来源：Effects of microbial inoculants, cellulase, and sodium diacetate on fermentation profiles, bacterial succession, and predicted functional profiles of alfalfa silage.（Bioresour Bioprocess）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：CC BY
导读
紫花苜蓿蛋白含量高，却因可溶性碳水化合物不足、缓冲容量大而难以青贮。本研究系统对比了五种微生物接种剂、纤维素酶和双乙酸钠对苜蓿青贮发酵质量、菌群演替及代谢功能的影响。60天发酵后，KL接种剂和双乙酸钠表现最优——前者将乳酸菌丰度推至78.23%，后者将pH降至4.28、氨态氮降至总氮的3.72%。研究揭示不同添加剂通过截然不同的微生物机制驱动发酵走向。
研究背景
韩国饲草自给率虽达约78%，但水稻秸秆占比过高，优质粗饲料仅占约30%。紫花苜蓿作为优质豆科牧草，占韩国进口饲草的约16%，且需求预计以年均2.3%的速度增长。然而，苜蓿青贮面临天然障碍：可溶性碳水化合物含量低、缓冲容量高、收获时含水量偏高，这些特性易引发不良发酵，导致厌氧腐败、蛋白质过度降解和酸败气味。微生物、酶或化学添加剂可有效改善这一局面，但不同添加剂的作用机制尚缺乏系统对比。
研究方法
牧草栽培与青贮制作
紫花苜蓿于2022年9月在首尔大学平昌校区的实验田种植。2023年6月盛花期收获第一茬苜蓿，田间萎蔫24小时。萎蔫后的苜蓿用饲草切割机（SC-7000，Agricultural Machinery, Inc.，韩国）切碎至2–3厘米。切碎的苜蓿混合均匀后，随机分为八等份，分别添加不同添加剂。根据Zheng等（2020）提出的新分类系统，Lactobacillus plantarum和Lactobacillus buchneri分别更名为Lactiplantibacillus plantarum和Lentilactobacillus buchneri，而Lactobacillus acidophilus和Lactobacillus bulgaricus仍保留在Lactobacillus属内。
对照组喷洒蒸馏水（Control）。五种微生物接种剂分别均匀喷洒于苜蓿上，接种量为每克萎蔫苜蓿1 × 10⁶ CFU：
- LP（Cheongmi Bio Co., Ltd.，韩国）：Lactiplantibacillus plantarum，1.5 × 10¹⁰ CFU/g
- TS（Jungnong Bio Co., Ltd.，韩国）：Lactiplantibacillus plantarum + Pediococcus pentosaceus，1 × 10¹⁰ CFU/g
- SK（Agri-King, Inc.，美国）：Lactiplantibacillus plantarum + Pediococcus pentosaceus + Enterococcus faecium，2.5 × 10¹⁰ CFU/g
- KL（Kemin Industries, Inc.，美国）：Lactiplantibacillus plantarum + Lactobacillus acidophilus + Lactobacillus bulgaricus，5.5 × 10¹⁰ CFU/g
- BSM（Provita Supplements GmbH，德国）：Lactiplantibacillus plantarum + Pediococcus pentosaceus + Lentilactobacillus buchneri，2.5 × 10¹¹ CFU/g
木霉纤维素酶（C1794-10KU，6.3 units/mg固体，Sigma-Aldrich，美国）以100 mg/kg的剂量接种于苜蓿（CELL）。双乙酸钠（99%，上海罗恩化学技术有限公司，中国）按6 g/kg萎蔫重量的比例施加（SDA）。
约400克处理后的苜蓿装入塑料真空袋，用真空封口机（GOV-4040，Gaonpack Co.，韩国）密封。共制备168个青贮袋，八个处理组每组21袋。袋子随机分配，整个青贮期间在室温（约27°C）下储存。采用破坏性取样设计，每组随机取3袋，分别在青贮后第1、3、5、7、14、30和60天开封，进行发酵特性和化学成分分析。此外，新鲜苜蓿（第0天）和青贮60天后的样品进行16S rRNA基因测序的细菌群落分析。
【数据】切割长度：2–3 cm；萎蔫时间：24h；接种量：1 × 10⁶ CFU/g；纤维素酶剂量：100 mg/kg；双乙酸钠剂量：6 g/kg；每袋装料：约400 g；储存温度：约27°C；取样时间点：1、3、5、7、14、30、60天；总袋数：168袋
化学成分与发酵特性分析
干物质（DM）含量按Li等（2022）的方法分析，以鲜物质为基准表示。粗蛋白（CP）含量采用元素分析仪（Euro Vector EA3000，EVISA，意大利），基于Simonne等（1997）建议的改良杜马斯燃烧法测定。中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）按Van Soest等（1991）的方法，用Ankom2000纤维分析仪（Ankom Technology Corp.，美国）顺序测定。NDF分析中使用了亚硫酸钠和α-淀粉酶。ADF测定后，酸性洗涤木质素（ADL）用72%硫酸在烧杯中消化残渣3小时进行评价。蒽酮-硫酸法用于分析水溶性碳水化合物（WSC）含量。干物质回收率（DMR）和气体损失（GL）按Gheller等（2021）的方法计算。
取10克样品与90克蒸馏水混合，室温振荡1小时，4°C过夜保存。提取液经四层纱布过滤，再用Whatman No. 1滤纸过滤。pH值立即用校准的数字pH计（AB150，Fisher Scientific International，美国）测定。氨态氮（NH₃-N）采用苯酚-次氯酸盐法，用UVIDEC-610分光光度计（Jasco，日本）测定，以总氮的百分比表示。有机酸浓度（乳酸、乙酸、丙酸、丁酸）用高效液相色谱系统（Agilent Technologies 1260 Infinity，美国）定量，配备示差折光检测器和Agilent Hi-Plex H色谱柱。流动相为0.005 N H₂SO₄，流速0.7 mL/min，柱温60°C。CP、NDF、ADF、ADL、WSC和有机酸浓度均以干物质为基础表示。
【数据】样品量：10g；蒸馏水量：90g；振荡时间：1h；保存条件：4°C过夜；HPLC流动相：0.005 N H₂SO₄；流速：0.7 mL/min；柱温：60°C；ADL消化：72%硫酸、3h
微生物群落分析——DNA提取与PCR扩增
总基因组DNA按Ali等（2020）描述的方法，使用FastDNA Kit for Soil（MP Biomedicals，美国）提取，严格按制造商说明操作。提取DNA的量和质量分别用NanoDrop NC2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）和琼脂糖凝胶电泳检测。细菌16S rRNA基因V3–V4区PCR扩增使用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。热循环条件为：98°C初始变性5分钟，随后25个循环——98°C变性30秒、53°C退火30秒、72°C延伸45秒，最后72°C终延伸5分钟。
【数据】引物：338F/806R；初始变性：98°C、5min；循环数：25；变性：98°C、30s；退火：53°C、30s；延伸：72°C、45s；终延伸：72°C、5min
测序与数据分析
基因组测序在Illumina NovaSeq平台上完成。原始序列数据用demux插件进行拆分，随后用cutadapt插件切除引物。之后用DADA2插件进行质量过滤、降噪和嵌合体去除。所得序列以100%序列相似度聚类，生成扩增子序列变异体（ASVs）和丰度表。扩增子测序数据获得的属级分类注释用于微生物群落分析，其中Lactiplantibacillus、Lentilactobacillus和Lactobacillus被视为不同属。所有下游数据分析使用QIIME2（版本2024.5）和R软件（版本4.3.3）完成。微生物群落的代谢功能通过PICRUSt2基于MetaCyc和KEGG数据库进行预测。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq；序列聚类相似度：100%；分析软件：QIIME2 2024.5、R 4.3.3；功能预测：PICRUSt2（MetaCyc + KEGG）
统计分析
化学成分和发酵数据使用SPSS（IBM SPSS Statistics for Windows，Version 29.0）中的一般线性模型程序分析。添加剂处理、青贮天数及其交互效应采用双因素方差分析模型，公式为：Yijk = μ + Ti + Dj + (T × D)ij + εijk，其中Yijk为观测值，μ为平均值，Ti为处理（添加剂）效应，Dj为青贮天数，T × D为处理与天数的交互效应，εijk为误差项。每个青贮袋被视为独立实验单元。残差正态性和方差齐性分别用Shapiro–Wilk检验和Levene检验评估。当ANOVA检测到显著主效应或交互效应时，用Duncan多重范围检验进行均值分离。差异显著性水平设定为p < 0.05。
【数据】统计软件：SPSS 29.0；模型：双因素ANOVA；正态性检验：Shapiro–Wilk；方差齐性：Levene；多重比较：Duncan；显著性水平：p < 0.05
研究结果
青贮前苜蓿的化学成分
青贮前，苜蓿DM含量为35.01%，处于推荐的30–40%范围内。NDF、ADF和CP分别为50.42%、33.37%和18.46% DM。本实验中WSC含量（5.98% DM）仅略高于正常发酵所需的最低阈值5% DM，提示存在不良发酵的潜在风险。
【数据】DM：35.01%；NDF：50.42% DM；ADF：33.37% DM；CP：18.46% DM；WSC：5.98% DM
青贮过程中苜蓿的化学特性
添加剂、青贮天数及其交互作用对DM、DMR、GL和CP水平有显著影响（表1）。所有组的DM含量随青贮天数延长呈下降趋势，这可能归因于青贮过程中有机物损失和气体产生（p < 0.05）。KL、LP或SDA处理的苜蓿DMR显著高于对照组（p < 0.05），而BSM接种的苜蓿与对照组无差异。虽然研究表明LAB接种能够显著提高苜蓿和其他饲草的DMR，但具体效果取决于LAB接种类型。Mu等（2020）报道L. plantarum组能提高苋菜与水稻秸秆混合青贮的DMR，与本研究结果一致。
此外，KL和SDA的气体损失较低，SDA在整个青贮过程中始终保持最高的DM含量（p < 0.05）。这可能是因为SDA易于电离产生乙酸，立即酸化饲草生物质，从而抑制发酵早期不良细菌的生长和活性，最大限度地减少青贮过程中的营养损失和气体产生。最严重的DM或GL通常由梭菌引起——梭菌将乳酸或糖转化为丁酸以及CO₂、H₂和NH₃，导致51%的DM损失。但本研究中未检出丁酸，因此可以断定梭菌发酵有限或无法检测到。好氧细菌代谢可溶性碳水化合物和乳酸产生CO₂，但发酵早期pH的快速下降抑制了其生长和活性。此外，异型发酵利用乳酸或糖产生乙酸和CO₂。因此可以推断，GL可能主要由CO₂产生引起。Kung等（2003）证明青贮中的CO₂产生受添加剂影响。本实验发现所有处理组均能显著减少GL（p < 0.05），这主要归因于对CO₂产生的抑制。BSM的GL高于TS和SK，DMR低于TS和SK（p < 0.05），提示含L. buchneri的配方可能更容易发生气体和干物质损失——推测是由于青贮后期异型发酵所致。KL处理在青贮期间的GL显著低于LP、SK和TS组，表明L. plantarum、L. acidophilus和L. bulgaricus的组合在减少气体产生方面更有效，可能是由于它们的协同效应。这归因于三种LAB菌株之间一致的代谢途径，更有利于维持高效的单向碳流向乳酸，从而实现快速酸化，减少糖或乳酸氧化为CO₂、H₂或其他挥发性产物。SK、TS和KL组的CP水平在青贮期间没有明显变化，表明发酵成功保存了蛋白质，这归因于pH的急剧下降。然而，CELL和BSM组由于pH下降较慢，CP下降趋势大于其他处理。到第60天，所有添加剂的CP含量均显著高于对照组（p < 0.05），表明添加剂优化了蛋白质保存。
【数据】对照组DMR（第60天）：85.43%；KL组DMR（第60天）：88.37%；SDA组DMR（第60天）：89.16%；BSM组GL（第60天）：0.63%；KL组GL（第60天）：0.31%；SDA组GL（第60天）：0.25%；梭菌致DM损失：51%
虽然已有研究报道L. plantarum + P. pentosaceus或L. plantarum + P. pentosaceus + E. faecium处理的苜蓿青贮中aNDF和ADF含量降低，但本实验未发现类似结果。这一差异可能与附生菌群、环境或菌株来源有关。CELL处理的青贮NDF和ADF显著降低（p < 0.05），而各组间ADL无显著变化（表2），表明纤维素酶能有效降解结构性碳水化合物。该结果与Si等（2023）和Xiong等（2022）的发现一致。
【数据】CELL组NDF（第60天）：原文表2数据未完；ADL：各组间无显著差异
发酵特性与微生物群落
（以下内容基于原文摘要及讨论部分整理）
第1天，仅在微生物接种剂处理的青贮中检测到乳酸，伴随pH快速降至5.8以下（p < 0.05）。60天后，除BSM外的所有微生物接种剂均将pH降至4.5以下，并降低氨态氮含量（p < 0.05），同时促进Lactiplantibacillus或Pediococcus主导的群落，抑制Enterobacter和Serratia（p < 0.05）。功能预测表明赖氨酸降解途径下调、生物合成途径上调。KL处理效果最优：Lactiplantibacillus丰度最高（78.23%），气体损失、Chao1、Shannon指数和NH₃-N（占总氮4.35%）均较低。
【数据】KL组Lactiplantibacillus丰度：78.23%；KL组NH₃-N：4.35% TN；第1天pH：<5.8；60天后pH：<4.5（除BSM外）
纤维素酶处理相比对照组改善了发酵质量并显示最低纤维含量，但早期酸化较慢，导致60天后NH₃-N（占总氮6.46%）、气体损失和Enterobacter丰度（2.94%）较高（p < 0.05）。
【数据】CELL组NH₃-N：6.46% TN；CELL组Enterobacter丰度：2.94%
双乙酸钠走了一条截然不同的路径——第1天产生乙酸（占干物质1.32%）而非乳酸，将pH降至5.58。60天后，双乙酸钠处理组青贮保存良好：pH更低（4.28），NH₃-N更低（占总氮3.72%），气体损失更小，乳酸浓度更高（占干物质6.93%）（p < 0.05），且形成Lactiplantibacillus主导的细菌群落。
【数据】SDA第1天乙酸：1.32% DM；SDA第1天pH：5.58；SDA第60天pH：4.28；SDA第60天NH₃-N：3.72% TN；SDA第60天乳酸：6.93% DM
讨论与解读
本研究证实，所有添加剂均通过调节Lactiplantibacillus和Pediococcus的丰度、调控预测代谢途径并减少不良细菌来有效改善发酵质量。在微生物接种剂中，KL效果最佳——气体损失和NH₃-N含量最低，细菌群落简化，Lactiplantibacillus丰度最高；BSM在本研究中效果相对较弱。SDA展现出最低的pH、气体损失和NH₃-N浓度，以及较高的乳酸浓度和Lactiplantibacillus丰度；纤维素酶处理的效果则不如微生物接种剂和SDA。总体而言，KL和SDA在减少气体损失、降低pH和NH₃-N以及形成更简化的LAB主导微生物群落方面表现最为突出。这些发现强调不同添加剂通过不同的微生物介导机制调控发酵，为优化苜蓿青贮生产提供了实用指导。然而，本研究在受控袋装青贮规模下进行，需要在实际农场条件下开展更大规模的试验来验证这些发现的适用性。
编译者解读：本研究最值得关注之处在于揭示了"殊途同归"的发酵调控策略——KL接种剂走的是快速乳酸发酵的生物学路径，双乙酸钠则靠化学酸化直接抑制杂菌，两者最终都导向Lactiplantibacillus主导的简化菌群。从合成生物学视角看，KL三菌组合的协同碳流设计值得深挖：三种乳酸菌代谢通路一致，形成单向高效产酸的"代谢流水线"。双乙酸钠的即时酸化特性则为"化学-生物"协同策略提供了参照。不过，袋装青贮与生产实际仍有距离，菌群功能预测也需更严谨的代谢验证。
参考来源
Li Y, Wu L, Panyavong X, Kim J. Effects of microbial inoculants, cellulase, and sodium diacetate on fermentation profiles, bacterial succession, and predicted functional profiles of alfalfa silage. Bioresour Bioprocess. PMID: 42616286.
PMID: 42616286