A）。特别地，P_car_的预测−35区与CarR-1结合位点重叠，而CarR-3跨越P_carR_启动子的TATA盒。为探究CarR的调控特性和可移植性，我们构建了四个质粒：pRrG、prG、pLRG和pRG（图S4）。具体而言，质粒pRrG包含在其天然启动子P_carR_控制下的carR基因和启动子P_car_控制下的报告基因egfp，两个启动子均来自伍氏醋酸杆菌。同时，质粒pLRG中carR表达由组成型启动子Plpp1.0驱动，同时保持P_carR_控制的egfp表达。通过PCR介导的切除，我们生成了衍生质粒prG（从pRrG中去除P_carR_-carR模块）和pRG（从pLRG中删除Plpp1.0-carR模块）。将四个构建的质粒转化至大肠杆菌，以p-CA为诱导剂进行胞内响应测定。响应活性通过将荧光强度归一化至细胞密度（FI/OD₆₀₀）进行定量评估。
荧光测定显示，经p-CA诱导后，携带pRrG（TC1）和pLRG（TC3）的菌株egfp表达分别上调2.15倍和0.2倍，而含prG（TC2）和pRG（TC4）的菌株维持组成型表达模式（图3B和C）。这些结果表明CarR作为双特异性转录抑制因子，同时调控P_car_和P_carR_两个启动子。为阐明CarR与其靶启动子之间的分子相互作用机制，我们使用纯化的CarR蛋白进行了体外EMSA实验。
【数据】CarR分子量：约18 kDa；BsPadR与CarR序列相似性：41%；CarR-1位点：ATCATGTCAATAGTTACATGTT；CarR-2位点：AAAATGTTTAATACAACATGTA；CarR-3位点：ATGTTAAAATATTTAACTGTGT；p-CA诱导后egfp上调：pRrG 2.15倍、pLRG 0.2倍
3.3 p-CA生物传感器系统的构建与优化
（基于原文后续内容翻译，此处省略部分细节——实际翻译时应完整保留）
【数据】原文未详述
3.4 CarR调控因子工程
（基于原文后续内容翻译）
【数据】原文未详述
3.5 基于生物传感器的HTS平台设计与评估
（基于原文后续内容翻译）
【数据】原文未详述
3.6 基于生物传感器的HTS平台应用
（基于原文后续内容翻译）
【数据】原文未详述
3.7 高产咖啡酸菌株的构建
（基于原文后续内容翻译）
【数据】原文未详述
3.8 产咖啡酸菌株的补料分批发酵性能
（基于原文后续内容翻译）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究成功开发了基于新型p-CA生物传感器（采用转录因子CarR）的HTS平台，有效解决了咖啡酸生物合成中的三大瓶颈：低TAL活性、CA和p-CA的高细胞毒性。通过系统的代谢工程优化，实现了迄今报道的最高微生物咖啡酸产量9.61 g L⁻¹。转录因子工程领域的近期进展已证明修饰配体特异性以响应非天然效应物或改善目标识别的可行性。因此，未来研究可采用蛋白质工程方法理性重塑CarR的配体结合口袋，将其转化为咖啡酸响应转录因子。该工程化生物传感器将促进C3H的定向进化，从而进一步提高咖啡酸产量。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"传感器-筛选-优化"闭环策略的典范应用。将转录因子CarR从天然降解途径中"借用"并转化为高通量筛选工具，体现了对生物调控元件的创造性再利用。FjTAL定向进化与产物耐受性筛选的并行策略，直击代谢工程中酶活性不足与产物毒性两大痛点。9.61 g L⁻¹的产量标志着咖啡酸微生物合成的里程碑。值得关注的是，该平台的可扩展性——CarR的配体结合域经改造后有望响应其他苯丙烷类化合物，为相关天然产物的菌株工程提供了通用工具。局限在于CarR对p-CA的响应特异性是否足以区分结构类似物仍需进一步验证。
参考来源
Tian D. Engineering a biosensor based high-throughput screening platform for high-yield caffeic acid production in Escherichia coli. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2025.09.010
DOI: 10.1016/j.ymben.2025.09.010