来源：Transcriptomic and metabolomic analyses of systemic resistance against tomato bacterial wilt induced by lipopeptide from Bacillus pumilus LP-823.（BMC Microbiol）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：CC BY-NC
导读
由茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的青枯病严重威胁全球番茄生产。本研究从甘肃油菜根际土壤中分离的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）LP-823菌株中鉴定出一系列新型脂肽——C14至C19的surfactin同系物，其中C17–C19结构在该物种中属首次报道。温室盆栽试验表明，该脂肽虽无直接抑菌活性，却可通过激活番茄的系统诱导抗性（ISR）显著抑制青枯病发生，使发病延迟4天，最终发病率和病情指数分别降低29.63%和36.19%。转录组与代谢组联合分析揭示了其调控活性氧稳态、ABA信号通路及苯丙烷代谢的多层次防御网络。
研究背景
茄科劳尔氏菌是一种毁灭性的土传病原菌，寄主范围广泛，可侵染54个科450余种植物，包括番茄、烟草和马铃薯等重要经济作物。其引起的青枯病是全球范围内分布最广、经济损失最严重的土传病害之一。在番茄生产中，严重发病田块田间发病率可超过80%，导致产量完全损失，成为栽培的主要限制因素。由于常规农艺措施和化学防治往往效果不佳，开发可持续且环境友好的防治策略迫在眉睫，生物防治——利用自然拮抗菌及其生物活性代谢产物——因此受到广泛关注。
芽孢杆菌（Bacillus）是常用的生防菌，其分泌的多样化脂肽具有双重作用模式：直接拮抗植物病原菌或诱导寄主植物产生系统诱导抗性（ISR）。surfactin、fengycin和iturin等主要脂肽家族被认为对病害抑制至关重要。值得注意的是，芽孢杆菌诱导植物防御的能力与surfactin的产生密切相关——例如，来自枯草芽孢杆菌的surfactin可增强水稻的抗性。
研究方法
菌株与培养基
LP-823菌株分离自中国甘肃省油菜根际土壤，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC No. M2025925）。该菌株最初被分类为Bacillus safensis，但后续全基因组序列分析确认其为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。本研究所用致病菌株茄科劳尔氏菌FJAT-91分离自表现青枯病症状的番茄植株，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC No. 10692）。LP-823菌株在LB液体培养基中、30°C、170 rpm振荡培养48小时。FJAT-91菌株常规培养于三苯基氯化四氮唑（TTC）培养基上，30°C培养48小时；随后挑取单菌落悬浮于NB培养基中。所有培养基均购自北京奥博星生物技术有限公司。
【数据】菌株：Bacillus pumilus LP-823（CCTCC No. M2025925）、Ralstonia solanacearum FJAT-91（CGMCC No. 10692）；培养基：LB、TTC、NB；温度：30°C；转速：170 rpm；时间：48h
LP-823菌株的鉴定
提取LP-823菌株基因组DNA，在Illumina平台上进行全基因组测序。将基因组序列提交至EzBioCloud数据库进行同源性比对和平均核苷酸一致性（ANI）分析，以确定精确的分类学地位。
用于系统发育分析时，从基因组中提取LP-823菌株的16S rRNA基因序列。基于16S rRNA基因序列，使用MEGA 6.0软件以邻接法（NJ）构建系统发育树，分析涉及LP-823菌株序列及从数据库获得的20个最相近模式菌株序列。
为进一步明确系统发育位置，还基于31个管家基因（dnaG、frr、infC、nusA、pgk、pyrG、rplA、rplB、rplC、rplD、rplE、rplF、rplK、rplL、rplM、rplN、rplP、rplS、rplT、rpmA、rpoB、rpsB、rpsC、rpsE、rpsI、rpsJ、rpsK、rpsM、rpsS、smpB和tsf）的串联序列，在MEGA 6.0中以邻接法构建基于基因组的系统发育树，分析包含LP-823菌株和基于全基因组比较的19个最相近模式菌株。
【数据】测序平台：Illumina；分析软件：MEGA 6.0；方法：邻接法（NJ）；16S rRNA分析菌株数：20个模式菌株；管家基因数：31个
LP-823脂肽的分离与LC-QTOF/MS组成鉴定
LP-823脂肽的分离与组成鉴定在前期研究基础上略作修改后进行。LP-823菌株在500 mL液体培养基中、30°C、180 rpm振荡培养48小时。培养液离心（10,000 rpm，10分钟），上清液酸化至pH ≤ 2.0以获得粗脂肽。色谱分离采用Agilent Zorbax Extend-C18色谱柱（150 × 2.1 mm，3.5 µm），流速0.3 mL/min。流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为甲醇。梯度洗脱程序如下：0–60分钟，B相从60%线性梯度升至100%；100% B保持5分钟。ESI–MS/MS分析在正离子和负离子两种模式下进行。干燥气温度设为300°C，流速5 L/min，雾化器压力30 psig。碎裂电压200 V，碰撞能量100 V，skimmer电压65 V。扫描范围m/z 100–3000。纯化的surfactin（Sigma-Aldrich）作为标准品。
【数据】培养体积：500 mL；转速：180 rpm；时间：48h；离心：10,000 rpm、10 min；pH ≤ 2.0；色谱柱：Agilent Zorbax Extend-C18（150 × 2.1 mm，3.5 µm）；流速：0.3 mL/min；梯度：0–60 min 60–100% B，100% B保持5 min；干燥气温度：300°C；流速：5 L/min；雾化器压力：30 psig；碎裂电压：200 V；碰撞能量：100 V；skimmer电压：65 V；扫描范围：m/z 100–3000
抗菌活性测定
采用滤纸片琼脂扩散法评价LP-823脂肽对茄科劳尔氏菌FJAT-91的抗菌活性。病原菌在NB培养基中、30°C培养48小时，然后以10⁷ CFU/mL的浓度悬浮于半固体NA中，倒入铺有NA的平板上。凝固后，打孔器打出直径7 mm的孔，分别加入100 µL浓度为5、15和20 mg/mL的LP-823脂肽溶液。平板在30°C培养48小时，测量抑菌圈。实验设三次重复。
【数据】方法：滤纸片琼脂扩散法；病原菌浓度：10⁷ CFU/mL；孔径：7 mm；脂肽用量：100 µL；脂肽浓度：5、15、20 mg/mL；培养：30°C、48h；重复：3次
LP-823脂肽对番茄青枯病的生防效果
本研究所用番茄品种为‘寿禾粉冠’，种子生产经营许可证号D（鲁潍寿）0014（2017）。选取五至六叶期、长势一致的植株，随机分为两组：对照组和脂肽处理组。每株种植于商品化无土栽培基质中（有机质 > 60%，EC 0.8–1.2，孔隙度 > 60%，pH 5.5–6.5；广州盛盛农业有限公司）。所有实验在温室受控条件下进行：30 ± 2°C，相对湿度80%，光周期12小时光照/12小时黑暗。处理组植株接受25 mL浓度为0.2 mg/mL的B. pumilus LP-823脂肽溶液灌根处理。处理后48小时，所有植株通过灌根方式接种茄科劳尔氏菌FJAT-91进行挑战接种，每株施加25 mL浓度为1.0 × 10⁷ CFU/mL的菌悬液。接种体制备方法为：先在含TTC的营养琼脂平板上培养病原菌48小时，然后在营养肉汤中、30°C、180 rpm振荡培养24小时，最后调整至目标浓度。青枯病典型症状按0至4级病情指数（di）进行评价。发病率、病情严重指数和生防效果按以下公式计算：
发病率（DIR，%）=（发病植株数/调查植株总数）× 100
病情严重指数（DSI，%）= [Σ（各级病株数 × di）/（处理总株数 × 最高级di）] × 100
生防效果（%）= [（对照组DSI − 处理组DSI）/ 对照组DSI] × 100
【数据】番茄品种：‘寿禾粉冠’；脂肽浓度：0.2 mg/mL；灌根量：25 mL/株；挑战接种浓度：1.0 × 10⁷ CFU/mL；接种量：25 mL/株；温室条件：30 ± 2°C、80% RH、12h/12h光暗；病情分级：0–4级
LP-823脂肽诱导番茄防御相关酶活性测定
在LP-823脂肽处理后0、12、24、36和48小时采集番茄植株样品。取样组织立即用液氮冷冻，−80°C保存待分析。
PAL活性测定：取约1.0 g植物组织，在1 mL冰预冷提取缓冲液中匀浆。匀浆液在12,000 × g、4°C离心10分钟，收集上清液置于冰上备用。PAL活性使用PAL检测试剂盒（江苏艾迪斯生物科技有限公司，货号ADS-W-KN005-48，微板法）测定，用微板阅读器在290 nm处测量吸光度。
PPO活性测定：取约0.5 g组织，在1 mL冰预冷专用测定缓冲液中匀浆。匀浆液在12,000 × g、4°C离心15分钟，收集上清液进行分析。PPO活性使用PPO检测试剂盒（江苏艾迪斯生物科技有限公司，货号ADS-F-YH005-48，分光光度法）定量。
【数据】取样时间点：0、12、24、36、48h；PAL样品量：1.0 g组织/1 mL缓冲液；离心：12,000 × g、4°C、10 min；PAL检测波长：290 nm；PPO样品量：0.5 g组织/1 mL缓冲液；离心：12,000 × g、4°C、15 min；试剂盒：ADS-W-KN005-48（PAL）、ADS-F-YH005-48（PPO）
研究结果
LP-823菌株的鉴定
LP-823菌株基因组全长3,631,276 bp，染色体DNA G+C含量为41.88%。采用多相分类方法进行菌株鉴定。首先，16S rRNA基因序列分析显示LP-823与B. pumilus具有100%的一致性（图1A）。此外，管家基因分析支持了这一归属，与同一参考菌株的序列一致性为99.4%（图1B）。LP-823菌株与B. licheniformis ATCC 14580T、B. siamensis KCTC 13613T、B. amyloliquefaciens DSM7T、B. altitudinis DSM 21631T、B. xiamenensis HYC-10T、B. zhangzhouensis DW5-4T、B. safensis FUA2117T和B. pumilus DSM27T的平均核苷酸一致性（ANI）值分别为70.62%、70.46%、70.98%、89.30%、89.68%、91.48%、92.40%和95.79%。最后一个菌株的ANI值 > 95%。这些结果共同确认LP-823菌株为B. pumilus物种的成员。
图1 LP-823菌株及相关菌株的系统发育树。A 16S rRNA基因系统发育树；B 管家基因系统发育树
【数据】基因组大小：3,631,276 bp；G+C含量：41.88%；16S rRNA一致性：100%；管家基因一致性：99.4%；ANI值：70.62%–95.79%（与B. pumilus DSM27T为95.79%）
短小芽孢杆菌LP-823脂肽的鉴定
通过LC-Q/TOF–MS/MS分析B. pumilus LP-823的脂肽组成（图2，表1）。每种脂肽的组分通过将其精确质量和MS/MS碎裂模式与相关文献中的数据进行比对来推定注释。
图2 Bacillus pumilus LP-823脂肽的总离子流谱图
表1 LC-QTOF-MS/MS鉴定Bacillus pumilus LP-823脂肽
| 碎片 | 保留时间（min） | MS m/z [M+Na]⁺ | MS² m/z [M+Na]⁺ | 鉴定化合物 |
|------|----------------|-----------------|------------------|-----------|
| 1 | 52.23 | 1044 | 931.6, 818.5, 728.5, 657.5, 594.3, 481.3, 391.3 | C14 surfactin |
| 2 | 53.46 | 1058 | 945.6, 832.5, 742.5, 671.5, 594.4, 481.3, 391.3 | C15 surfactin |
| 3 | 54.50 | 1072 | 959.6, 846.6, 756.5, 685.5, 594.5, 481.3, 391.3 | C16 surfactin |
| 4 | 56.62 | 1086 | 973.6, 860.5, 770.5, 699.5, 594.5, 481.3, 391.3 | C17 surfactin |
| 5 | 57.45 | 1100 | 987.6, 874.5, 784.5, 713.5, 594.5, 481.3, 391.3 | C18 surfactin |
| 6 | 58.80 | 1114 | 1001.6, 888.5, 798.5, 594.5, 481.3, 391.3 | C19 surfactin |
仅检测到一类环状脂肽，即surfactin（保留时间52.23–58.80分钟）。B. pumilus LP-823脂肽的MS和MS²谱数据及鉴定结果汇总于表1。结果表明脂肽由C14–C19 surfactin组成。据作者所知，具有相同C17–C19 surfactin结构的这一系列化合物此前未在B. pumilus中报道过。
【数据】脂肽类型：surfactin；保留时间：52.23–58.80 min；脂肪酸链：C14–C19；m/z范围：[M+Na]⁺ 1044–1114
LP-823脂肽对茄科劳尔氏菌的抗菌活性
评价了LP-823脂肽对茄科劳尔氏菌FJAT-91的抗菌活性，脂肽对病原菌无直接抗菌活性——在5、15和20 mg/mL浓度下均未观察到抑菌圈（图3）。
图3 LP-823脂肽对茄科劳尔氏菌的抗菌活性。A 5 mg/mL LP-823脂肽；B 15 mg/mL LP-823脂肽；C 20 mg/mL LP-823脂肽；D CK（无菌水）
【数据】脂肽浓度：5、15、20 mg/mL；抑菌圈：无（所有浓度）
LP-823脂肽对番茄青枯病的生防效果
通过温室盆栽试验评价了B. pumilus LP-823脂肽对番茄青枯病的生防效果（图4A和B）。对照植株在接种后8天出现萎蔫症状，而LP-823处理植株推迟至11天才出现症状；至接种后20天，脂肽处理植株的最终发病率为52.78%，病情指数为46.53%，相对于对照分别降低了29.63%和36.19%（图4C和D）。
图4 Bacillus pumilus LP-823脂肽在盆栽试验中对番茄青枯病的生防效果。A LP-823脂肽处理；B 对照植株；C 发病率（DIR，%）；D 病情严重指数（DSI，%）
【数据】对照发病时间：8天；处理发病时间：11天；最终发病率：52.78%（降低29.63%）；病情指数：46.53%（降低36.19%）；观察时间点：接种后20天
LP-823脂肽诱导番茄防御相关酶活性
为阐明B. pumilus LP-823脂肽对番茄青枯病生防活性的机制，首先确认脂肽对病原菌无直接抗菌活性。因此，研究聚焦于其激活番茄寄主抗性的潜在作用。在LP-823脂肽处理后0、12、24、36和48小时采集番茄植株样品。处理显著提高了四种防御相关酶的活性：苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）。然而，不同酶之间活性的增幅和时间模式存在显著差异。
LP-823处理植株的PAL活性在处理后24和36小时显著高于对照组（p < 0.0001）。活性在36小时达到峰值，值为953.43 U/g FW，是对照组的5.7倍（图5A）。类似地，LP-823处理植株的PPO活性在处理后36和48小时显著高于对照组（p < 0.0001）。PPO活性最高值出现在36小时，达到367.62 U/g FW，较对照水平增加6.8倍（图5B）。
图5 LP-823脂肽诱导番茄防御酶活性。A 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性；B 多酚氧化酶（PPO）活性；C 超氧化物歧化酶（SOD）活性；D 过氧化物酶（POD）活性。注：显著性水平标示如下，**（p < 0.0001），*（p < 0.001），**（p < 0.01），ns，不显著（p ≥ 0.05）
形成鲜明对比的是，SOD和POD活性在脂肽处理后12小时达到峰值（分别增加3.9%和14.8%），随后逐渐下降（图5C和D）。两种酶均在36小时达到最低水平（SOD：45.48 U/g FW，为0小时的0.70倍；POD：78.44 U/g FW，为0小时的0.53倍）。值得注意的是，尽管有所下降，48小时时活性部分恢复至对照的0.88倍（SOD）和0.72倍（POD），表明整个48小时期间总的变化倍数相对有限。
总体而言，与PAL和PPO的强劲多倍激活不同，SOD和POD活性的波动在整个48小时期间保持在较窄范围内（所有变化倍数 < 1.5倍）。
【数据】PAL峰值：953.43 U/g FW（36h，5.7倍，p < 0.0001）；PPO峰值：367.62 U/g FW（36h，6.8倍，p < 0.0001）；SOD峰值：12h增加3.9%，36h最低45.48 U/g FW（0.70倍）；POD峰值：12h增加14.8%，36h最低78.44 U/g FW（0.53倍）；SOD/POD变化范围：< 1.5倍
番茄对LP-823脂肽胁迫反应的转录组分析
本研究获得的测序数据质量高，超过96.6%的碱基达到Q30分值，确认了数据用于后续分析的可靠性。转录组分析显示，与对照组相比，LP-823脂肽处理的番茄植株共出现6,219个差异表达基因（DEGs），包括2,396个上调基因和3,360个下调基因（图6A）。图中清晰显示下调基因数量多于上调基因。
图6 LP-823脂肽诱导响应的转录组分析及验证。A DEGs火山图。红色：上调（log2FC > 1，p < 0.05，2,396个基因）；绿色：下调（log2FC < −1，p < 0.05，3,360个基因）；蓝色：不显著；B DEGs的GO富集分析。柱越长表示P值越小，统计显著性越高；C DEGs的KEGG富集分析。点颜色代表p值（越红 = p越小，显著性越高）；点大小代表基因数（越大 = 基因越多）；D 前50个DEGs的热图。列：样本；行：基因。颜色：红色 = 高表达，绿色 = 低表达；E 选定DEGs的qRT-PCR验证。11个基因（THI012、WLIM1、GAD2、ABI2、AOX1a、WRKY75、ZEP、THI032、PIP2-1、CAT2和Ferredoxin）在CK与LP-823中的相对表达水平（以ACT51为内参；均值 ± SD，n = 5）。显著性水平标示如下，**（p < 0.0001），*（p < 0.001），**（p < 0.01），ns，不显著（p ≥ 0.05）。qRT-PCR结果与转录组数据一致
【数据】测序质量：> 96.6%碱基达到Q30；DEGs总数：6,219（上调2,396，下调3,360）；筛选阈值：log2FC > 1或< −1，p < 0.05
讨论与解读
植物拥有可被特定激发子激活的先天免疫系统。与依赖病原体的系统获得抗性（SAR）不同，ISR由有益微生物或非生物刺激触发，为病害管理提供了可持续策略。在微生物激发子中，surfactin已被广泛证明是植物防御反应的有效诱导剂，能在多种植物中触发ISR。本研究发现B. pumilus LP-823的脂肽可激活番茄对茄科劳尔氏菌的ISR。Cawoy等人的研究表明surfactin具有浓度依赖性的防御诱导作用；本研究结果进一步表明，即使在低浓度下，LP-823产生的C14–C19 surfactin同系物也能引发强效的系统抗性。与番茄、水稻和烟草中的前期报道一致，LP-823脂肽处理显著抑制了病害发展，延迟症状出现4天，最终发病率和病情指数分别降低29.63%和36.19%。同时，脂肽在体外对茄科劳尔氏菌无直接抗菌活性，但处理后36小时PAL（5.7倍）和PPO（6.8倍）显著升高。这些综合观察结果——无直接抗菌作用、系统性保护和经典ISR标志物的激活——为LP-823脂肽作为番茄青枯病可持续管理的有效激发子提供了有力证据。
编译者解读
本研究的一个突出亮点在于：脂肽虽无直接杀菌活性，却通过激活寄主防御实现了可观的生防效果——这为筛选生防因子提供了重要启示，即"无抗菌活性"不应被排除在候选之外。C17–C19 surfactin同系物的发现拓展了该物种脂肽结构多样性认知。从合成生物学应用角度看，LP-823菌株及其脂肽产物可作为模式底盘，通过异源表达或结构修饰优化激发子活性，进一步提高ISR触发效率。不过，田间复杂环境下的稳定性与效果持续性仍需验证，脂肽诱导防御的代谢组层面机制也有待深入挖掘。
PMID: 42288720