来源：In Vitro Study of Probiotic Properties and Safety Aspects of Saccharomyces Yeast Strains Isolated from Traditional Fermented Food in Algeria.（Molecules）| 编译：DNA Lab Space
导读
阿尔及利亚传统发酵食品蕴藏着丰富的本土酵母资源。本研究从酸面团和腌制辣椒中分离并分子鉴定出15株酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），系统评估了其益生潜力与安全性。结果表明，所有菌株均能耐受人肠道环境胁迫，自聚集率24小时最高达98.80%，部分菌株表现出强抗氧化与植酸酶活性，且无溶血、明胶酶等毒力因子。5株菌展现出作为功能食品益生菌的开发前景。
研究背景
阿尔及利亚地处地中海沿岸，拥有丰富多样的传统食品加工技术。在许多农村地区，自然发酵仍是食品保藏的主要方式。这一过程不仅赋予食品理想的组织与感官特性，还确保微生物稳定性和安全性，并延长货架期。酵母作为自然发酵体系中的关键微生物，除参与风味形成外，还能降解毒素和抗营养因子，提升营养价值，并与乳酸菌、丝状真菌协同作用。其中，酿酒酵母是应用最广泛的酵母物种，在生物技术、生物修复、生物能源及医学益生领域均有重要价值。本研究旨在从阿尔及利亚传统发酵食品中分离并鉴定酿酒酵母菌株，评估其体外益生特性与安全性。
研究方法
4.1 食品采样
本研究调查了阿尔及利亚Laghouat地区的传统发酵食品中Saccharomyces spp.的多样性，样品包括软小麦粉和 barley 面粉制作的酸面团、腌制蔬菜（辣椒和橄榄）以及发酵牛奶（Lben）。酸面团发酵使用小麦粉和 barley 面粉，经三次温热生理盐水与面粉（v/w）的翻新循环[40]。腌制辣椒和橄榄按Benkerroum[1]描述的传统腌制程序保存在12%盐溶液中，Lben则通过牛奶室温自然发酵12至120小时获得[41]。
4.2 酵母菌分离与鉴定
从每种发酵产品中取三个样品，制备至10⁻⁴的生理盐水十进制稀释系列。取各稀释度100 µL涂布于添加0.01%氯霉素的YPD琼脂（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1.7%琼脂）[42]。平板于25°C培养72小时后，通过在同一培养基上反复划线纯化菌落。纯化菌株短期保存于4°C YPD肉汤中，长期保存于添加20%甘油（v/v）的YPD肉汤中，置于−80°C。
#### 4.2.1 形态学鉴定
将纯培养物划线接种于WL琼脂（Wallerstein Laboratories培养基）（Wallerstein Laboratories, Oxoid, Hampshire, UK），接种平板于25°C培养72小时，分析菌落形态、色素沉着和拓扑结构[33]。显微镜检查使用光学显微镜（Zeiss, Axiostar Plus, Oberkochen, Germany）于400×放大倍数观察过夜培养物，确认细胞形态、繁殖方式和细胞排列等形态学特征，参照Kurtzman等[7]的描述。
#### 4.2.2 糖发酵与同化试验
使用含0.5%酵母提取物、0.7%蛋白胨、0.06%溴甲酚紫并添加2%待测糖（葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖）的YP肉汤[43]测试酵母菌株的碳水化合物发酵与同化能力。在37°C厌氧条件下培养24小时后，通过Durham管中气体积累判断CO₂产生以确认糖发酵，同化作用则通过培养基颜色由紫色变为黄色来评估。
#### 4.2.3 分子鉴定
酵母菌株在液体YPG培养基中于30°C培养2天获得新鲜生物量，液氮预研磨样品随后以8000× g离心。DNA提取按照Gene Matrix Plant & Fungi DNA Purification Kit（Eurx® Ltd., Gdańsk, Poland）的操作规程进行。菌株鉴定基于大亚基rRNA（LSU）基因D1/D2结构域的扩增和Sanger法测序。聚合酶链式反应（PCR）使用FIREPol Master Mix（Solis Biodyne, Tartu, Estonia），引物参照Kurtzman和Robnett[44]：NL1（5′ GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′）和NL4（5′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′）（Genomed Ltd., Warsaw, Poland），扩增D1/D2结构域。扩增在热循环仪（T100TM Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA）中进行，条件为：初始DNA变性95°C 3分钟；30个循环包括95°C变性1分钟、58°C退火30秒、72°C延伸1分钟，最终延伸72°C 5分钟。PCR产物在1%（w/v）琼脂糖凝胶TAE缓冲液中电泳（Mini-Sub Cell GT和Power Pac Basic Bio-Rad, Hercules, CA, USA），使用Gel Doc XR+（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）可视化。扩增子纯化和测序由Genomed（Warsaw, Poland）完成。获得的序列和重叠群用DNA Sequence Assembler v5（Heracle BioSoft, Mioveni, Romania）组装，与NCBI GenBank数据库中28S rDNA区域D1/D2结构域已知序列通过BLAST算法比对，依据覆盖率和百分比同一性最高值鉴定菌株。系统发育分析在MEGA11中进行，基于28S rDNA区域D1/D2结构域序列，采用最大似然法，最佳拟合Kimura 2-parameter模型，离散伽马分布（+G），1000次bootstrap重复。参考菌株S. cerevisiae JCM 7255（LSU D1/D2序列登录号U44806）用于构建系统发育树[44,45]。
4.3 益生特性与安全性
#### 4.3.1 37°C生长试验
取1 mL YPD肉汤，接种10 µL新鲜培养物，于37°C培养2天。通过目视观察试管中生长情况判断菌株在此条件下的生长能力[33]。该条件下的生长能力被视为后续分析的首要筛选标准。
#### 4.3.2 胆盐与酸性pH耐受性
为评估Saccharomyces菌株的胃肠道胁迫耐受性，将过夜培养物接种于YPD肉汤（对照）、含0.3%胆盐（w/v）的YPD肉汤或用1 mol/L HCl调至pH 2.5的YPD肉汤中，使600 nm处光密度（OD600）约为0.1。试验在25 mL试管中进行，使用分光光度计（KLAB, OptizenTM pop, Daejeon, Republic of Korea）在37°C培养24小时内每4小时测定OD600[46]。
#### 4.3.3 自聚集试验
Saccharomyces菌株的自聚集能力按Hossain等[47]和Staniszewski等[33]的方法评价。新鲜培养物以5000× g离心10分钟，用0.85%生理盐水洗涤两次，重悬于同一生理盐水中。取3 mL细胞悬液涡旋10秒，于37°C培养2、4、24小时后，使用分光光度计（KLAB, OptizenTM pop, Daejeon, Republic of Korea）在OD600处静置测定吸光度。自聚集率按下式计算：自聚集率（%）= [1 − (At/A0)] × 100，其中At为2、4、24小时时的OD600，A0为零时OD600。
#### 4.3.4 细胞表面疏水性
细胞表面疏水性（CSH）按Staniszewski等[33]描述的溶剂法评价。取1 mL过夜培养物以5000× g离心10分钟，细胞沉淀用pH 7.0的PBS（磷酸钾缓冲液）洗涤两次，重悬于5 mL同缓冲液中。使用分光光度计（KLAB, OptizenTM pop, Daejeon, Republic of Korea）测定初始OD600。随后，向3 mL酵母悬液中加入1 mL二甲苯，涡旋2分钟促进与溶剂相互作用。混合物于37°C孵育30分钟使相分离。小心移除水相，测定萃取后的OD600。按Hossain等[47]的方法，CSH百分比按下式计算：CSH（%）= [1 − (A/A0)] × 100，其中A为萃取后水相OD600，A0为初始OD600。
研究结果
2.1 菌株筛选与鉴定
本研究从发酵食品样品中分离到53株酵母。基于其在WL培养基上的菌落特征（奶油色至绿色疣状外观、光滑不透明表面）和显微镜检查（卵圆形细胞、存在子囊孢子、多极出芽方式），以及乳糖发酵和同化能力的缺失，筛选出15株进行分子鉴定。如表1所示，基因型鉴定揭示所有从酸面团和腌制辣椒样品中获得的菌株均属于同一物种——Saccharomyces cerevisiae。基于大亚基rRNA基因D1/D2结构域序列的系统发育分析结果如图1所示。然而，从Lben和腌制橄榄样品中未分离到Saccharomyces菌株。
此外，除S. cerevisiae P12外，所有受试Saccharomyces cerevisiae菌株均表现出利用蔗糖、麦芽糖和葡萄糖的能力。半乳糖利用谱在菌株间差异较大。所有菌株均不能利用乳糖、阿拉伯糖和木糖。值得注意的是，S. cerevisiae P12仅能在葡萄糖上微弱生长，在其他受试糖上均不能生长（表2）。
2.2 酿酒酵母菌株的益生特性
#### 2.2.1 37°C生长
全部15株S. cerevisiae菌株均表现出在37°C下生长的能力，这是进行后续分析的基本筛选标准。
#### 2.2.2 胆盐与酸性pH耐受性
所有S. cerevisiae菌株在0.3%胆盐条件下均生长良好，菌株间略有差异，在37°C培养8小时后表现出增强的生长（图2a和表S1）。此外，受试菌株对pH 2.5表现出高度耐受性，持续至培养4小时，随后其生长显著增加，在37°C培养24小时后达到7.5 log CFU/mL的水平，除5株菌仅表现出轻微增长外（图2b和表S2）。研究结果表明，所有受试菌株均表现出良好的胃肠道胁迫耐受性，证明了它们在这些条件下存活的潜力，可作为潜在益生菌株使用。
#### 2.2.3 自聚集试验
在37°C培养2小时后，除S. cerevisiae T22（43.66%）和T27（59.66%）外，所有S. cerevisiae菌株的自聚集水平均高于60%。如图3所示，所有菌株的自聚集率随培养时间显著增加，在37°C培养24小时后超过93.90%的水平。S. cerevisiae T07记录到最高自聚集值（98.80%），而S. cerevisiae T22菌株显示出最低自聚集值（93.90%）。值得注意的是，所有菌株均表现出高自聚集能力，这可能有利于黏附上皮细胞并发挥其有益作用。
#### 2.2.4 细胞表面疏水性
本研究中，15株菌中有7株在二甲苯中表现出高疏水性值，范围为44.60%至58.90%，表明它们具有存活并黏附宿主肠道黏膜的潜力（图4）。其余菌株表现出低于40%的低疏水性水平，其中两株菌记录了最低疏水百分比：S. cerevisiae T05（23.10%）和S. cerevisiae O05（19.83%）。
#### 2.2.5 抗氧化活性
S. cerevisiae菌株间存在轻微差异，所有菌株通过DPPH自由基清除活性表现出显著的抗氧化潜力（图5）。抗氧化试验显示有效的DPPH还原百分比，S. cerevisiae P12和S. cerevisiae T27分别为24.29%至30.29%。此外，所有菌株均检测到过氧化氢酶阳性反应，表明它们具有减少氧化应激和预防退行性疾病和/或失调的潜力。
#### 2.2.6 抗菌活性
表3总结了S. cerevisiae菌株对致病菌替代菌株的抗菌活性。所有S. cerevisiae菌株对Listeria innocua均无任何抗菌活性。除S. cerevisiae T22和T26外，受试菌株对Staphylococcus aureus表现出弱活性，其中仅3株菌（S. cerevisiae O17、O08和O05）显示出中度抑制效果。对于Escherichia coli，4株S. cerevisiae菌株表现出中度抗菌活性，而其他菌株对该细菌表现出弱抑制，S. cerevisiae O17、T25和O08除外（无抑菌圈）。
#### 2.2.7 酶活性与安全性
在酶活性中，评估了植酸酶、蛋白酶、磷脂酶和明胶酶的产生（表4）。所有S. cerevisiae菌株均表现出强植酸酶活性，以形成大而清晰的透明圈为特征。这表明其具有强的植酸盐降解能力，可能提高矿物质吸收的生物利用度，并增强植物基发酵产品的营养价值。然而，受试菌株对蛋白酶和磷脂酶活性呈阴性反应，分别表现为菌落周围无透明圈和沉淀区域。
本研究中，所有Saccharomyces菌株均未检测到溶血活性，被认为是γ溶血，且无一菌株产生明胶酶，确认了其作为益生菌使用的安全性（表4）。此外，所有S. cerevisiae菌株均通过生物胺产生阴性证明其安全性，但S. cerevisiae T27除外，该菌株在菌落周围出现紫色晕圈，表明其具有产生一种或多种生物胺的能力。
讨论与解读
从阿尔及利亚传统发酵食品中分离的酵母菌株经D1/D2结构域分析鉴定为Saccharomyces cerevisiae[9,10,11,12]，该分析常用于子囊菌酵母的系统分类[13]。这一结果与Bazalová等[14]的发现一致——酸面团中S. cerevisiae是最常检出的酵母物种。Palla等[15]对托斯卡纳四家面包房的传统酸面团酵母种群研究显示，78株随机分离并分子鉴定的菌株中，四个酸面团中有三个仅检出S. cerevisiae。Vrancken等[16]的研究中，127份手工酸面团分离的酵母中68%被基因鉴定为S. cerevisiae。Bruner和Fox[17]也报道不同Saccharomyces物种能发酵蔗糖、麦芽糖和葡萄糖，但不发酵乳糖，这是Saccharomyces sensu stricto酵母的常见特征。
所有受试菌株均能在37°C生长，在0.3%（w/v）胆盐中良好存活，并对pH 2.5表现出高耐受性。对体温（37°C）具有高适应性的酵母菌株筛选被认为是益生菌筛选的关键标准[18]。
【数据】菌株：15株S. cerevisiae；温度：37°C；胆盐浓度：0.3%（w/v）；pH：2.5；培养时间：24h
编译者解读
本研究以"从传统发酵食品中筛选本土益生酵母"为主线，方法体系完整——从形态学初筛、糖发酵谱到D1/D2分子鉴定层层递进，益生评价涵盖胃肠道耐受、自聚集、疏水性、抗氧化及安全性指标，逻辑严谨。值得注意的是，植酸酶活性的普遍检出为植物基发酵食品的营养改良提供了新切入点。局限在于体外试验难以完全模拟体内复杂环境，且T27菌株的生物胺阳性提示筛选过程中安全性验证不可缺位。5株候选菌株为北非地区功能性食品开发提供了可专利化的本土微生物资源。
参考来源
Ararem A, Staniszewski A, Houicher A, Kordowska-Wiater M. In Vitro Study of Probiotic Properties and Safety Aspects of Saccharomyces Yeast Strains Isolated from Traditional Fermented Food in Algeria. Molecules. PMID: 42513124.
PMID: 42513124