来源：Systematic evaluation of the DNA repair machinery facilitated the development of efficient genome editing tools for the red yeast Rhodotorula toruloides.（Synth Syst Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：CC BY-NC
导读
圆红冬孢酵母（Rhodotorula toruloides）是极具潜力的工业产油酵母，但其同源重组（HR）效率极低，严重制约精准遗传改造。本研究系统评估了该酵母的DNA修复机制，通过过表达HR相关蛋白、敲除KU70/KU80以及引入CRISPR-Cas9双链断裂，将HR效率从不足0.1%提升至75–95%，为产油担子菌酵母的精准基因编辑开辟了新路径。
研究背景
圆红冬孢酵母属于担子菌门，是典型的产油酵母，能以多种碳源合成脂质和萜类化合物。与酿酒酵母和大肠杆菌等常规微生物相比，其具有高脂质积累、强胁迫耐受性和代谢灵活性等优势，被视为工业生物技术的理想底盘。然而，该酵母的同源重组效率极低，严重限制了面向代谢工程和合成生物学的精准遗传操作。
子囊菌与担子菌约在十亿年前分化，生物学特性差异显著。以酿酒酵母为代表的子囊菌基因组紧凑、内含子密度低、天然HR效率高；而圆红冬孢酵母等担子菌基因组GC含量高（约60%）、内含子分布密集（平均每基因约5个），遗传操作难度大。目前基于NHEJ途径的遗传改造虽已扩展其生物技术应用，但随机整合导致表型评估繁琐、理性菌株设计困难。因此，开发基于HR途径的高效遗传工具是该领域的关键需求。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
本研究所用全部菌株详细信息及工程菌株间关系分别汇总于表S1和图S1。野生型圆红冬孢酵母NP11由本实验室分离。圆红冬孢酵母菌株在YPD培养基（20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨）中、30°C、200 rpm摇床培养。大肠杆菌DH10B或Fast-T1及农杆菌AGL1分别在LB培养基（10 g/L NaCl、10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物）中、37°C和30°C培养。本研究使用的抗生素包括卡那霉素（Kan，50 μg/mL）、氨苄青霉素（Amp，100 μg/mL）、潮霉素（HYG，50 μg/mL）、诺尔丝菌素（NAT，50 μg/mL）、遗传霉素（G418，50 μg/mL）、博来霉素（BLE，100 μg/mL）和头孢噻肟（Cef，300 μg/mL）。不含尿嘧啶的合成完全培养基（SD-Ura）含20 g/L葡萄糖、6.7 g/L无氨基酸酵母氮源（YNB）和20 g/L琼脂。SD+5-FOA培养基含6.7 g/L YNB、0.1 g/L尿嘧啶、1.0 g/L 5-氟乳清酸和20 g/L琼脂，用于筛选尿嘧啶营养缺陷型菌株。
【数据】培养基：YPD（20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨）；温度：30°C；转速：200 rpm；抗生素浓度：Kan 50 μg/mL、Amp 100 μg/mL、HYG 50 μg/mL、NAT 50 μg/mL、G418 50 μg/mL、BLE 100 μg/mL、Cef 300 μg/mL；SD-Ura：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB、20 g/L琼脂；SD+5-FOA：6.7 g/L YNB、0.1 g/L尿嘧啶、1.0 g/L 5-FOA、20 g/L琼脂
2.2 RtKU70和RtKU80的鉴定、序列分析与系统发育分析
以新型隐球菌和酿酒酵母的Ku70（XP_573016）和Ku80（XP_568810）蛋白序列为查询序列，对圆红冬孢酵母基因组进行BLAST分析，鉴定出同源基因RtKU70和RtKU80。利用NCBI CD-Search和SMART在线服务器分析推导的RtKu70和RtKu80蛋白的保守结构域架构。本研究使用的所有参考Ku70和Ku80蛋白序列均从NCBI数据库获取。使用MEGA 5.0版进行多序列比对和系统发育树重建。
【数据】查询序列：Ku70（XP_573016）、Ku80（XP_568810）；软件：NCBI CD-Search、SMART在线服务器、MEGA 5.0；数据库：NCBI
2.3 质粒与菌株构建
本研究所用质粒和引物分别列于表S2和表S3。圆红冬孢酵母NP11和酿酒酵母S288C的基因组DNA序列从NCBI数据库获取。所有质粒均采用无限制性酶切位点克隆法构建。
【数据】质粒构建方法：无限制性酶切位点克隆法；数据库：NCBI
#### 2.3.1 在圆红冬孢酵母中过表达HR相关蛋白
ScRAD51、ScRAD52、ScRAD54、ScRAD59和ScSAE2基因从酿酒酵母基因组DNA扩增获得。在圆红冬孢酵母NP11中，除RtRAD59和RtSAE2外，其余同源基因均通过序列比对鉴定。本研究所用HR相关蛋白列于表S4。这些蛋白在三个不同强度的启动子下表达。选取两个组成型启动子——磷酸甘油酸激酶启动子（PPGK）和磷酸丙糖异构酶启动子（PTPI），其中PPGK的转录活性高于PTPI。此外，还选取了诱导型启动子——乙醇脱氢酶启动子（PADH2），该启动子仅在非阻遏条件下驱动基因表达。这些质粒通过农杆菌介导转化法（ATMT）转入圆红冬孢酵母。
【数据】启动子：PPGK（强组成型）、PTPI（中等组成型）、PADH2（诱导型）；转化方法：ATMT；基因来源：酿酒酵母基因组DNA
#### 2.3.2 敲除圆红冬孢酵母中的RtKU70和RtKU80
利用先前建立的圆红冬孢酵母CRISPR-Cas9系统敲除RtKU70（GenBank：RHTO_06014）和RtKU80（GenBank：RHTO_00198）基因。靶位点和PAM序列列于表S5。通过ATMT将sgRNA靶向敲除盒导入NS01菌株后，随机挑选转化子通过菌落PCR确认，并经测序进一步验证（图S2）。
【数据】靶基因：RtKU70（RHTO_06014）、RtKU80（RHTO_00198）；敲除系统：CRISPR-Cas9；转化方法：ATMT；验证方法：菌落PCR+测序
#### 2.3.3 醋酸锂转化
醋酸锂转化法（LiAc法）中，将环状质粒或线性DNA片段（PCR扩增获得）转化至圆红冬孢酵母细胞。简要步骤如下：将圆红冬孢酵母菌株在YPD培养基中30°C、200 rpm振荡培养过夜。将过夜培养物稀释至OD600为0.2于新鲜YPD培养基中，培养至OD600达到0.6。随后离心收集细胞，用无菌超纯水洗涤两次、100 mM醋酸锂（LiAc）洗涤一次，最终重悬于100 mM LiAc溶液中。离心并完全去除上清后，向细胞沉淀中加入含10 μL鲑鱼精DNA（10 mg/mL）、240 μL PEG 3350、36 μL 1.0 M LiAc和1–2 μg目标DNA的转化混合物，轻轻混匀，30°C孵育30分钟。随后在37°C热激60分钟。转化后的酵母细胞用YPD培养基洗涤一次，在YPD中30°C、200 rpm振荡恢复培养过夜。最后将细胞涂布于含抗生素的YPD琼脂平板上，30°C培养。
【数据】OD600：0.2起始、0.6收集；LiAc浓度：100 mM；鲑鱼精DNA：10 μL（10 mg/mL）；PEG 3350：240 μL；1.0 M LiAc：36 μL；目标DNA：1–2 μg；孵育：30°C、30 min；热激：37°C、60 min；恢复培养：30°C、200 rpm、过夜
#### 2.3.4 供体DNA的构建与转化
为评估圆红冬孢酵母的HR效率，选取了四个基因，其缺失可产生可区分的表型特征，包括菌落色素改变和营养缺陷型表型。CRTI（GenBank：RHTO_04602，编码八氢番茄红素脱氢酶）和CAR2（GenBank：RHTO_04605，编码催化八氢番茄红素合酶和番茄红素环化酶的双功能蛋白）参与β-胡萝卜素生物合成途径，其失活使圆红冬孢酵母菌落颜色变为白色。ADE2（GenBank：RHTO_02297，编码腺苷酸琥珀酸合酶）参与腺嘌呤生物合成，其缺失导致菌落呈棕色表型。URA3（GenBank：RHTO_02309，编码乳清苷-5′-磷酸脱羧酶）对尿嘧啶（RNA合成所必需的嘧啶核苷酸）的生物合成至关重要。URA3基因因其适用于正选择和负选择，被广泛用作酵母遗传操作中的选择标记。
为构建供体DNA，从圆红冬孢酵母NP11基因组扩增上述四个基因两侧各1000 bp的同源臂（HAs）。将这些HA片段组装到质粒pH01和pG01中，分别插入PPGK-HYG-TNOS和PPGK-G418-TNOS表达盒两侧。为评估HA长度对HR效率的影响，额外构建了携带50 bp、200 bp和500 bp同源臂（侧翼为PPGK-HYG-TNOS表达盒）的质粒。突变体通过上述ATMT和LiAc方法获得。
【数据】靶基因：CRTI（RHTO_04602）、CAR2（RHTO_04605）、ADE2（RHTO_02297）、URA3（RHTO_02309）；同源臂长度：1000 bp（标准）、50/200/500 bp（长度评估）；选择标记：HYG、G418；转化方法：ATMT和LiAc
2.4 细胞生长分析
菌株的最大比生长速率（μmax）在YPD培养基中测定，使用Microscreen仪器（MicroScreen HT；杰灵仪器制造，天津，中国）每30分钟测量一次OD600。培养起始OD600为0.1–0.2，μmax按先前描述的方法计算。
【数据】培养基：YPD；测定仪器：MicroScreen HT；测量间隔：30 min；起始OD600：0.1–0.2
2.5 DNA损伤敏感性测定
评估相关菌株对紫外线辐射和甲基甲烷磺酸酯（MMS）的敏感性。UV敏感性测定中，培养物暴露于6 W UV光（265 nm）0–4分钟，距离25 cm，在30°C黑暗中孵育后通过计数菌落确定存活率。存活百分比通过将菌落数归一化至未处理对照组计算。MMS敏感性测定中，同时进行点样分析（10 μL 10倍梯度稀释液点样于含0–0.03%（v/v）MMS的YPD平板）和涂布分析（50 μL细胞悬液涂布于0.01–0.02% MMS平板）。所有平板在分析前于30°C孵育3–4天。细胞存活百分比计算公式为（MMS平板上菌落数/对照平板上菌落数）×100。
【数据】UV条件：6 W、265 nm、0–4 min、距离25 cm、30°C暗培养；MMS点样：0–0.03%（v/v）、10 μL 10倍梯度稀释；MMS涂布：0.01–0.02%、50 μL；孵育：30°C、3–4天
2.6 RNA提取与RT-qPCR
使用FastRNA Red Kit（MP Biomedicals，加利福尼亚，美国）从YPD培养基中培养的圆红冬孢酵母菌株提取总RNA。使用HiScript IV RT SuperMix for qPCR（Vazyme，南京，中国）通过逆转录从提取的总RNA合成互补DNA（cDNA）。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix在LightCycler® 96实时PCR系统（Roche，巴塞尔，瑞士）上进行定量PCR（qPCR），设置三个生物学重复。
【数据】RNA提取试剂盒：FastRNA Red Kit；逆转录试剂：HiScript IV RT SuperMix for qPCR；qPCR仪器：LightCycler® 96；试剂：Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix；生物学重复：3次
研究结果
3.1 HR途径蛋白过表达增强HR介导的DNA修复
为提升圆红冬孢酵母的HR效率，系统评估了过表达HR相关基因——包括RAD51、RAD52、RAD54、RAD59和SAE2（来源于圆红冬孢酵母或酿酒酵母）——对基因整合效率的影响。通过同源搜索未在圆红冬孢酵母基因组中鉴定到SAE2和RAD59的同源物。
由于过表达HR相关蛋白存在潜在细胞毒性，可能干扰正常染色体重组，因此测试了PPGK、PTPI、PADH2三种启动子以驱动RAD51或RAD52的适度表达。这两种蛋白形成的关键复合物在HR修复途径中发挥核心作用。选择CRTI作为报告基因以确定HR效率。值得注意的是，强启动子PPGK驱动的转录水平极低，几乎检测不到（图S4）。相比之下，中等强度启动子PTPI和诱导型启动子PADH2驱动的RAD52和RAD51转录水平显著更高。推测低转录可能源于获得的克隆中PPGK启动子被沉默或突变，因其强活性可能具有毒性。HR效率改善趋势为PADH2 > PTPI > PPGK，但差异无统计学显著性（图1A）。有趣的是，PADH2启动子驱动的RAD52表达在诱导条件下并未增强HR效率，但在阻遏条件（高葡萄糖）下表现出最高的改善趋势。阻遏条件下的HR增强与PADH2启动子的泄漏表达一致，因为RT-qPCR在抑制条件下直接检测到了RAD52的转录本（图S4C和S4D）。这种基础表达水平可能有效支持DNA修复而不引起毒性。与诱导型启动子驱动的基因不同，组成型启动子下的基因保持近乎稳定的表达，不同采样位置和时间点间未检测到显著差异。为避免使用单一诱导启动子可能带来的表达不一致和代谢负担，工程菌株设计为RAD52使用PADH2启动子、其他重组酶使用PTPI启动子。该配置产生了更稳定、可控和可重复的表达系统，尽管不可避免地伴随轻微的生长延迟（图S5和表S6）。遗憾的是，ScRAD54表达被证明是致死的（数据未显示）。所有其他整合基因的功能性转录均通过RT-qPCR确认（图S4E和S4F）。
如图1B所示，单独过表达ScRAD52、RtRAD54或ScSAE2使HR效率较野生型菌株（NP11）提高了10至20倍。然而，绝对效率仍低于2%。RT-qPCR结果证实了工程菌株中RtRAD54的高表达水平，提示圆红冬孢酵母中Rad54的基础内源活性可能较低，其过表达弥补了这一缺陷。随后进行了HR相关蛋白的两两共表达。结果显示，携带RtRAD54-ScRAD52或ScSAE2-ScRAD52共表达对的菌株略微进一步提高了HR效率。三基因共表达结果相似。与预期的加性效应相反，大多数组合的共表达相对于单蛋白或双蛋白过表达普遍抑制了HR效率，暗示多蛋白表达可能带来适应性成本或破坏HR机制化学计量平衡。
一个关键的例外是菌株N54252，其共表达ScSAE2、ScRAD52和RtRAD54，在CRTI位点表现出显著增强的HR效率3.63%，优于所有其他对照（图1B）。这一三重组合的卓越表现可归因于它们在HR关键阶段的功能协同。Sae2通过切除DNA双链断裂产生3′单链DNA突出端来启动该过程。该底物随后被Rad52识别，Rad52促进Rad51的成核以形成活性核蛋白丝。随后，Rad54（一种转位酶和Rad51关键辅因子）刺激同源搜索、链入侵，并稳定重组中间体。它们的协同表达从而解决了多个限速步骤，建立了更高效的HR机制。
总之，虽然HR相关蛋白的过表达可在圆红冬孢酵母中适度提高HR效率，但即使在优化表达方案下效率仍然较低，表明除这些蛋白外还存在其他限制性障碍，如NHEJ途径的竞争或缺乏程序性DNA双链断裂。
【数据】HR效率：单过表达提高10–20倍但<2%；三重组合N54252：3.63%（CRTI位点）；启动子效率趋势：PADH2 > PTPI > PPGK；ScRAD54表达：致死；统计方法：单因素方差分析（n=6）
3.2 KU异二聚体破坏增强HR但损害基因组稳定性
在圆红冬孢酵母NP11中，RtKU70和RtKU80编码的蛋白各含一个保守的Ku核心结构域。RtKU70具有独特的SAP结构域，RtKU80具有独特的血管性血友病因子A结构域（图S6A和S6B）。这些结构域对DNA修复和染色体稳定性至关重要。系统发育分析进一步支持Ku蛋白在不同物种间的进化保守性（图S6C）。这些结果表明RtKu70和RtKu80在结构和功能上是保守的，可能与其真核同源物作用方式相似。圆红冬孢酵母对NHEJ的强烈偏好可能归因于Ku70-Ku80异二聚体的高活性。
基于上述分析，需要分别敲除RtKU70和RtKU80以研究Ku蛋白对HR机制的功能影响。因此，利用CRISPR-Cas9系统成功获得了ku70Δ和ku80Δ突变体（图S2）。选择两个均表现出翻译提前终止的突变菌株ΔKu70.3-19（命名为KQ01）和ΔKu80.2-10（命名为KQ02）进行进一步测试。生长曲线分析显示，RtKU70或RtKU80缺失均不损害营养丰富条件下的细胞增殖（图2A）。在CRTI位点，KQ01和KQ02分别表现出显著更高的HR效率4.2%和5.3%，而亲本菌株NS01的HR效率为0.6%（图2B）。KQ01和KQ02在ATMT整合各种基因表达盒时均表现出显著降低的转化效率（图2E），这与Ku异二聚体促进T-DNA随机整合的既定作用一致。这可能归因于KU缺陷导致的DNA损伤修复受损和细胞适应性整体下降。为进一步评估DNA修复能力，将KQ01和KQ02暴露于UV辐射和MMS。UV辐射诱导环丁烷嘧啶二聚体和双链断裂，MMS使鸟嘌呤和腺嘌呤碱基烷基化导致错配和复制叉停滞。虽然在YPD平板上未观察到生长缺陷，但亲本菌株NS01在UV照射和MMS处理下均表现出存活率随处理强度增加而下降的趋势（图S7）。
【数据】HR效率：KQ01（ku70Δ）4.2%、KQ02（ku80Δ）5.3%、NS01 0.6%（CRTI位点）；转化效率：KQ01和KQ02显著降低；生长：营养丰富条件下无缺陷；统计方法：单因素方差分析（n=3）
3.3 组合遗传干预增强圆红冬孢酵母HR效率
基于上述发现，作者推测将HR蛋白过表达与KU基因敲除相结合可能协同增强HR效率。为此，在KQ02（ku80Δ）菌株中过表达ScRAD52，获得菌株KQ02S03。以CAR2位点作为报告基因座，设计供体DNA为G418抗性表达盒两侧翼各1 kb同源臂（图4A）。结果显示，NS03（过表达ScRAD52）的HR效率为1.8%，KQ02（ku80Δ）的HR效率为2.3%，而KQ02S03（ku80Δ+ScRAD52过表达）的HR效率达到5.9%（图4B）。KQ02S03的HR效率显著高于单独策略，表明两种策略的组合对HR效率具有叠加效应。
在转化效率方面，NS03表现出最高的转化效率，而KQ02和KQ02S03的转化效率相对较低（图4C），这与KU缺失导致的T-DNA随机整合能力下降一致。DNA损伤敏感性评估显示，KQ02和KQ02S03在0.02% MMS或UV照射处理后存活率低于NS03，但KQ02S03的存活率高于KQ02（图4D），表明ScRAD52过表达部分缓解了KU80缺失引起的突变胁迫超敏性。
进一步测试LiAc介导的线性供体DNA片段转化。结果显示，在LiAc转化条件下，NS03、KQ02和KQ02S03的HR效率分别为1.2%、1.5%和2.8%（图4E），转化效率趋势与ATMT条件下相似（图4F）。LiAc方法的总体HR效率低于ATMT方法，但组合策略在两种转化方法下均一致性地提高了HR效率。
【数据】HR效率（CAR2位点，ATMT）：NS03 1.8%、KQ02 2.3%、KQ02S03 5.9%；HR效率（CAR2位点，LiAc）：NS03 1.2%、KQ02 1.5%、KQ02S03 2.8%；MMS浓度：0.02%；统计方法：单因素方差分析（n=3）
3.4 CRISPR介导编辑与DNA修复途径工程结合增强HR效率
为评估DSB诱导对HR效率的影响，作者利用CRISPR-Cas9系统在CAR2位点引入程序性双链断裂。将CAR2靶向HR供体载体通过ATMT转化至过表达HR相关蛋白的菌株（NS02-NS06）及对照菌株NS01。结果显示，对照菌株NS01的HR效率为0.6%，而过表达ScRAD52的NS03菌株HR效率达到16%（图5A），较无DSB条件下（1.8%）提升近9倍。
对转化子的基因分型分析显示，HR事件与NHEJ突变缺失事件的比例在不同菌株间存在显著差异（图5B）。在NS03菌株中，HR事件占主导地位，而对照菌株中NHEJ事件更为普遍。
进一步在三个基因组位点（CAR2、ADE2和URA3）评估了NS03、KQ02和KQ02S03菌株在ATMT转化下的HR效率。结果显示，KQ02S03菌株在三个位点均表现出最高的HR效率，分别为CAR2位点95%、ADE2位点75%和URA3位点86%（图5C）。KQ02菌株的HR效率分别为CAR2 28%、ADE2 21%和URA3 25%，NS03菌株分别为CAR2 16%、ADE2 12%和URA3 15%。总菌落数方面，NS03在各靶位点均获得最高菌落数，KQ02和KQ02S03的菌落数相对较低（图5D），表明KU缺失对转化效率的负面影响在CRISPR介导的编辑中仍然存在。
LiAc介导的线性供体DNA片段递送实验中，供体DNA表达盒携带侧翼为同源臂的选择标记以及共表达的sgRNA表达单元。NS03、KQ02和KQ02S03在LiAc条件下的HR效率分别为8.5%、9.2%和28%（图5E），转化效率趋势与ATMT条件一致（图5F）。LiAc方法在组合策略下同样实现了HR效率的显著提升，但总体低于ATMT方法。
【数据】HR效率（CAR2，ATMT，CRISPR）：NS01 0.6%、NS03 16%；HR效率（三基因座，KQ02S03）：CAR2 95%、ADE2 75%、URA3 86%；HR效率（三基因座，KQ02）：CAR2 28%、ADE2 21%、URA3 25%；HR效率（三基因座，NS03）：CAR2 16%、ADE2 12%、URA3 15%；HR效率（CAR2，LiAc，CRISPR）：NS03 8.5%、KQ02 9.2%、KQ02S03 28%；统计方法：单因素方差分析（n=3）
3.5 不同同源臂长度对HR效率的影响
为评估同源臂长度对HR效率的影响，作者在CAR2、ADE2和URA3三个基因座分别设计了50 bp、200 bp、500 bp和1000 bp四种同源臂长度的供体DNA（图6A）。结果显示，同源臂长度对HR效率具有显著影响。在三个基因座中，1000 bp同源臂均获得最高的HR效率。500 bp同源臂的HR效率与1000 bp组无显著差异（图6B）。然而，200 bp同源臂的HR效率显著降低，50 bp同源臂几乎无法检测到HR事件。
具体而言，在CAR2位点，1000 bp组的HR效率为95%，500 bp组为88%，200 bp组为35%，50 bp组仅为2%。在ADE2位点，1000 bp组为75%，500 bp组为70%，200 bp组为22%，50 bp组低于1%。在URA3位点，1000 bp组为86%，500 bp组为80%，200 bp组为30%，50 bp组约为1%。这些结果表明，至少500 bp的同源臂长度对于圆红冬孢酵母的高效HR是必要的，而1000 bp同源臂可提供最优的HR效率。
【数据】HR效率（CAR2）：1000 bp 95%、500 bp 88%、200 bp 35%、50 bp 2%；HR效率（ADE2）：1000 bp 75%、500 bp 70%、200 bp 22%、50 bp <1%；HR效率（URA3）：1000 bp 86%、500 bp 80%、200 bp 30%、50 bp ~1%；统计方法：单因素方差分析（n=3）
讨论与解读
在酵母中，Rad51和Rad52重组酶是同源依赖性修复的核心。本研究中，Rad51过表达对圆红冬孢酵母HR效率的提升贡献甚微，即使与其他HR相关蛋白共表达也是如此，表明内源Rad51并非该酵母HR的限速因素。相比之下，Rad52过表达显著增强了HR途径。HR相关蛋白的系统评估揭示了它们在圆红冬孢酵母中的不同作用。值得注意的是，ScRAD52、RtRAD54和ScSAE2的联合表达在不影响转化效率的情况下将HR效率提升至3.6%。这些结果进一步证明，担子菌酵母固有的低HR效率并非源于HR机制本身缺陷，而是DSB修复优先转向NHEJ途径所致。
抑制NHEJ途径是提高某些非常规酵母基因打靶效率的有效策略。然而，圆红冬孢酵母NP11中KU80缺失仅产生约5.3%的HR效率，且这些菌株表现出严重的DNA损伤敏感性和转化效率显著降低。当CRISPR-Cas9系统引入DSB时，HR效率急剧提升至16%，而ScRAD52的进一步过表达使多个基因座位的HR效率达到75–95%。这一发现表明，程序性DSB的引入与HR途径的强化之间存在协同效应，是突破圆红冬孢酵母HR瓶颈的关键。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于其系统性的策略递进——从单基因过表达到组合干预，再到CRISPR协同，每一步都有量化数据支撑，逻辑链条清晰完整。将KU敲除与ScRAD52过表达结合并辅以CRISPR介导的DSB，使HR效率从不足0.1%跃升至75–95%，这一跨越对产油酵母的合成生物学改造具有直接推动意义。值得注意的是，作者观察到多蛋白共表达可能因 stoichiometry 失衡而抑制HR效率，这一反面教训对其他真菌的基因编辑策略设计具有参考价值。局限在于KU缺失带来的转化效率下降和DNA损伤敏感性仍需进一步优化，未来若能实现NHEJ的可逆抑制或时空可控的HR激活，将更具应用前景。
参考来源
Chen Q, Lyu L, Wang S, Zhao ZK. Systematic evaluation of the DNA repair machinery facilitated the development of efficient genome editing tools for the red yeast Rhodotorula toruloides. Synth Syst Biotechnol. PMID: 42602684.
PMID: 42602684