来源：Endophytic Bacillus subtilis ED24 from Ziziphus lotus (L.) Desf. roots enhances wheat performance and shapes rhizosphere microbiota.（BMC Microbiol）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：CC BY-NC
导读
全球人口增长对农业增产提出严峻挑战，化学肥料和农药的过度使用带来环境代价。从摩洛哥干旱地区野生枣树（Ziziphus lotus）根系中分离内生细菌，筛选出具有多重促生特性的解淀粉芽孢杆菌ED24（Bacillus subtilis ED24）。温室盆栽实验证实，该菌株显著提高小麦发芽率、株高、叶面积和籽粒产量，同时富集有益根际细菌、抑制病原真菌，展现出作为生物肥料的开发潜力。
研究背景
据联合国预测，全球人口在2050年将突破90亿、2100年达110亿。人口增长要求农业产量大幅提升，而集约化耕作往往伴随农药、除草剂和化学肥料的过程使用。这些做法引发多重环境问题——植物组织中的农药残留降低作物品质、地下水受到污染、耐氮植物疯长而土壤动物因农药暴露受到伤害。因此，寻找可持续且环境友好的传统农化投入品替代方案已迫在眉睫。
微生物肥料在这一背景下应运而生。植物相关微生物群落在植物营养、健康和发育中扮演关键角色。植物根系是最具动态性的微生物栖息地之一，植物通过分泌物招募特定微生物，微生物反过来触发植物响应，二者通过分子信号形成复杂的通讯网络。
枣树（Z. lotus）是鼠李科多年生被子植物，原产于摩洛哥干旱和半干旱地区，能在干旱、盐碱和贫瘠土壤中生长。本研究从枣树根内生境中分离促生细菌，评估其促生特性，并在温室条件下考察最优菌株对小麦萌发、生长和根际土壤微生物群落的影响。
研究方法
采样点描述
枣树（Z. lotus (L.) Desf.）为鼠李科多年生被子植物，俗称枣或枣树，原产于摩洛哥干旱和半干旱地区，能在干旱、盐碱和养分贫瘠的土壤中生长。该灌木通常高1–3米，叶片厚实多肉，春季开黄色小花。研究团队于2021年3月在摩洛哥本格里尔穆罕默德六世理工大学（UM6P）实验农场的野生灌木上采集枣树根样品（32° 13′ 11.5′′ N, 7° 53′ 29.9′′ W）。该时期通常为本格里尔雨季之后，微生物活性增强、根系分泌物增多，被认为是内生菌分离的最佳窗口期。物种由UM6P植物学家Hamza Zine教授根据叶片、花序和果实等形态特征，参照摩洛哥植物志进行鉴定，并通过UM6P标本馆标本比对确认。凭证标本保存于UM6P标本馆，编号BEN220。根据Köppen-Geiger分类，本格里尔气候为干旱草原热型（BSh），夏季炎热、冬季温和至凉爽，降雨稀少且主要集中在冬季。年降水量平均100–200毫米，主要在较凉季节的一至两个短雨季内。全年温度温暖至超热，夏季常超过30°C，冬季6–9°C。该地区土壤属于旱成土，呈碱性、砂壤土质地、有机质含量低。
【数据】采样地点：摩洛哥本格里尔UM6P实验农场；坐标：32° 13′ 11.5′′ N, 7° 53′ 29.9′′ W；采样时间：2021年3月；气候类型：BSh（干旱草原热型）；年降水量：100–200 mm；夏季温度：>30°C；冬季温度：6–9°C；土壤类型：旱成土（碱性砂壤土，低有机质）；凭证标本号：BEN220
枣树根采样
采样点植被为枣树单一种群。在研究区域内设置5个样方，每个约10 m × 10 m，间距约10 m。每个样方内从10株枣树灌木采集根样品。每株灌木在10 cm深度处用无菌修枝剪切取三段根段（约5 cm）。每个样方内10株灌木的根样品合并为一个混合样品，共获得5个混合样品。所有样品置于无菌塑料袋中，贴好标签，运输过程中在4°C冷藏箱中保存。
【数据】样方数量：5个；样方面积：10 m × 10 m；样方间距：10 m；每样方采样株数：10株；采样深度：10 cm；根段长度：约5 cm；保存温度：4°C
内生细菌分离
根部消毒程序：在10%次氯酸钠（VWR）中浸泡5分钟，随后在70%乙醇（VWR）中浸泡3分钟，最后用无菌MilliQ水（MilliQ, VWR）彻底冲洗。消毒后的根在研钵中用2 mL 0.85% NaCl水溶液（VWR）研磨，并稀释100倍。从每个原液中取100 µL原液、10⁻¹和10⁻²稀释液，以及100 µL最终洗涤液，涂布于胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）培养基（VWR）上，30°C培养24小时。洗涤液的涂布用于验证消毒效果。为进一步纯化，将形态特征不同的细菌分离物点接于TSA平板上。纯化菌株保存在含10%二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich）的冷冻管（Sigma-Aldrich）中，于-80°C保存。
【数据】消毒剂：10%次氯酸钠（5 min）、70%乙醇（3 min）；研磨液：2 mL 0.85% NaCl；稀释倍数：100倍；涂布量：100 µL；培养基：TSA；培养温度：30°C；培养时间：24 h；保存条件：-80°C，10% DMSO
DNA提取、16S rRNA基因扩增与细菌鉴定
细菌分离物通过16S rRNA基因测序进行鉴定，使用引物pA（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）（Neurogentec）和926R（5’-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3’）（Neurogentec）。DNA提取前，分离物在10 mL TSB中于28°C温和振荡培养24小时。取1 mL细菌培养物转移至微量离心管中，离心2分钟收集菌体。使用GenElute™细菌基因组DNA试剂盒（Sigma-Aldrich）按制造商说明书提取基因组DNA。PCR扩增反应体系为50 µL，包含：23 µL水、25 µL MyTaq Mix、各1 µL引物（终浓度0.2 µM）、1 µL提取的基因组DNA作为模板。PCR程序：94°C初始变性5分钟；35个循环的94°C变性30秒、54°C退火30秒、72°C延伸1分钟；最后72°C延伸10分钟。扩增产物（约900 bp）经琼脂糖凝胶电泳验证，由Genome Quebec测序。序列与NCBI BLAST数据库中的标准细菌序列进行比对。
【数据】引物：pA / 926R；培养条件：10 mL TSB，28°C，24 h；离心：2 min；PCR体系：50 µL（水23 µL + MyTaq Mix 25 µL + 引物各1 µL + DNA模板1 µL）；引物终浓度：0.2 µM；PCR程序：94°C 5 min；35×（94°C 30 s，54°C 30 s，72°C 1 min）；72°C 10 min；扩增子大小：约900 bp
植物促生特性评估
#### 磷溶解活性
分离物接种于NBRIP琼脂培养基（Sigma-Aldrich）上，该培养基以磷酸三钙（Ca₃(PO₄)₂）为不溶性磷源，30°C培养7天。菌落周围出现透明水解圈表明细菌具有溶磷能力。为定量溶磷活性，将细菌转移至NBRIP液体培养基中，30°C再培养7天。培养结束后离心培养物，使用连续流动分析仪测定可溶性磷含量。
【数据】培养基：NBRIP琼脂/肉汤；不溶性磷源：磷酸三钙；培养温度：30°C；培养时间：7天（固体）+ 7天（液体）；检测方法：连续流动分析仪
#### 锌溶解
使用基础琼脂培养基，分别添加不同不溶性锌源：氧化锌（ZnO）（Sigma-Aldrich）、磷酸锌（Zn₃(PO₄)₂）（Sigma-Aldrich）和碳酸锌（ZnCO₃）（Sigma-Aldrich）。分离物点接于平板上，30°C培养48小时。菌落周围出现水解圈表明细菌具有溶锌能力。
【数据】锌源：ZnO、Zn₃(PO₄)₂、ZnCO₃；培养温度：30°C；培养时间：48 h
#### 固氮能力
分离菌株接种于Burks琼脂培养基（Sigma-Aldrich）上，30°C培养7天。在培养基上的生长情况作为细菌固氮能力的指标。
【数据】培养基：Burks琼脂；培养温度：30°C；培养时间：7天
#### 氨产生
细菌在无菌蛋白胨水中于30°C培养96小时。培养结束后离心，向上清液中加入Nessler试剂，用分光光度计在450 nm处测定吸光度。
【数据】培养基：蛋白胨水；培养温度：30°C；培养时间：96 h；检测波长：450 nm；试剂：Nessler试剂
#### 吲哚-3-乙酸（IAA）产生
使用Salkowski试剂测定。细菌在含0.1% L-色氨酸的TSB培养基（Sigma-Aldrich）中于28°C培养7天。培养结束后离心，上清液与Salkowski试剂混合。Salkowski试剂配制方法：1 mL 0.5 M FeCl₃与50 mL 35%高氯酸混合。30分钟后，用分光光度计在535 nm处测定吸光度。
【数据】培养基：TSB + 0.1% L-色氨酸；培养温度：28°C；培养时间：7天；检测波长：535 nm；试剂：Salkowski试剂（1 mL 0.5 M FeCl₃ + 50 mL 35%高氯酸）；反应时间：30 min
#### 铁载体产生
使用铬天青S（CAS）琼脂培养基（Sigma-Aldrich）检测。细菌点接于平板上，30°C培养7天。菌落周围出现橙色水解圈表明产生铁载体。
【数据】培养基：CAS琼脂；培养温度：30°C；培养时间：7天
#### 胞外酶产生
纤维素酶产生：细菌点接于CMC琼脂平板上，30°C培养48小时。培养结束后，平板用刚果红溶液浸染，随后用1 M NaCl处理。菌落周围出现透明圈表明CMC降解活性。
【数据】培养基：CMC琼脂；培养温度：30°C；培养时间：48 h；染色：刚果红 + 1 M NaCl
蛋白酶产生：细菌点接于添加酪蛋白作为蛋白源的营养琼脂培养基上，30°C培养48小时。菌落周围出现水解圈表明存在胞外蛋白酶。
【数据】培养基：营养琼脂 + 酪蛋白；培养温度：30°C；培养时间：48 h
研究结果
内生细菌的分离
从根样品中共获得46株内生细菌分离物，表现出多样的形态特征，包括颜色、形状和粘稠度的差异。这些分离物系统编号为ED1至ED46。
【数据】分离菌株总数：46株；编号范围：ED1–ED46
16S rRNA基因鉴定
46株细菌中，通过16S rRNA基因测序鉴定出17个不同物种（图1）。群落以芽孢杆菌属为主，包括惠州芽孢杆菌（B. huizhouensis）、简单芽孢杆菌（B. simplex）、坚强芽孢杆菌（B. firmus）、蜡样芽孢杆菌（B. cereus）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis），表明该属的丰富度较高。其他值得关注的属包括葡萄球菌属（Staphylococcus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、短芽孢杆菌属（Brevibacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）、微杆菌属（Microbacterium）、假节杆菌属（Pseudarthrobacter）、动性微菌属（Planomicrobium）和地芽孢杆菌属（Terribacillus），表明分离物中存在显著的多样性。
图1 基于部分16S rRNA基因序列构建的系统发育树，显示本研究所获细菌分离物之间的分类学关系。采用邻接法构建。分支节点处的数字代表自举支持值（以p值表示），反映推断的系统发育关系的稳健性。分离物编号后为其最近的分类学归属。
【数据】鉴定物种数：17种；优势属：芽孢杆菌属（含5种）；其他属：8个
植物促生特性与ED24菌株筛选
对17种不同细菌物种的PGP特性进行评估，B. subtilis ED24脱颖而出，成为最有潜力的菌株（表1）。该菌株表现出高效的磷溶解能力，特别是对磷酸三钙（TCP），溶解率达108 mg L⁻¹。此外，它还能有效溶解多种锌源，包括ZnO、Zn₃(PO₄)₂和ZnCO₃，这一能力在大多数其他菌株中未观察到。B. subtilis ED24还表现出最高的铁载体产生指数（2.7），并具有显著的固氮能力。该菌株产生大量氨（0.6 µmol/mL）和吲哚-3-乙酸（IAA）（9.10 µg/mL）。此外，ED24表现出强纤维素酶活性，水解圈达5.5 mm。这种广谱功能性使其成为植物体内研究的合适代表菌株。
【数据】磷溶解率：108 mg L⁻¹（TCP）；锌溶解：ZnO、Zn₃(PO₄)₂、ZnCO₃；铁载体产生指数：2.7；氨产生量：0.6 µmol/mL；IAA产生量：9.10 µg/mL；纤维素酶水解圈：5.5 mm
*B. subtilis* ED24对小麦萌发和幼苗参数的影响
鉴于目标是筛选高潜力候选菌株进行概念验证研究，B. subtilis ED24因其在16株分离物中表现出最全面且最一致的PGP特征而被优先选择进行植物体内评估。体外实验表明，B. subtilis ED24显著提高了小麦种子萌发率。经ED24处理的种子萌发率为88%，而未接种对照为71%。然而，接种ED24对茎长未产生统计学显著差异——接种组为11.77 cm，对照组为11.30 cm。同样，根长也未受处理显著影响，接种组为8.32 cm，未接种组为7.10 cm（表2）。这些体外结果得到体内盆栽实验的证实。播种后7天，对照组萌发率为83%，而ED24处理组种子萌发率显著更高，达96%。这些发现证实ED24菌株在受控条件下促进小麦早期建植的潜力。
【数据】体外萌发率：ED24 88% vs 对照71%；体外茎长：11.77 cm vs 11.30 cm（无显著差异）；体外根长：8.32 cm vs 7.10 cm（无显著差异）；体内萌发率：ED24 96% vs 对照83%；统计显著性：p ≤ 0.05
*B. subtilis* ED24对小麦生长的影响
#### 对小麦植株形态参数的影响
植物体内试验的形态生长参数显示，与未接种对照相比，接种B. subtilis ED24显著提高了茎长和叶面积。接种组平均株高达52.76 cm，而对照植株为44.98 cm。同样，接种组叶面积（46.2 cm²）显著大于对照组（30.82 cm²）。相比之下，穗长在处理间无显著差异，接种组和对照组分别为6.90 cm和6.86 cm。有趣的是，B. subtilis ED24接种对根系形态产生负面影响。接种组根长缩短至10.45 cm，而对照为15.95 cm。根表面积也从对照的22.42 cm²降至ED24处理组的14.86 cm²（表3）。尽管根系发育减少，接种显著增加了地上部生物量。ED24处理组地上部干重为4.28 g，对照组为3.45 g。相反，接种组根干重（1.497 g）显著低于对照组（1.903 g）（图2）。
图2 B. subtilis ED24对小麦地上部和根部干生物量的影响。竖线表示基于五次重复的平均值和标准误（Mean ± SE），每次重复为每盆5株小麦。不同小写字母表示在p ≤ 0.05水平下具有统计学显著性。
【数据】株高：52.76 cm vs 44.98 cm；叶面积：46.2 cm² vs 30.82 cm²；穗长：6.90 cm vs 6.86 cm（无显著差异）；根长：10.45 cm vs 15.95 cm；根表面积：14.86 cm² vs 22.42 cm²；地上部干重：4.28 g vs 3.45 g；根干重：1.497 g vs 1.903 g；统计显著性：p ≤ 0.05
#### 对地上部N、P、K含量的影响
地上部成分分析显示，与对照相比，接种B. subtilis ED24显著提高了小麦地上部钾含量，分别为106.6 mg/盆和63.92 mg/盆。然而，地上部氮和磷含量无显著差异。B. subtilis ED24处理组氮含量为29.37 mg/盆，对照组为20.16 mg/盆；磷含量方面，ED24处理组为2.33 mg/盆，对照组为2.14 mg/盆（图3）。
图3 B. subtilis ED24对小麦地上部氮、磷、钾含量的影响。竖线表示基于五次重复的平均值和标准误（Mean ± SE），每次重复为每盆5株小麦。不同小写字母表示在p ≤ 0.05水平下具有统计学显著性。
【数据】钾含量：106.6 mg/盆 vs 63.92 mg/盆（显著）；氮含量：29.37 mg/盆 vs 20.16 mg/盆（无显著差异）；磷含量：2.33 mg/盆 vs 2.14 mg/盆（无显著差异）；统计显著性：p ≤ 0.05
#### 对小麦产量和籽粒成分的影响
产量分析显示，B. subtilis ED24处理的小麦每盆种子数显著多于阴性对照组——处理组每盆132粒，对照组每盆111粒。然而，千粒重在处理组和阴性对照组之间无显著差异，分别为40.80 g和39.19 g。收获种子的成分分析表明，接种B. subtilis ED24的小麦营养品质显著提升，特别是蛋白质含量（19.50% vs 18.93%）和粗纤维含量（2.53% vs 2.48%）。然而，淀粉含量（处理组49.73%，对照组51.57%）和水分含量（3.39% vs 3.42%）未受显著影响。有趣的是，细菌处理还影响了其他籽粒品质参数。
【数据】每盆种子数：132粒 vs 111粒（显著）；千粒重：40.80 g vs 39.19 g（无显著差异）；蛋白质含量：19.50% vs 18.93%；粗纤维含量：2.53% vs 2.48%；淀粉含量：49.73% vs 51.57%（无显著差异）；水分含量：3.39% vs 3.42%（无显著差异）；统计显著性：p ≤ 0.05
讨论与解读
本研究证明B. subtilis ED24通过多种互补机制促进小麦产量提升。该菌株表现出关键PGP特性，包括磷酸盐和锌溶解、IAA和铁载体产生、固氮以及纤维素分解活性。除这些直接效应外，微生物群落分析显示处理植株根际的细菌和真菌群落均发生显著变化，有益类群的丰度增加。综合来看，这些发现表明B. subtilis ED24不仅通过其内在的PGP能力支持小麦生长，还通过调节根系相关微生物组的结构，使其向有益微生物群落方向转变。
B. subtilis ED24的PGP特征表现稳健。其磷酸盐溶解能力达108 mg L⁻¹，伴随培养基酸化至pH 5.1，这与先前研究一致——细菌对磷酸三钙的溶解常伴随有机酸产生导致的酸化。B. subtilis已知分泌草酸和乳酸等有机酸混合物，将矿物结合的无机磷（Ca、Mg、Fe、Al）释放为植物可利用形态。
编译者解读
从合成生物学应用角度看，B. subtilis ED24的价值在于其多效促生特征集中于单一菌株——溶磷、溶锌、固氮、产铁载体和IAA、分泌纤维素酶，这种"一站式"配置减少了生物肥料生产中多菌株复配的复杂度。根系形态变化（根长缩短但地上部生物量增加）提示碳分配策略可能发生了重新编程，值得从植物-微生物互作分子层面深挖。不足之处在于，本研究为温室盆栽验证，田间复杂环境下的定殖效率与效果稳定性仍需考察；ED24基因组的促生相关基因簇解析也将为理性改造提供靶点。
参考来源
Oulkhir FE, Biskri L, Bargaz A, Errafii K, Allaoui A. Endophytic Bacillus subtilis ED24 from Ziziphus lotus (L.) Desf. roots enhances wheat performance and shapes rhizosphere microbiota. BMC Microbiol. PMID: 42286473. DOI: 10.1186/s12866-026-05222-1.
PMID: 42286473