来源：Unlocking raw-corncob consolidated bioprocessing for malic acid production by DyP-enabled lignin deconstruction in Myceliophthora thermophila.（Synth Syst Biotechnol）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：CC BY-NC
导读
木质纤维素是丰富的可再生碳源，但其天然抗降解屏障使整合生物加工（CBP）效率受限。本研究以嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila）为底盘，通过转录组学锁定木质素降解为关键瓶颈，过表达染料脱色过氧化物酶（DyP）强化木质素氧化重构，同时改造纤维二糖转运与磷酸化代谢，最终在5-L生物反应器中实现157.6 g/L苹果酸产量，为农业废弃物直接转化为有机酸提供了更简化的路线。
研究背景
木质纤维素生物质是丰富的可再生碳源，可减少对化石资源的依赖。代谢工程与工业生物技术的进步加速了微生物平台将可再生原料转化为高价值产品，但规模化经济部署仍高度依赖工艺简化、稳健性和原料到产品的转化效率。
整合生物加工（CBP）将酶生产、多糖糖化和微生物发酵整合于单一反应器，与多步水解-发酵流程相比，避免了外部酶添加并简化了单元操作。然而，未经预处理的原料中，生物质顽抗性使CBP面临巨大挑战——高效解聚与同化必须在复杂的细胞外基质中持续进行。木质素作为复杂酚类聚合物，被认为是限制纤维素酶可及性的主要屏障，但具体瓶颈环节尚缺乏系统解析。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
Myceliophthora thermophila MS917（原名MS916OE_MtJen）及其突变株在含2%葡萄糖的Vogel最低培养基（VMM）上、35°C培养12天以产生成熟分生孢子。根据需要添加抗生素用于转化子筛选。Escherichia coli DH5α用于质粒构建与扩增，在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养，添加卡那霉素（50 μg/mL）或氨苄青霉素（100 μg/mL）进行质粒筛选。
【数据】菌株：M. thermophila MS917及突变株；培养基：VMM含2%葡萄糖；温度：35°C；时间：12天；E. coli DH5α培养温度：37°C；抗生素：卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL
2.2 质粒构建与菌株工程改造
为构建目标基因过表达质粒，采用pgk（Mycth_2316240）强组成型启动子高效过表达木质素降解酶基因。从M. thermophila基因组PCR扩增漆酶基因lac1（Mycth_75296）、lac2（Mycth_51627）和染料脱色过氧化物酶基因DyP（Mycth_2111272）的片段，插入pAN52-PgpdA-bar质粒的BglII和BamHI位点之间，置于pgk启动子控制下，生成相应质粒Ppgk-lac1-bar、Ppgk-lac2-bar和Ppgk-DyP-bar。
来自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）基因组DNA的纤维二糖转运蛋白基因（cdt-1，NCU00801）使用NEB Gibson组装试剂盒连接至pAN52-PtrpC-neo-PMtgpdA质粒的SpeI/BamHI位点，形成cdt-1过表达质粒PgpdA-cdt1-neo。类似地，来自嗜热梭菌（Clostridium thermocellum）的密码子优化纤维二糖磷酸化酶基因Ctcpp（GenBank No. AB013109）置于eif（Mycth_2297659）强组成型启动子控制下，插入pAN52-PtrpC-neo-PMtgpdA的BglII和BamHI位点之间，生成载体Peif-Ctcpp-neo。
M. thermophila原生质体的PEG介导转化按此前描述方法进行。基因过表达时，将10 μg目标基因表达PCR片段转化至M. thermophila原生质体。推定转化子使用适当抗生素筛选，并通过PCR和DNA测序确认。携带bar或neo基因质粒的转化子分别使用草铵膦（100 μg/mL）或遗传霉素（80 μg/mL）筛选。
【数据】启动子：pgk（Mycth_2316240）、eif（Mycth_2297659）；转化DNA量：10 μg；筛选抗生素：草铵膦100 μg/mL、遗传霉素80 μg/mL；基因：lac1（Mycth_75296）、lac2（Mycth_51627）、DyP（Mycth_2111272）、cdt-1（NCU00801）、Ctcpp（AB013109）
2.3 摇瓶苹果酸生产
M. thermophila的苹果酸生产在250 mL锥形瓶中进行，含50 mL培养基，孢子接种量为2.5 × 10⁵孢子/mL。培养条件为45°C、150 rpm旋转摇床。培养基组成：75 g/L粉碎玉米芯、0.15 g/L KH₂PO₄、0.15 g/L K₂HPO₄、0.1 g/L MgSO₄·7H₂O、0.1 g/L CaCl₂·2H₂O、8 g/L Bacto蛋白胨、0.1 mg/L生物素、1 mL Vogel盐溶液微量元素，经高压灭菌。灭菌后加入CaCO₃至终浓度80 g/L。
【数据】培养基体积：50 mL/250 mL锥形瓶；接种量：2.5 × 10⁵孢子/mL；温度：45°C；转速：150 rpm；玉米芯：75 g/L；CaCO₃：80 g/L；KH₂PO₄：0.15 g/L；K₂HPO₄：0.15 g/L；MgSO₄·7H₂O：0.1 g/L；CaCl₂·2H₂O：0.1 g/L；Bacto蛋白胨：8 g/L；生物素：0.1 mg/L
2.4 5-L生物反应器补料分批发酵
补料分批发酵在5-L生物反应器（宝兴生物工程有限公司，中国）中进行，培养基体积3.3 L。发酵罐以10%（v/v）终工作体积的种子培养物接种。种子培养在1-L锥形瓶中进行，含300 mL培养基，45°C、150 rpm培养28 h。
生物反应器初始培养基组成（每升）：50 g粉碎玉米芯、0.15 g KH₂PO₄、0.15 g K₂HPO₄、0.1 g MgSO₄·7H₂O、0.1 g/L CaCl₂·2H₂O、15 g/L豆粕、1 mL生物素（0.1 g/L）、1 mL Vogel盐微量元素，经高压灭菌。随后添加灭菌CaCO₃维持pH约6.0。发酵温度控制在45°C。通气量维持在0.5 vvm，搅拌自动调节以维持溶解氧（DO）在30%。
发酵过程中，分批次补加灭菌粉碎生玉米芯。具体为：24 h、40 h、48 h、64 h和72 h各添加120 g玉米芯，86 h最终添加135 g玉米芯。因此，包括初始165 g玉米芯和后续补加的735 g玉米芯，整个发酵过程玉米芯总投入为900 g。当DO升至50%以上时判定发酵终点，表明氧摄取和底物转化活性显著下降。按设定时间间隔取样分析。
【数据】反应器：5-L；工作体积：3.3 L；接种比例：10%（v/v）；种子培养：300 mL/1-L瓶、45°C、150 rpm、28 h；初始玉米芯：50 g/L；豆粕：15 g/L；pH：约6.0（CaCO₃调节）；温度：45°C；通气：0.5 vvm；DO：30%；补料方案：24/40/48/64/72 h各120 g、86 h加135 g；总玉米芯投入：900 g（初始165 g + 补加735 g）；终点判定：DO > 50%
2.5 代谢物分析
为测定培养液中的苹果酸滴度，取1 mL充分混匀的样品于15-mL管中，加入1 mL 2 M硫酸。混合物在80°C孵育30 min，间歇涡旋以充分溶解苹果酸钙和残余碳酸钙。随后加入2 mL蒸馏水，取等分试样通过高效液相色谱（HPLC）测定，使用配备Aminex HPX-87H色谱柱（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）的仪器（e2695；Waters，Manchester，英国），柱温35°C，Waters 2489 UV检测器波长210 nm；流动相为5 mM H₂SO₄，恒定流速0.5 mL/min。
【数据】硫酸：2 M、1 mL；孵育：80°C、30 min；HPLC柱：Aminex HPX-87H；柱温：35°C；检测波长：210 nm；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.5 mL/min
2.6 *M. thermophila*培养液中酶活测定
测定木质纤维素酶活性时，将M. thermophila菌株接种至以75 g/L玉米芯为唯一碳源的苹果酸生产培养基中培养3天。为测定胞外酶活性，取1 mL培养液离心（14,000 rpm，10 min，4°C），保留各样品上清液。为保护蛋白质免受蛋白酶降解，向样品中加入PMSF（终浓度1 mM）。
β-葡萄糖苷酶活性（PNPGase）测定以4-硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物。所有试剂在45°C预热5 min，然后向200 μL上清液中加入200 μL 1 mg/mL PNPG，溶液在45°C孵育10 min。加入500 μL 1 M Na₂CO₃终止反应。混合物离心（12,000 rpm，3 min，4°C），测定上清液在420 nm处的吸光度。外切葡聚糖酶（PNPCase）活性使用对硝基苯基β-D-纤维二糖苷为底物测定。一个酶活单位（U）定义为在45°C、pH 4.8条件下，以PNPG或PNPC为底物每分钟催化形成1 μmol对硝基苯酚（pNP）所需的酶量。
染料脱色过氧化物酶DyP活性在100 mM醋酸钠（pH 4.5）、2 mM ABTS、0.5 mM H₂O₂、45°C条件下测定。酶活性基于420 nm处吸光度增加速率（ABTS，ε₄₂₀ₙₘ = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹）计算，使用Spectramax ID3酶标仪（Molecular Devices，CA，USA）。一个酶活单位（U）定义为每分钟还原1 μmol底物所需的酶量。
内切葡聚糖酶和内切-1,4-β-木聚糖酶活性分别使用Azo-CM-Cellulose测定试剂盒（Megazyme，Wicklow，爱尔兰）和Azo-Xylan试剂盒（Megazyme）测定。
【数据】培养时间：3天；离心：14,000 rpm、10 min、4°C；PMSF：1 mM；PNPG：1 mg/mL、200 μL；反应：45°C、10 min；终止液：1 M Na₂CO₃ 500 μL；检测波长：420 nm；PNPCase底物：pNPC；酶活单位定义：1 μmol pNP/min（45°C、pH 4.8）；DyP测定：100 mM醋酸钠pH 4.5、2 mM ABTS、0.5 mM H₂O₂、45°C；ε₄₂₀ₙₘ = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹
2.7 玉米芯酶解
M. thermophila在含75 g/L玉米芯的苹果酸生产培养基中培养3天以诱导木质纤维素酶产生。上清液蛋白浓度使用Bio-Rad Protein Assay试剂盒测定（595 nm吸光度，Bio-Rad，Hercules，CA，USA）。玉米芯水解反应体系包括浓缩培养液（50 μg蛋白）、2%玉米芯、1 μg/mL叠氮化钠，溶于1 mL Tris-HCl缓冲液（10 mM，pH 5.6），并添加或不添加商业漆酶。混合物在45°C、150 rpm振荡孵育24 h，然后离心（14,000 rpm，15 min，4°C）。上清液经0.22 μm滤膜过滤后用HPLC系统分析。
【数据】诱导培养：75 g/L玉米芯、3天；蛋白定量：Bio-Rad Protein Assay、595 nm；水解体系：50 μg蛋白、2%玉米芯、1 μg/mL叠氮化钠、1 mL Tris-HCl（10 mM，pH 5.6）；温度：45°C；时间：24 h；转速：150 rpm；离心：14,000 rpm、15 min、4°C；滤膜：0.22 μm
2.8 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析
预测的染料脱色过氧化物酶DyP（Mycth_2111272）融合6×His标签后导入M. thermophila，DyP按此前描述方法进一步纯化。过氧化氢和还原底物的动力学参数（kcat和Km）通过测定酶活性进行评估。
【数据】DyP：Mycth_2111272，6×His标签；动力学参数：kcat、Km（原文未详述具体数值）
研究结果
3.1 木质素解聚是生玉米芯CBP的关键瓶颈
为鉴定生玉米芯整合生物加工（CBP）的限速步骤，我们对苹果酸生产菌株M. thermophila MS917在75 g/L生玉米芯上的培养进行了时间分辨转录组学分析。层次聚类分析显示，编码核心纤维素分解机制的基因——包括内切葡聚糖酶（EGLs）、外切葡聚糖酶（EXGLs）、裂解性多糖单加氧酶（LPMOs）、纤维二糖脱氢酶（CDHs）和β-葡萄糖苷酶（BGLs）——在整个发酵过程中被强烈诱导，大多数在第2至4天达到峰值表达（图1A和补充表S2）。类似地，半纤维素酶编码基因，特别是木聚糖酶（XLNs）和β-木糖苷酶（BXLs），在所有时间点均表现出持续的高水平表达（图1B和补充表S3）。这些表达模式表明菌株MS917在测试的CBP条件下对多糖解聚建立了强大的转录响应。
与糖苷水解酶系统形成鲜明对比的是，编码推定木质素降解酶的基因表现出明显较弱的转录响应（图1C和补充表S4）。M. thermophila基因组编码六个预测的木质素降解酶基因，包括五个漆酶和一个预测的染料脱色过氧化物酶（DyP）。在这六个预测的木质素降解酶基因中，预测的DyP基因（Mycth_2111272）在整个时间过程中仅表现出微弱的转录诱导，不在生玉米芯CBP条件下显著诱导的木质素降解基因之列。相比之下，几个漆酶基因表现出可检测的转录响应，其中两个漆酶（Mycth_75196和Mycth_99853）在早期阶段被诱导，一个漆酶（Mycth_51627）在过程后期表现出较高表达（图1C）。这种强纤维素/半纤维素诱导与弱木质素降解诱导之间的不对称性表明，天然木质素氧化能力可能不足以支持生生物质的高效CBP。
为测试增强木质素降解能力是否能改善碳水化合物的可及性，我们使用MS917培养物的粗酶制剂进行了体外水解实验。当向含2%玉米芯和50 μg MS917培养滤液蛋白的反应体系中添加商业漆酶时，与无漆酶对照相比，葡萄糖和木糖释放均显著增加（图1D）。葡萄糖释放提高约35%，木糖释放增加28%。这些结果表明木质素作为物理和/或生化屏障限制多糖可及性，增强木质素氧化可从生玉米芯中释放额外的可发酵糖。
【数据】玉米芯浓度：75 g/L；葡萄糖释放提升：约35%；木糖释放提升：28%；水解体系：50 μg蛋白、2%玉米芯、45°C、24 h；显著性：P < 0.001
3.2 强化木质素解聚改善生玉米芯CBP性能
为测试强化木质素侧解聚是否能改善生玉米芯的苹果酸CBP，三个木质素降解酶——包括两个漆酶（Mycth_75296、Mycth_51627）和一个预测的DyP（Mycth_2111272）——分别在菌株MS917中过表达，产生菌株YZ296、YZ627和YZ272。当这些菌株在75 g/L玉米芯上培养时，过表达DyP的菌株YZ272在第3天产生36 g/L苹果酸，第6天产生47.9 g/L苹果酸，分别比MS917在第3天和第6天提高33%和30%，同时菌丝生物量维持在与亲本菌株相当的水平（图2）。残留固体中木质素含量降低达61.5%，而亲本菌株MS917为26%（图2B）。
值得注意的是，漆酶过表达在我们的菌株panel中未产生与DyP相同的效益特征（图2A-C）。相反，过表达漆酶的菌株YZ627表现出明显的生长惩罚，干菌丝体重减少38%。这些结果确定DyP过表达是在测试条件下改善生玉米芯CBP性能的有效木质素侧干预措施。
【数据】YZ272苹果酸产量：36 g/L（3天）、47.9 g/L（6天）；提升幅度：33%（3天）、30%（6天）；木质素含量降低：YZ272为61.5%、MS917为26%；YZ627干菌丝体重减少：38%
3.3 木质素侧氧化重构增强生玉米芯胞外糖化能力
为评估预测的DyP是否具有氧化能力并能促进生物质残渣重构，我们从M. thermophila中纯化了该酶并检测其针对生玉米芯的活性。纯化的DyP在H₂O₂存在下表现出可测量的ABTS氧化活性，支持其作为分泌型氧化酶的生化能力（补充表S1）。FTIR分析显示，与缓冲液对照相比，DyP + H₂O₂处理仅引起有限的谱图变化。添加ABTS或无酶过滤发酵液的DyP反应体系在特征性木质素相关谱带处诱导了更明显的变化，特别是在约1600 cm⁻¹和1510 cm⁻¹附近，这两个谱带通常分别归属于芳香骨架振动和芳香环伸缩。与愈创木基型木质素结构中C–O伸缩相关的1260 cm⁻¹附近信号也发生了改变（图3A）。在这些变化中，1510 cm⁻¹附近的降低尤为明显，支持处理过的玉米芯残渣中芳香族木质素结构发生了实质性修饰。这些结果表明DyP依赖性氧化重构可以改变天然玉米芯残渣中的木质素相关结构。
【数据】FTIR特征谱带：1600 cm⁻¹（芳香骨架振动）、1510 cm⁻¹（芳香环伸缩）、1260 cm⁻¹（愈创木基C–O伸缩）；DyP底物：ABTS、H₂O₂
3.4 木质素衍生芳香族化合物的时间分辨分析
【数据】培养时间点：2天、6天；分析方法：UHPLC-MS/MS；培养基：苹果酸生产培养基含生玉米芯
3.5 菌株YZ272在木质素衍生组分上的生长表现
【数据】培养基：50 mL VMM；木质素衍生组分浓度：0.5 g/L；温度：45°C
3.6 通过改善纤维素利用增强苹果酸生产
【数据】玉米芯：75 g/L；培养时间：6天；显著性阈值：P < 0.05、P < 0.01、P < 0.001
3.7 5-L生物反应器放大生产
【数据】反应器规模：5-L；苹果酸产量：157.6 g/L；生产速率：1.17 g/L/h；产率：0.55 g/g总玉米芯投入；产品纯度：99%
讨论与解读
本研究通过同时解决木质素侧（顽抗性）和糖侧（同化）约束，推进了嗜热真菌CBP从生木质纤维素生物质生产苹果酸的进程。CBP的吸引力在于将酶生产、多糖解聚和发酵整合于单一反应器，与多步水解-发酵方案相比可减少单元操作和外部酶投入。在此概念基础上，研究证明改善木质素解聚是提高生玉米芯苹果酸CBP性能的决定性杠杆，并鉴定出DyP型血红素过氧化物酶为高影响力木质素降解模块。此外，强化纤维二糖转化进一步改善了碳水化合物利用和苹果酸生产。最终工程菌株在5-L生物反应器中实现了一步法高产苹果酸生产，证明了在整合型嗜热CBP平台中偶联木质素氧化与高效碳水化合物同化的可行性。
数据支持木质素相关顽抗性是该系统的真实瓶颈。DyP过表达菌株改善的CBP表型、选定的胞外水解酶活性增加以及玉米芯残渣的FTIR变化均指向同一方向。然而，漆酶与DyP过表达的对比结果提示木质素降解强化具有酶依赖性。
编译者解读：该研究的亮点在于将"木质素降解"从辅助策略提升为核心工程靶点——通过转录组学精准定位瓶颈，再以单个DyP酶过表达实现61.5%的木质素去除率，策略简洁而高效。值得注意的是，漆酶过表达反而造成38%的生物量损失，警示木质素降解酶并非"越多越好"，其作用机制和底物偏好性需审慎评估。从合成生物学应用角度看，该工作展示了"组学引导-靶点验证-模块强化-放大验证"的完整闭环，157.6 g/L的产量和0.55 g/g的产率已具备工业竞争力。局限在于木质素降解产物对菌株生长和代谢的具体影响机制尚未完全阐明，后续可结合适应性进化或动态调控策略进一步优化。
参考来源
Zhang Y, Zhang Y, Han L, Liu J, Liu D. Unlocking raw-corncob consolidated bioprocessing for malic acid production by DyP-enabled lignin deconstruction in Myceliophthora thermophila. Synth Syst Biotechnol. PMID: 42604004.
PMID: 42604004