来源：Whole-genome analysis and enzymatic profiling of Bacillus spizizenii as a xylanase-producing source from Iran.（Int Microbiol）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：CC BY-NC
导读
木聚糖酶是木质纤维素生物转化中的关键酶。本研究从伊朗26份环境样本中分离出18株细菌，筛选出两株高产木聚糖酶的菌株S3和S4，经分子鉴定为Bacillus spizizenii新变种。S3菌株在pH 9、40°C条件下酶活达11.56 U/mL，且在pH 4–9宽范围内保持活性；全基因组测序揭示了GH11和GH43家族的木聚糖酶基因，分子对接显示xynA1与木聚糖结合力最强（-9.4 kcal/mol）。两株菌展现出互补的工业应用潜力。
研究背景
木聚糖酶催化木聚糖水解，是自然界中仅次于纤维素的最丰富生物聚合物。木聚糖酶主要归属于糖苷水解酶GH10和GH11家族。GH10木聚糖酶具有(β/α)8桶状折叠结构，底物特异性广；GH11木聚糖酶则是高度特化的β-1,4内切木聚糖酶，底物特异性窄。尽管微生物木聚糖酶产生菌研究广泛，但发现具有增强酶活性的新本土菌株仍是重要挑战。本研究旨在从伊朗不同地区多样样本中系统分离和表征新型木聚糖酶产生菌株。
研究方法
样本采集与产木聚糖酶菌株分离
为筛选高潜力产木聚糖酶菌株，对从伊朗各地区采集的26份样本中纯化的微生物菌株进行了筛选实验。样本采集区域和类型基于前期研究及其蕴含产木聚糖酶微生物的潜力选定。样本采集于无菌管中，在4°C条件下运至实验室进行后续分析。
取每份样本1克，用生理盐水（0.9% NaCl）悬浮，随后在蒸馏水中连续稀释至10⁻⁵，并用涡旋振荡器充分混匀。取各稀释度100 µL涂布于LB琼脂平板上，37°C培养24小时。分离的细菌菌株随后接种于含山毛榉木聚糖（Sigma Aldrich, CAS: 9014-63-5）的选择性培养基上（配方：5 g蛋白胨、20 g琼脂、5 g NaCl、0.5 g MgSO₄、0.15 g CaCl₂、10 g木聚糖、500 mL无菌蒸馏水，pH 7），30°C培养48小时。培养结束后，平板用5 mL革兰氏碘液（2.0 g KI和1.0 g碘溶于300 mL蒸馏水）染色5分钟以显现透明圈，指示木聚糖降解。定性试验中木聚糖酶活性通过计算效能指数（PI）评估。
【数据】样本数：26份；稀释度：10⁻⁵；涂布量：100 µL；LB培养基培养：37°C、24h；选择性培养基：含10 g木聚糖、pH 7；培养条件：30°C、48h；革兰氏碘液：5 mL、染色5min
酶活性测定
在初筛中呈现最大透明圈的菌株被选入二次筛选及后续木聚糖酶活性测定。选定菌株在LB肉汤中培养，37°C、150 rpm连续振荡，分别培养24、48和72小时。培养结束后，培养物在12,000 × g、4°C离心20分钟，分离细胞与上清液。上清液收集后作为粗酶液用于后续分析。
木聚糖酶活性（U/mL）采用二硝基水杨酸（DNS）法定量测定，该方法测定木聚糖水解产生的还原糖量。测定时，500 µL粗酶液与1 mL 0.5%（w/v）木聚糖底物（溶于50 mM磷酸钠缓冲液，pH 6.0）混合。反应混合物在50°C孵育10分钟，随后加入3 mL DNS试剂终止反应。混合物在100°C煮沸5分钟以显色，随后冷却至室温。使用分光光度计在540 nm处测定吸光度。用已知浓度木糖（0.1–1.0 mg/mL）生成标准曲线，将吸光度值与还原糖释放量关联。一个木聚糖酶活性单位（U/mL）定义为在指定测定条件下（50°C，pH 6.0）每分钟释放1 µmol木糖所需的酶量。粗提物中酶浓度经调整以确保反应处于测定线性范围内，通常每反应使用0.1–0.5 U酶。所有测定均设三次重复以确保可重复性，结果取平均值确定最终木聚糖酶活性。
细菌生物量通过离心收集、冷冻干燥并称重，以确定干细胞重（mg/mL），用于酶活性归一化。每克细菌生物量的酶活性（U/g）先计算每毫升粗提物的活性（U/mL），再归一化至生物量浓度。每毫升活性的计算公式为：U/mL = (µmol木糖释放量 × 稀释因子) / (反应时间(min) × 酶体积(mL))。将U/mL值除以粗酶液中生物量浓度（mg/mL）并乘以1000，得到U/g：U/g = (U/mL) / (mg生物量/mL酶液) × 1000。
【数据】培养条件：37°C、150 rpm、24/48/72h；离心：12,000 × g、4°C、20min；底物：0.5%木聚糖、50 mM磷酸钠缓冲液pH 6.0；反应：50°C、10min；DNS：3 mL；煮沸：100°C、5min；检测波长：540 nm；木糖标准曲线：0.1–1.0 mg/mL；酶量：0.1–0.5 U/反应；重复：三次
酶的部分纯化、SDS-PAGE和酶谱分析
木聚糖酶采用冰上硫酸铵沉淀法进行部分纯化。首先，50 mL细菌培养上清液在持续搅拌下进行100%硫酸铵饱和处理。2小时后，蛋白质在8000 rpm、4°C离心20分钟沉淀，然后重悬于1 mL去离子水中。为进一步纯化酶并去除残留硫酸铵，使用透析袋——浓缩酶液用截留分子量12–14 kDa的纤维素膜（Sigma-Aldrich, #D9777）对去离子水透析。蛋白质沉淀溶液随后用于SDS-PAGE并评估酶活性。
SDS-PAGE采用12%凝胶，按标准方法进行。凝胶用考马斯亮蓝R-250染色以显现蛋白条带。过量染色通过含甲醇、冰醋酸和蒸馏水按1:1:8体积比配制的脱色液反复洗涤去除。纯化木聚糖酶的分子量通过将其电泳迁移率与蛋白质标记物（BIO-RAD Precision Plus Protein Dual Color Standards, 500 µL #1610374）的相对迁移率比较估算。
【数据】硫酸铵饱和度：100%；沉淀时间：2h；离心：8000 rpm、4°C、20min；重悬体积：1 mL；透析膜：12–14 kDa MWCO；SDS-PAGE凝胶：12%；脱色液比例：甲醇:冰醋酸:蒸馏水 = 1:1:8
木聚糖酶最适pH和温度的确定
pH和温度对木聚糖酶活性的影响通过裂区设计试验（三次重复）考察，部分纯化酶在pH 3–10范围的缓冲液中、40°C和50°C条件下分别孵育20、40和60分钟。另外还测试了更宽的温度范围，从20°C到90°C。简要操作：10 µL部分纯化酶加入一系列针对特定pH范围的缓冲液中：50 mM柠檬酸钠（pH 3.0–4.0）、50 mM醋酸钠（pH 4.0–5.5）、50 mM磷酸盐（pH 6.0–7.0）和50 mM Tris-HCl（pH 7.5–9.0），用NaOH调节至pH 10。酶活性随后在三个不同时间点评估，以考察pH和温度对木聚糖酶活性的影响。收集的数据使用SAS软件进行跨时间的双因素裂区设计分析。
【数据】pH范围：3–10；温度：40°C、50°C（另测20–90°C）；时间点：20、40、60min；酶量：10 µL；缓冲液：50 mM柠檬酸钠(pH 3.0–4.0)、50 mM醋酸钠(pH 4.0–5.5)、50 mM磷酸盐(pH 6.0–7.0)、50 mM Tris-HCl(pH 7.5–9.0)；pH 10用NaOH调节
动力学分析
初始反应速率（V₀）由孵育期间释放的还原糖量计算，对应产物形成的线性阶段。反应速率表示为mg mL⁻¹ min⁻¹。米氏动力学参数（Km和Vmax）通过米氏方程的非线性回归确定。Lineweaver–Burk图作为线性变换用于确认动力学参数。转换数（kcat）使用估算的Vmax值和酶摩尔浓度计算，假定分子量为23 kDa。催化效率以kcat/Km表示。
【数据】底物浓度范围：0.5–10 mg·mL⁻¹；假定分子量：23 kDa
研究结果
产木聚糖酶菌株的分离与鉴定
所有采集样本中的细菌菌株均经过初始定性筛选以评估木聚糖酶活性。在初步评估中，18株分离菌按PI排序，PI范围为1.00至4.1。值得注意的是，分离株S3、S4、S5、S13、S14和S16表现出高木聚糖酶活性，在木聚糖培养基上形成明显透明圈。PI超过1.5的分离株随后被选入木聚糖酶产量的定量分析（表1）。
表1 产木聚糖酶菌株分离的样本类型及对应区域
| 菌株 | 样本类型 | 省份 | 城市 |
|---|---|---|---|
| S1 | 泉水 | 恰哈马哈勒-巴赫蒂亚里 | 库朗 |
| S3 | 加瓦胡尼沼泽土壤 | 伊斯法罕 | 瓦尔扎内 |
| S4 | 沙漠土壤 | 伊斯法罕 | 卡尚 |
| S5 | 森林土壤 | 马赞达兰 | 诺沙赫尔 |
| S6 | 醋（20年陈） | 伊斯法罕 | 卡尚 |
| S10 | 羊粪 | 伊斯法罕 | 霍梅尼沙赫尔 |
| S11 | 酸面团 | 伊斯法罕 | 霍梅尼沙赫尔 |
| S12 | 鸡肠内容物 | 伊斯法罕 | 霍梅尼沙赫尔 |
| S13 | 鹰嘴豆田土壤 | 库尔德斯坦 | 戈尔韦 |
| S14 | 养鱼废水 | 伊拉姆 | 伊拉姆 |
| S16 | 麦田土壤 | 库尔德斯坦 | 戈尔韦 |
| S17 | 发酵工业废水 | 阿拉克 | 阿拉克 |
| S18 | 锡桑甘森林土壤 | 马赞达兰 | 诺沙赫尔 |
在后续定量分析中，各分离株在LB培养基中培养，然后使用标准化木聚糖酶活性测定法评估酶活性。结果表明，酶活性在培养后24小时达到峰值，超过48和72小时观察到的活性水平（图1）。在各分离株中，菌株S3和S4表现出最高的木聚糖酶活性，因此被确定为最有效的产酶菌株。
540 nm处的最高吸光度值S3为0.726，S4为0.658。粗酶液冻干后浓度S3为0.33 mg/mL，S4为0.29 mg/mL。基于木糖标准曲线，木聚糖酶活性估算为S3约11 U/mL、S4约10 U/mL，分别对应34,480 U/g和33,340 U/g。这些结果表明两株菌均产生高水平木聚糖酶，其中S3活性略高于S4。
【数据】PI范围：1.00–4.1；最高OD₅₄₀：S3=0.726、S4=0.658；冻干酶液浓度：S3=0.33 mg/mL、S4=0.29 mg/mL；酶活：S3≈11 U/mL（34,480 U/g）、S4≈10 U/mL（33,340 U/g）；峰值时间：24h
酶纯化与分子量
木聚糖酶通过硫酸铵沉淀法纯化。SDS-PAGE分析显示约22和25 kDa处有清晰条带（图S1），确定这是菌株S3和S4所产木聚糖酶的估算大小。
【数据】蛋白条带：约22 kDa和25 kDa
最适pH和温度的确定
木聚糖酶的稳定性和功能在变化的温度和pH条件下通过跨时间双因素裂区设计检验，在40°C和50°C下进行三次重复。菌株S3和S4因其在初步评估中的优异木聚糖酶活性而被选入本实验。比较性pH-活性谱揭示了菌株间不同的酶适应性（图2）。方差分析显示菌株、pH及其互作对木聚糖酶活性的影响高度显著（p < 0.01），时间互作在p < 0.10水平也显著（表S1–10）。
在40°C下，S3菌株在pH 9时活性最高（11.56 U/mL），并在宽pH范围（4–9）内保持稳定性能，凸显了其在需要pH适应性的工艺中的多功能性。相比之下，S4菌株在中性pH下表现出最佳活性（pH 7时为8.67 U/mL），但对酸性条件表现出显著敏感性（pH 4时为1.89 U/mL）。在50°C下（图2），S4菌株在热稳定性和活性方面超过S3，在pH 9时达到峰值性能（9.35 U/mL）。菌株S3在pH 6–9范围内保持稳健活性，但在此升高的温度下酸性条件下功能降低。商业VTR木聚糖酶在两种温度下均表现出一致但中等的活性，在碱性pH下具有最佳性能。
时间分析进一步揭示，在50°C下，S4菌株在40分钟后达到峰值活性（7.44 U/mL），展示了在长时间高温暴露下的稳健耐热性。总体而言，这些结果描绘了互补的工业潜力：S3菌株最适合需要宽范围pH适应性的应用，而S4菌株更适合高温碱性工艺。这种功能分化强调了针对特定工业应用进行菌株选择的价值。
【数据】40°C：S3最高活性pH 9=11.56 U/mL、pH 4–9稳定；S4最适pH 7=8.67 U/mL、pH 4=1.89 U/mL；50°C：S4峰值pH 9=9.35 U/mL；S4在50°C、40min=7.44 U/mL；显著性：p<0.01（菌株、pH及互作）、p<0.10（时间互作）
木聚糖酶活性与米氏动力学
菌株S3和S4的木聚糖酶在测试底物浓度范围（0.5–10 mg·mL⁻¹）内均表现出典型的米氏动力学。底物浓度增加导致初始反应速率（V₀）相应增加，直至达到饱和平台（图3）。菌株S4的木聚糖酶表现出略高的最大反应速率（Vmax = 1.50 mg·mL⁻¹·min⁻¹），而菌株S3为Vmax = 1.40 mg·mL⁻¹·min⁻¹。此外，S4的表观米氏常数（Km = 1.2 mg·mL⁻¹）低于S3（Km = 2.2 mg·mL⁻¹），表明S4酶具有更高的底物亲和力。
Lineweaver–Burk图（图4）确认了非线性回归获得的动力学参数。S4的木聚糖酶表现出比S3更低的斜率和更小的y截距，与其较高的Vmax和较低的Km值一致。在米氏图中（图3），点表示实验数据，拟合线表示非线性回归，水平虚线表示Vmax，大点表示Km值（即V₀ = Vmax/2处）。
【数据】底物浓度：0.5–10 mg·mL⁻¹；S4：Vmax=1.50 mg·mL⁻¹·min⁻¹、Km=1.2 mg·mL⁻¹；S3：Vmax=1.40 mg·mL⁻¹·min⁻¹、Km=2.2 mg·mL⁻¹
催化效率
S4木聚糖酶的转换数（kcat = 357 min⁻¹）高于S3（kcat = 293 min⁻¹）。因此，S4的催化效率（kcat/Km）约为S3的2.2倍，表明其具有更优的底物利用能力和整体催化性能。
【数据】kcat：S4=357 min⁻¹、S3=293 min⁻¹；催化效率倍数：S4约为S3的2.2倍
最强菌株的形态学与分子学特征
菌落形态学评估揭示了S3和S4菌株的独特特征。S3菌株呈现不规则形状菌落，奶油色，边缘卷曲，隆起扁平。相比之下，S4菌株形成圆形菌落，同样呈奶油色但中心区域颜色较深。S4菌落边缘整齐，隆起同样扁平，呈现光滑均匀的外观。
为进一步评估分离菌的形态学特征并确保菌落纯度，进行了革兰氏染色。显微镜检查表明两株筛选菌均为革兰氏阳性、杆状。革兰氏阳性菌显示厚肽聚糖层和较低的膜脂质含量，显微镜下呈紫色。
对于分离菌的分子鉴定，对rpoB和16S rRNA基因片段进行测序，并针对NCBI核苷酸数据库进行BLAST分析。选择rpoB基因与16S rRNA基因联合用于芽孢杆菌属菌株的鉴定。
基于rpoB和16S rRNA基因串联序列的最大似然系统发育树（图5）显示，菌株S3和S4与Bacillus spizizenii聚为一支。全基因组系统发育树（图6）进一步确认了菌株S3与Bacillus spizizenii的进化关系。
全基因组分析与生物合成基因簇
使用antiSMASH v7.0对B. spizizenii S3基因组进行分析，鉴定出多个推定的生物合成基因簇（BGC）（图7）。这些BGC编码多种次级代谢产物合成途径，百分比表示各簇与MIBiG数据库中已知BGC的相似度。
分子对接分析
对B. spizizenii S3中鉴定的三个木聚糖酶基因（xynA1、xynA2和xynB）与配体（木聚糖、α-D-吡喃木糖和β-D-吡喃木糖）进行了分子相互作用分析（图8）。结合位点的详细视图显示了底物与参与相互作用并形成氢键的氨基酸残基。其中xynA1（GH11家族）与木聚糖的相互作用最强，结合能为-9.4 kcal/mol。
【数据】xynA1与木聚糖结合能：-9.4 kcal/mol；木聚糖酶基因：xynA1、xynA2（GH11家族）、xynB（GH43家族）
讨论与解读
本研究从伊朗多样化环境样本中成功分离并表征了高产木聚糖酶的菌株S3和S4。两株菌的木聚糖酶在碱性pH（pH 9）和升高温度（S3为40°C、S4为50°C）下表现出最佳活性。S3菌株在pH 4至9宽范围内维持显著酶功能，这一特性在细菌来源木聚糖酶中并不常见。宽pH耐受性对工业应用尤为重要——许多工业过程在变化pH条件下运行，而传统木聚糖酶在此类条件下常表现出活性与稳定性下降。
两株菌展现出互补的工业应用潜力：S3适合需要宽范围pH适应性的工艺，S4更适合高温碱性过程。全基因组测序揭示了GH11和GH43家族的木聚糖酶基因，分子对接和动力学参数为酶工程改造提供了遗传基础。
编译者解读：该研究从菌株筛选到全基因组分析再到分子对接，构建了完整的"发现—表征—机制"链条。S3菌株的宽pH适应性和S4的高温碱性适应性形成天然互补，为工业场景提供了可直接选用的菌株资源。动力学与对接数据的结合为后续理性酶工程改造提供了明确的靶点信息。局限在于部分纯化的酶制剂可能掩盖了粗酶体系中其他辅助蛋白的协同效应，后续可考虑对单一木聚糖酶基因进行异源表达以精确解析各同工酶的独立贡献。
参考来源
Bigdeli H, Soorni A, Sedghi M, et al. Whole-genome analysis and enzymatic profiling of Bacillus spizizenii as a xylanase-producing source from Iran. Int Microbiol. PMID: 42026363. DOI: 10.1007/s10123-026-00831-2.
PMID: 42026363